Mannitol-Mobilité-Nitrate
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BTS BIOANALYSES ET CONTROLES TECHNIQUES DE MICROBIOLOGIE 1e année - TP n°2 AFBB Page 1 BREVET DE TECHNICIEN SUPERIEUR BIOANALYSES ET CONTROLES Techniques de microbiologie Au cours de l’épreuve, le jury appréciera les qualités d’organisation, le respect des règles d’hygiène et de sécurité en laboratoire. Pour une bonne réalisation de l’épreuve, une gestion optimale du temps imparti est nécessaire en fonction des temps d’incubation. Le candidat prendra soin de bien lire l’ensemble du sujet avant de commencer les manipulations. Tous les milieux ensemencés (boites, tubes) doivent être identifiés avec vos initiales inscrites au feutre indélébile. BTS BIOANALYSES ET CONTROLES TECHNIQUES DE MICROBIOLOGIE 1e année - TP n°2 AFBB Page 2 Métabolisme énergétique des bactéries 1. Etude des caractères morphologiques et biochimiques d’une bactérie : Pseudomonas aeruginosa 1.1.Réalisation d’une suspension bactérienne en eau physiologique Réaliser une suspension bactérienne « S » en eau physiologique stérile (5 mL dans un tube à essais), à partir d’une culture fournie sur gélose nutritive inclinée notée « P ». Compte-rendu : Décrire l’aspect de la culture « P ». 1.2.Vérification de la pureté de la souche en suspension A partir de la suspension « S », réaliser un isolement sur gélose trypticase-soja (GTS). Incuber 24 heures à 37°C. Compte-rendu (2e jour) : Décrire les colonies obtenues et vérifier la pureté de la souche isolée, c’est à dire l’absence de contaminant. Cette vérification permet la validation des ensemencements des milieux d’identification. 1.3.Recherche de la mobilité bactérienne 1.3.1. Observation microscopique à « l’état frais » Réaliser un montage entre lame et lamelle de la suspension « S » et l’observer au microscope (objectif x40). Compte-rendu : Décrire les micro-organismes observés. Constater l’éventuelle présence d’une mobilité. 1.3.2. Ensemencement de milieux de mise en évidence de la mobilité - Ensemencer un bouillon nutritif ordinaire (« BO ») avec une goutte de suspension « S ». - Le milieu mannitol-mobilité-nitrate (« MMN »), dont la composition donnée en annexe, est ensemencé avec une pipette Pasteur boutonnée : la suspension bactérienne « S » est introduite dans le milieu par piqûre centrale. - Incuber les milieux « BO » et « MMN » 24 h à 37°C. Compte-rendu (2e jour) : BTS BIOANALYSES ET CONTROLES TECHNIQUES DE MICROBIOLOGIE 1e année - TP n°2 AFBB Page 3 Décrire les cultures observées. Constater l’éventuelle présence d’une mobilité : - en réalisant une observation à l’état frais de la culture en bouillon (préciser si possible le type de ciliature, polaire ou péritriche) ; - par lecture directe du milieu « MMN ». 1.4.Observation microscopique d’un frottis coloré par la méthode de Gram Réaliser sur une lame un frottis avec la suspension « S ». NB : il est important de séparer les étapes de séchage et de fixation du frottis. Effectuer la coloration de Gram. Observer avec l’objectif x100 à immersion. Compte-rendu : Décrire les micro-organismes observés. Vérifier la « pureté » de la souche ». 1.5.Test enzymatique rapide : catalase ou oxydase 1.5.1. Catalase (test enzymatique effectué sur des bactéries Gram +) Rechercher la présence d’une catalase chez la souche étudiée. Compte-rendu : Décrire la réaction observée et conclure. 1.4.2. Oxydase (test enzymatique effectué sur des bactéries Gram –) Rechercher la présence d’une oxydase chez la souche étudiée. Compte-rendu : Décrire la réaction observée et conclure. 1.6.Détermination du type respiratoire A partir de la suspension « S », ensemencer un milieu « viande-foie » (VF) en surfusion. Incuber 24 heures à 37°C. Compte-rendu (2e jour) : Décrire le résultat obtenu. En déduire le type respiratoire de la souche bactérienne étudiée. BTS BIOANALYSES ET CONTROLES TECHNIQUES DE MICROBIOLOGIE 1e année - TP n°2 AFBB Page 4 1.7.Détermination de la voie d’attaque du glucose (VAG) Dans un tube contenant 12 mL de milieu Hugh et Leifson (composition donnée en annexe), ajouter stérilement 0,4 mL (soit 16 gouttes) de glucose à 30 % puis homogénéiser délicatement. Ensemencer le tube avec quelques gouttes de la suspension « S ». Incuber 24 heures à 37°C. Compte-rendu (2e jour) : Décrire et interpréter le résultat obtenu. 1.8.Mise en évidence de l’utilisation de glucides 1.8.1. Lactose A partir de la suspension « S », réaliser un isolement sur gélose BCP lactose. Incuber 24 heures à 37°C. Compte-rendu (2e jour) : Décrire et interpréter le résultat obtenu en tenant compte de la composition du milieu. 1.8.2. Mannitol Le milieu « mannitol-mobilité-nitrate » a déjà été ensemencé précédemment (1.2.2.). Compte-rendu (2e jour) : Après 24 h d’incubation, effectuer la lecture en tenant compte de la composition du milieu (donnée en annexe). 1.9.Mise en évidence de la nitrate réductase Le milieu « mannitol-mobilité-nitrate » (composition donnée en annexe) a déjà été ensemencé précédemment (1.2.2.). Après 24 h d’incubation et lecture des caractères « mobilité » et « mannitol », ajouter les réactifs appropriés. Compte-rendu (2e jour) : Décrire la (les) réaction(s) observée(s) et conclure. BTS BIOANALYSES ET CONTROLES TECHNIQUES DE MICROBIOLOGIE 1e année - TP n°2 AFBB Page 5 2. Etude d’un bouillon contenant deux espèces bactériennes A partir du bouillon noté « M » fourni en tube à hémolyse, réaliser : - une observation microscopique à l’état frais (x40), - une observation d’un frottis coloré (Gram, x100 à immersion), - un isolement sur milieu « ordinaire » (GTS), - deux isolements sur milieux sélectifs (Chapman et Drigalski). Compte-rendu : Décrire les micro-organismes observés au microscope. Après incubation, décrire les colonies obtenues sur GTS et donner les caractères des bactéries présentes sur chaque milieu sélectif. BTS BIOANALYSES ET CONTROLES TECHNIQUES DE MICROBIOLOGIE 1e année - TP n°2 Composition des milieux de culture utilisés Mannitol-Mobilité-Nitrate Usage : utilisation du mannitol, réduction des nitrates, mobilité en gélose semi-molle Composition : hydrolysat trypsique de caséine 10,0 g mannitol 7,5 g rouge de phénol 0,4 mg nitrate de potassium 1,0 g agar 3,5 g pH = 7,6 Préparation : 22 g par litre. Hugh_et_Leifson Usage : détermination de la voie d'attaque des glucides Composition : tryptone 2,0 g bleu de bromothymol 30 mg chlorure de sodium 5,0 g hydrogénophosphate de potassium 0,3 g agar 2,5 g pH = 7,1 Préparation : 9,8 g par litre. Milieu de Chapman Usage : isolement des Staphylococcus Composition (pour un litre) : peptone 10,0 g extrait de viande de boeuf 1,0 g chlorure de sodium 75,0 g mannitol 10,0 g rouge de phénol 0,025 g agar 15,0 g pH = 7,4 Milieu de Drigalski Usage : isolement des bacilles Gram- de culture facile Composition (pour un litre) : peptone 15,0 g extrait de viande 3,0 g extrait de levure 3,0 g lactose 15,0 g désoxycholate de sodium 1,0 g cristal violet 0,005 g bleu de bromothymol 0,080 g thiosulfate de sodium 1,0 g agar 11,0 g pH = 7,4 AFBB Page 6
