Applications de la méthode de dénombrement sur

BTS BIOANALYSES ET CONTROLES
2e année - TP n°1
AFBB
TECHNIQUES DE MICROBIOLOGIE
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BREVET DE TECHNICIEN SUPERIEUR
BIOANALYSES ET CONTROLES
Epreuve E5 – Unité U52
Techniques de microbiologie
Au cours de l’épreuve, le jury appréciera les qualités d’organisation, le respect des règles d’hygiène
et de sécurité en laboratoire.
Pour une bonne réalisation de l’épreuve, une gestion optimale du temps imparti est nécessaire en
fonction des temps d’incubation. Le candidat prendra soin de bien lire l’ensemble du sujet avant de
commencer les manipulations.
Documents interdits – Calculatrice autorisée
1er JOUR – DUREE DE L’EPREUVE : 3h00

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Applications de la méthode de dénombrement sur membrane
On se propose de vérifier l’efficacité de la méthode de dénombrement des micro-organismes par filtration
sur membrane, à l’aide de deux souches tests :
- Escherichia coli ATCC 25922 ;
- Enterococcus faecalis ATCC 19433.
1. Contrôle de l’identité des micro-organismes de référence
1.1.Matériel
 Culture de la souche Escherichia coli ATCC 25922 notée « C » sur gélose inclinée
 Culture de la souche Enterococcus faecalis ATCC 19433 notée « F » sur gélose inclinée
 lames, lamelles et colorants de Gram
 réactifs pour tests enzymatiques
1.2.Mode opératoire et compte-rendu
Effectuer les observations microscopiques nécessaires puis un test enzymatique approprié.
Indiquer les résultats des examens microscopiques et du test enzymatique sur le compte-rendu.
Proposer une liste de milieux à ensemencer pour la vérification des caractères des souches tests : la
galerie choisie devra être en macrométhode pour Escherichia coli ATCC 25922, en microméthode pour
Enterococcus faecalis ATCC 19433.
Ensemencer les milieux fournis.
Incuber les milieux (préciser la température d’incubation souhaitée sur le compte-rendu).
2. Réalisation et dénombrement d’une suspension bactérienne d’essai
2.1.Matériel
 Culture de la souche Escherichia coli ATCC 25922 notée « C » sur gélose inclinée
 Culture de la souche Enterococcus faecalis ATCC 19433 notée « F » sur gélose inclinée
 2 tubes contenant 5 mL d’eau physiologique stérile
 8 pipettes de 1 mL stériles
 7 tubes contenant 9 mL d’eau physiologique stérile
 6 boites de Pétri stériles
 un flacon contenant 100 mL de milieu PCA en surfusion

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2.2.Mode opératoire
Préparer une suspension d’Escherichia coli d’opacité équivalente à celle du témoin de Mac Farland 0.5.
Préparer une suspension d’Enterococcus faecalis d’opacité équivalente à celle du témoin de Mac Farland
1. Les deux suspensions obtenues contiennent théoriquement environ 108 bactéries par mL.
Dans un tube contenant 9 mL d’eau physiologique stérile, introduire 0,5 mL de chacune des deux
suspensions préparées précédemment. Cette suspension contenant les deux souches bactériennes est
appelée « suspension bactérienne d’essai » et notée « SBE ».
Réaliser le nombre de dilutions décimales nécessaires pour effectuer un dénombrement en masse.
Dénombrer les trois dernières dilutions en double-essai.
2.3.Compte-rendu
Estimer les concentrations bactériennes dans la suspension bactérienne d’essai.
Justifier le choix des dilutions ensemencées.
Quels sont les micro-organismes théoriquement dénombrés par cette technique ?
3. Dénombrements par la technique de filtration
3.1.Matériel
 un flacon contenant 200 mL d’eau stérile
 un appareil à filtration stérile
 2 filtres stériles
 1 boites de gélose lactosée au Tergitol 7 et au TTC
 1 boite de gélose de Slanetz et Bartley
3.2.Mode opératoire
Dans un flacon contenant 200 mL d’eau, à l’aide de l’une des dilutions décimales réalisées dans la 2e
partie, introduire environ 40 bactéries. Homogénéiser.
En respectant les consignes d’utilisation de l’appareil à filtration, effectuer deux filtrations de 100 mL de
suspension. Déposer le premier filtre sur le milieu lactosé au Tergitol 7 et au TTC, le second sur le milieu
de Slanetz et Bartley.
3.3.Compte-rendu
Expliquer la préparation de la suspension contenant environ 40 bactéries.
Justifier le diamètre des pores des filtres utilisés.
Justifier le choix des milieux utilisés en fonction des germes recherchés et la température d’incubation.

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4. Contrôle de l’activité bactéricide de l’hypochlorite de sodium
4.1.Matériel
 un flacon contenant 100 mL d’eau de Javel
 suspension d’E. coli préparée en 2e partie
 3 tubes contenant 9 mL d’eau physiologique stérile
 3 pipettes de 1 mL stériles
 un appareil à filtration stérile
 1 filtre stérile
 1 boites de gélose lactosée au Tergitol 7 et au TTC
4.2.Mode opératoire
Dans un flacon contenant 100 mL d’eau de Javel, à l’aide de l’une des dilutions décimales réalisées dans
la 2e partie, introduire environ 105 cellules d’E. coli. Homogénéiser.
Laisser un temps de contact de 45 minutes à température ambiante.
Filtrer le contenu du flacon et déposer le filtre sur le milieu lactosé au Tergitol 7 et au TTC.
4.3.Compte-rendu
Expliquer la préparation de la suspension en eau de Javel contenant environ 105 bactéries.
Quelle quantité maximale de colonies doit-on obtenir après incubation pour vérifier l’activité bactéricide
(soit 99,99 % de réduction) du désinfectant ?