edition des genomes de mammiferes pdf.pptx
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Edi$on des génomes de mammifères Module Biologie Expérimentale Animale et Modélisa?on Prédic?ve Responsable: XX Geneviève Jolivet 9 mars 2016 Production of genetically modified vertebrates from early 80’s Transgenesis via transposons in mouse Transgenesis via transposons in medaka 1980 82 Giant mouse 85 86 87 88 89 90 91 Rabbit Pig Sheep fish Transgenic mouse 94 96 97 98 99 00 01 02 03 04 05 08 09 10 11 12 13 14 15 16 Transgenic rats Transgenic ca@le Transposons in pigs Len$viral transgenesis in mouse, sheep, pig Len$viral transgenesis in rabbit Transposi$on in rabbits .02 Produire des organismes géné?quement modifiés Quelles modifica?ons? Mutagénèse C A A A T T G T ★ C A A A T T A T Addi?on de gène Pour faire quoi? Supprimer l’expression d’un gène Modifier l’expression d’un gène Provoquer l’expression d’un gène nouveau .03 Produire des organismes géné?quement modifiés Quelles modifica?ons? Agents chimiques C A A A T T G T Irradia?on Mutagénèse ★ C A A A T T A T Addi?on de gène Pour faire quoi? Supprimer l’expression d’un gène Modifier l’expression d’un gène Provoquer l’expression d’un gène nouveau .04 Produire des organismes géné?quement modifiés… …En ciblant la modifica?on géné?que .05 Produire des organismes géné?quement modifiés… …En ciblant la modifica?on géné?que U?liser la recombinaison homologue Gène d’intérêt + Site d’intégra?on Gène d’intérêt Mais fréquence extrêmement faible, donc u?lisa?on limitée .06 Production of genetically modified vertebrates from early 80’s Gene replacement in mouse (homologous recombina$on in ES cells) 1980 82 Giant mouse Transgenesis via transposons in medaka 85 86 87 88 89 90 91 Rabbit Pig Sheep fish Transgenic mouse Transgenesis via transposons in mouse 94 96 97 98 99 00 01 02 03 04 05 08 09 10 11 12 13 14 15 16 Transgenic rats Transgenic ca@le Transposons in pigs Len$viral transgenesis in mouse, sheep, pig Len$viral transgenesis in rabbit Transposi$on in rabbits .07 embryons stade blastocyste Cellules ES Animal F0 « chimère » + modifica$on géné$que X + Par exemple, recombinaison homologue sélec?onnée par « gene targe?ng » F1 : 1 allèle porte la muta$on; l’autre allèle est normal F2 : possibilité d’obtenir des animaux avec les 2 allèles mutés .08 Production of genetically modified vertebrates from early 80’s Gene replacement in mouse (homologous recombina$on in ES cells) Transgenesis via transposons in mouse Transgenesis via transposons in medaka Cloning cloning in sheep, ca@le, pig, mouse, rat in rabbit 1980 82 Giant mouse 85 86 87 88 89 90 91 Rabbit Pig Sheep fish Transgenic mouse 94 96 97 98 99 00 01 02 03 04 05 Transgenic rats Transgenic ca@le Len$viral transgenesis in mouse, sheep, pig 08 09 10 11 12 13 14 15 16 Transgenic chicken via Rat ES embryonic cells germ cells Transposons in pigs Transgenic rat via ES cells Len$viral transgenesis in rabbit Transposi$on in rabbits .09 Donneur d’ovocytes Clonage par transfert de noyau (soma?c cell nuclear transfert = SCNT) Donneur de noyaux Intérêt du clonage? Dolly 1996 Donneur d’ovocytes Donneur de noyaux Gene targe?ng Intérêt du clonage? + construc?on de répara?on Gène d’intérêt Répara?on avec erreurs (non homologous end joining) Gène d’intérêt Recombinaison homologue .012 + construc?on de répara?on Gène d’intérêt Répara?on avec erreurs (non homologous end joining) Gène d’intérêt Recombinaison homologue .013 Comment utiliser ces enzymes? Sur des cellules en culture…. Introduction dans des cellules en culture (transfection d’un plasmide pour exprimer la nucléase, ou de l’ARNm) Modification génétique des cellules transfectées Thérapie génique cellulaire Transfection « in vivo » pour corriger le fonctionnement d’un gène dans un tissu …ou sur des embryons Introduc?on de nucléase ciblée dans l’embryon unicellulaire Femelle « donneuse » Embryon unicellulaire Femelle « receveuse » Modification ciblée du génome de l’animal Meganuclease TALE Nuclease T A G G G A T A A C A G G G T A A T A T C C C T A T T G T C C C A T T A Zinc Finger Nuclease CRISPR/ Cas9 (clustered regularly interspaced short palindromic repeat) .016 Production of genetically modified vertebrates from early 80’s Gene replacement in mouse (homologous recombina$on in ES cells) Transgenesis via transposons in medaka ZFN ko in rabbits TALEN ZFN in Zebrafish, in rats and mice Ko and gene replacement Transgenesis via transposons in mouse Cloning cloning in sheep, ca@le, pig, mouse, rat in rabbit 1980 82 Giant mouse 85 86 87 88 89 90 91 Rabbit Pig Sheep fish Transgenic mouse 94 96 97 98 99 00 01 02 03 04 05 Transgenic rats Transgenic ca@le Len$viral transgenesis in mouse, sheep, pig ZFN, TALEN, CRISPR edi$ng 08 09 10 11 12 13 14 15 16 Transgenic chicken via Rat ES embryonic cells germ cells Transposons in pigs Transgenic rat via ES cells Len$viral transgenesis in rabbit Transposi$on in rabbits .017 Les meganucleases Enzymes naturelles présentes dans les mitochondries et les chloroplastes de certains organismes eucaryotes unicellulaires (levures, algues) et chez certaines archéobactéries Pas de site dans les génomes des eucaryotes pluricellulaires (plantes, animaux) Meganuclease I-­‐SceI T A G G G A T A A A T C C C C A G G G T A A T T A T T G T C C C A T T A découverte dans des mitochondries de la levure de boulanger Saccharomyces cerevisiae .018 Les méganucléases, ou?ls d’ingénierie des génomes Smith et al, 2006 Grizot et al, 2010 .019 Développement de l’ingéniérie des meganucleases Objec?f : thérapie génique cellulaire Correc?on de gènes : syndrome d’immunodéficience sévère (X-­‐SCID). Correc?on du gène IL2RG Élimina?on du virus de l’herpes (HSV-­‐1) dans des cellules en culture (cornée) Système performant, spécifique, mais très lourd à meire en œuvre. La produc?on de la méganucléase qui répond au besoin de l’u?lisateur ne peut se faire qu’en meiant en œuvre des techniques de biologie moléculaire complexes, longues. Pas d’essai significa?f dans l’embryon de mammifère. Travaux effectués essen?ellement par la société Cellec?s (France). .020 Zinc Finger Consor?um (consor?um OPEN) Sangamo, Sigma .021 Zinc Finger Nuclease L’unité de reconnaissance = un motif protéique en doigt de gant, reconnaissance de trois nucléotides… GATCCTGCATGCTAACGACTAGCAGTACAGTACAGATAAACG CTAGGACGTACGATTGCTGATCGTCATGTCATGTCTATTTGC Chaque mo?f est un mo?f protéique caractéris?que de sites de fixa?on à l’ADN (dans certains facteurs de transcrip?on par exemple) .022 FokI GATCCTGCATGCTAACGACTAGCAGTACAGTACAGATAAACG CTAGGACGTACGATTGCTGATCGTCATGTCATGTCTATTTGC FokI Il faut aiendre 2007 pour que les travaux de 2 équipes arrivent à produire des ZFN beaucoup plus spécifiques suite à l’associa?on de 2 sous-­‐unités et à la modifica?on des sous unités FokI. .023 Les résultats .024 Chaque mo?f est un mo?f protéique iden?fié dans la machinerie cellulaire de bactéries du genre Xanthomonas parasites de plantes On parle de « Genome engineering » .025 TALENs versus ZFN TALENs plus faciles à construire? Efficacité meilleure? Ou pas? Off-­‐targe?ng? Certains mo?fs ZFN sont peu efficaces….. U?lisa?on pour des objec?fs similaires : Thérapie génique cellulaire Génomique fonc?onnelle chez les espèces où il n’y a pas de cellules ES 2010 : on commence à parler de « gene edi?ng » par opposi?on à « gene targe?ng » qu’on réserve plutôt à l’ensemble des technologies mises en œuvre par les travaux de Capecchi et al sur le KO de gène provoqué par l’introduc?on ciblée d’un transgène assor?e d’une sélec?on. .026 CRISPR/ Cas9 (clustered regularly interspaced short palindromic repeat) .027 Lander, 2016 .028 Doudna et Charpen?er, 2014 .029 Genome edi?ng Phénomène naturel, par lequel la séquence d’un ARN est modifiée après la transcrip?on du mRNA. Interven?on d’un complexe enzyma?que (l’editosome), et d’un ARN « complémentaire » de la région visée par la muta?on appelé le « guide RNA » Edi?ng par APOBEC-­‐1. Spécifique de l’intes?n. APOB100 APOB48 C A A A T T G T C A A A T T A T ★ D’où l’u?lisa?on du terme « edi?ng », traduit en français par « édi?on de génome » .030 Introduc?on d’un mélange d’ARN ou de protéine Cas9 et de sgRNA Embryon unicellulaire, ou cellule en culture, ou in vivo mRNA cas9 sgRNA Protéine Cas9 ADN cible Introduc?on d’un mélange d’ARN ou de protéine Cas9 et de sgRNA Embryon unicellulaire, ou cellule en culture, ou in vivo Réparation avec mutation Délétion ou insertion L’u?lisa?on des technologies de « genome edi?ng » depuis les 10 dernières années…. Cellules : thérapie génique, cellules ES Organismes en?ers Souris Autres espèces de Mammifères Plus de 300 modèles nouveaux produits chez des espèces animales de rente au cours des 5 dernières années Donneurs d’organes (suppression de gènes de protéines de surface et de gènes de glycosyla?on); Bioréacteurs; Modèles de maladies; améliora?on des caractères agronomiques; introduc?on de gènes de résistance aux maladies…… .033 Les autres u?lisa?ons possibles de ceie technologie: « epigenome edi?ng » .034 Les avantages Introgression de caractères nouveaux, de façon bien plus précise que par le biais de la sélec?on géné?que classique Évite la co-­‐sélec?on de caractères délétères Permet l’élimina?on de caractères délétères Permet l’introgression de plusieurs caractères en une seule manipula?on expérimentale .035 Des avantages, mais aussi des inconvénients, difficultés….. Chez le porc, u?lisa?on du clonage par transfert de noyau de cellules soma?ques après modifica?on géné?que des cellules Efficacité faible : en moyenne, pour recons?tuer un porc par clonage, il faut manipuler 130 embryons. Ce qui nécessite un circuit efficace de récupéra?on d’embryons ; Variabilité importante de l’efficacité du clonage selon le type de cellule employé. L’efficacité de la recombinaison homologue est encore faible .036 Des avantages, mais aussi des inconvénients, difficultés….. Le mosaïcisme du fondateur: le phénomène de modifica?on géné?que dépend de la persistance du mécanisme à l’origine de la muta?on. Le fondateur est donc un animal complexe, plusieurs muta?ons, pas toutes transmises à la descendance. Aien?on dans le cas de cellules en culture, chaque cellule porte une modifica?on différente de celle de sa voisine. Nécessité de cloner. Les muta?ons non désirées : phénomène dit « off-­‐targe$ng » .037 Des avantages, mais aussi des inconvénients, difficultés….. Le mosaïcisme du fondateur: le phénomène de modifica?on géné?que dépend de la persistance du mécanisme à l’origine de la muta?on. Le fondateur est donc un animal complexe, plusieurs muta?ons, pas toutes transmises à la descendance. Aien?on dans le cas de cellules en culture, chaque cellule porte une s e l r inceloner. im l modifica?on différente de celle de sa voisine. Nécessité d e é ’ d é irés ilit Possib ents non dés événem roduc?on ep par la r méiose) ( sexuée Les muta?ons non désirées : phénomène dit « off-­‐targe$ng » .038 Pour conclure Technologie largement employée dans le domaine académique chez de nombreuses espèces animales ou végétales Quelle accepta?on par le public, quelle régula?on? Régula?on basée sur la qualité du produit, et pas sur la façon de l’obtenir Organismes géné?quement modifiés (OGM) versus organismes géné?quement édités (OGE) Déclara?on des organismes Accepta?on de l’OGE si le variant existe déjà dans d’autres espèces/races Proposi?ons en cours….. .039 5 Points de régula?on proposés (Huang et al, 2016) 1. Minimize the risk of escape of GECs 2. Demonstrate the absence of foreign sequences, 3. Document DNA sequence changes at the target sites. 4. document upon unintended events 5. Include documenta?on of the above four points for cul?var registra?on. The US Department of Agriculture does not consider GECs to be GM organisms as long as GECs do not contain DNA from plant pests. Similarly, German authori?es recently confirmed that genome-­‐edited canola generated with an older oligonucleo?de method does not cons?tute a GM organism, as it is not dis?nguishable from the products of conven?onal mutagenesis. We urge other countries to follow suit. NATURE GENETICS | VOLUME 48 | NUMBER 2 | FEBRUARY 2016 ;109 .040
