Le sujet proposé a un caractère pluridisciplinaire

BTS BIOANALYSES ET CONTROLES
TECHNIQUES DE MICROBIOLOGIE
1e année - TP n°3
AFBB
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BREVET DE TECHNICIEN SUPERIEUR
BIOANALYSES ET CONTROLES
Techniques de microbiologie
Au cours de l’épreuve, le jury appréciera les qualités d’organisation, le respect des règles d’hygiène
et de sécurité en laboratoire.
Pour une bonne réalisation de l’épreuve, une gestion optimale du temps imparti est nécessaire en
fonction des temps d’incubation. Le candidat prendra soin de bien lire l’ensemble du sujet avant de
commencer les manipulations.
Tous les milieux ensemencés (boites, tubes) doivent être identifiés avec vos initiales inscrites au
feutre indélébile.
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TECHNIQUES DE MICROBIOLOGIE
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Métabolismes glucidique et protéique des bactéries
1. Etude des caractères morphologiques et biochimiques d’une bactérie
1.1.Réalisation d’une suspension bactérienne en eau physiologique
Réaliser une suspension bactérienne « S » en eau physiologique stérile (5 mL dans un tube à essais), à
partir d’une culture fournie sur gélose nutritive inclinée notée.
1.2.Vérification de la pureté de la souche en suspension
A partir de la suspension « S », réaliser un isolement sur gélose trypticase-soja (GTS).
Incuber 24 heures à 37°C.
1.3.Recherche de la mobilité bactérienne
Réaliser un montage entre lame et lamelle de la suspension « S » et l’observer au microscope (objectif
x40).
1.4.Observation microscopique d’un frottis coloré par la méthode de Gram
Réaliser sur une lame un frottis avec la suspension « S ».
NB : il est important de séparer les étapes de séchage et de fixation du frottis.
Effectuer la coloration de Gram.
Observer avec l’objectif x100 à immersion.
1.5.Test enzymatique rapide : catalase ou oxydase
1.5.1. Catalase (test enzymatique effectué sur des bactéries Gram +)
Rechercher la présence d’une catalase chez la souche étudiée.
1.4.2. Oxydase (test enzymatique effectué sur des bactéries Gram –)
Rechercher la présence d’une oxydase chez la souche étudiée.
1.6.Détermination du type respiratoire
A partir de la suspension « S », ensemencer un milieu « viande-foie » (VF) en surfusion.
Incuber 24 heures à 37°C.
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1.7.Détermination de la voie d’attaque du glucose (VAG)
Dans un tube contenant 12 mL de milieu Hugh et Leifson (composition donnée en annexe), ajouter
stérilement 0,4 mL (soit 16 gouttes) de glucose à 30 % puis homogénéiser délicatement.
Ensemencer le tube avec quelques gouttes de la suspension « S ».
Incuber 24 heures à 37°C.
1.8.Mise en évidence de l’utilisation de glucides
1.8.1. Lactose
A partir de la suspension « S », ensemencer un milieu Kligkler-Hajna.
Incuber 24 heures à 37°C.
1.8.2. Mannitol
A partir de la suspension « S », ensemencer un milieu Mannitol Mobilité Nitrate.
Incuber 24 heures à 37°C.
1.8.3. Esculine
A partir de la suspension « S », ensemencer une gélose à l’esculine en tube fin.
Incuber 24 heures à 37°C.
1.8.4. Amidon
A partir de la suspension « S », ensemencer une gélose à l’amidon en petite boite de Pétri.
Incuber 24 heures à 37°C.
1.9.Mise en évidence de l’utilisation de substrats azotés
1.9.1. Urée et tryptophane
A partir de la suspension « S », ensemencer un milieu urée-indole.
Incuber 24 heures à 37°C.
1.9.2. Recherche des décarboxylases
A partir de la suspension « S », ensemencer les milieux LDC, ODC et ADH.
Incuber 24 heures à 37°C.
1.9.3. Caséine
Préparer, dans une petite boite de Pétri, une gélose trypticase soja au lait écrémé à 10 %.
Laisser solidifier.
A partir de la suspension « S », ensemencer la gélose au lait.
Incuber 24 heures à 37°C.
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2. Etude d’un bouillon contenant deux espèces bactériennes
A partir du bouillon noté « M » fourni en tube à hémolyse, réaliser :
-
une observation microscopique à l’état frais (x40),
-
une observation d’un frottis coloré (Gram, x100 à immersion),
-
un isolement sur milieu « ordinaire » (GTS),
-
un isolement sur milieu sélectif.
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