Les différentes structures des protéines

Les différentes structures des protéines
Structure primaire
Structure secondaire
-Ala-Glu-Val-Thr-Asp-Pro-Gly-
-AEVTDPG-
Hélice
Feuillet
Structure tertiaire
Structure quaternaire
Domaine
C. Lacombe
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Les différentes structures des protéines
structure primaire : suite ordonnée de résidus d’acides aminés
liés par des liaisons peptidiques (= séquence)
structure secondaire : conformation spatiale répétitive régulière
de segments de la chaîne protéique (hélice , feuillet )
structure tertiaire : conformation biologiquement active (dite
native) d’une chaîne polypeptidique repliée en une structure
tridimensionnelle.
structure quaternaire : structure dans l’espace adoptée par
l’association d’au moins deux chaînes polypeptidiques distinctes
en un multimère protéique.
C. Lacombe
2
1
I - Structure primaire
Liaison peptidique
R2
R1
+
CH
+3HN
Résidu
aminoterminal
CH
H3N+
CO
CH
NH
COO -
NH
CH
CH
COO -
CO - NH
Liaison peptidique
CH 2 SH
NH
CO
+3HN
COO -
3
CH
R2
CH
CH
+3HN
COO -
R1
CO
CH
2
Résidu
carboxyterminal
CH 2OH
Ala
Ala nyl
Ser
Cys
Gly
Séryl
Cy stéinyl
Glycine
ASCG
C. Lacombe
3
II - Méthode d’étude des protéines
Techniques de purification d’une protéine
* Précipitation fractionnée
* Centrifugation
* Chromatographies
* Dialyse
* Électrophorèse sur gel de polyacrylamide
* Isoélectrofocalisation
* Électrophorèse bidimensionnelle
C. Lacombe
4
2
II - Méthode d’étude des protéines
Techniques de purification d’une protéine
* Électrophorèse sur gel de polyacrylamide en
présence de SDS (SDS-PAGE)
Le SDS (Sodium Docécyl Sulfate) dénature les protéines et les charge
négativement.
Séparation des molécules en fonction de leur masse, les plus
petites migrent plus loin dans le gel (plus près de l’anode)
(Cf chapitre : Techniques)
C. Lacombe
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L’électrophorèse
• L’électrophorèse sur gel
Le gel va ralentir la migration des grosses molécules.
Dépôt de
l'échantillon
Cathode
Plaques de
verre entre
lesquelles le gel
a été coulé
Anode
C. Lacombe
6
3
L’électrophorèse
• L’électrophorèse sur gel de polyacrylamide en
présence de SDS (SDS-PAGE)
PM
kDa
Séparation des molécules en
fonction de leur masse, les plus
petites migrent plus loin dans le gel
(plus près de l’anode)
-
94
67
43
30
20
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C. Lacombe
+
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II - Méthode d’étude des protéines
Techniques de purification d’une protéine
* Électrophorèse bidimensionnelle: un gel de polyacrylamide
sur lequel a été réalisé une isoélectrofocalisation (IEF) est déposé au-dessus d’un
gel de polyacrylamide-SDS (SDS-PAGE). Les protéines sont ainsi séparées dans
la première dimension en fonction de leur pHi et dans la deuxième dimension en
fonction de leur PM.
Extrémité basique
Extrémité acide
I : IEF
pHi
II : SDS-PAGE
PM
C. Lacombe
pHi
8
4
II - Méthode d’étude des protéines
Détermination de la séquence d’une protéine
=
*Rupture des ponts disulfures
- oxydation par l’acide performique
O
CH - CH2 - S - S - CH2 - CH + H - C - O - OH
Pont disulfure
acide performique
2 CH - CH2 - SO3Acide cystéique
Inconvénients : les résidus Met sont oxydés (en méthionine sulfone) et
le Trp est détruit
C. Lacombe
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II - Méthode d’étude des protéines
Détermination de la séquence d’une protéine
*Rupture des ponts disulfures
- réduction par le -mercaptoéthanol
CH - CH2 - S - S - CH2 - CH + 2 HS - CH2 - CH2 - OH
Pont disulfure
2 CH - CH2 - SH +
Cystéine
C. Lacombe
-mercaptoéthanol
S - CH2 - OH
S - CH2 - OH
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5
II - Méthode d’étude des protéines
Détermination de la séquence d’une protéine
*Rupture des ponts disulfures
- réduction par le dithiothréitol
CH - CH2 - S - S - CH2 - CH + HSCH2 - (CHOH)2- CH2SH
Pont disulfure
dithiothréitol
HO
2 CH - CH2 - SH
Cystéine
S
+
S
HO
C. Lacombe
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II - Méthode d’étude des protéines
Détermination de la séquence d’une protéine
*Protéolyse
• Bromure de cyanogène (BrCN)
provoque la rupture de la liaison peptidique après Met
O
O
.... NH - CH - C - NH - CH - C - NH - CH - C ..
R1
CH 2
CH 2
S
CH 3
O
O
R2
.... NH - CH - C - NH - CH - C
R1
H2 C
O
O
+
O
+
NH - CH - C ..
3
R2
CH2
Homosérinelactone
Méthionine
C. Lacombe
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6
II - Méthode d’étude des protéines
Détermination de la séquence d’une protéine
*Protéolyse
• Trypsine
hydrolyse la liaison peptidique côté C de Lys et Arg
• Chymotrypsine
hydrolyse la liaison peptidique côté C de Tyr, Phe et Trp
• La protéase V8 de Streptococcus aureus
hydrolyse la liaison peptidique côté C de Asp et Glu
(seulement de Glu dans certaines conditions de tampon)
C. Lacombe
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II - Méthode d’étude des protéines
• Détermination de la séquence d’une protéine
*Séparation des peptides
• Finger-print
• Chromatographies
• Électrophorèses
C. Lacombe
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II - Méthode d’étude des protéines
• Détermination de la séquence d’une protéine
*Analyse de chaque peptide
Hydrolyse acide totale : HCl 6N, 24 heures, 100°C
rupture de toutes les liaisons peptidiques
MAIS
destruction du Trp (W)
et transformation Asn (N)
Asp (D) et Gln (Q)
Glu (E)
• Détermination de la composition en acides aminés
chromatographie par échange d’ions et coloration à la ninhydrine
C. Lacombe
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II - Méthode d’étude des protéines
Détermination de la séquence d’une protéine
A570 nm
Chromatographie
par échange
d’ions
pH
C. Lacombe
Ordre de sortie des acides aminés avec un tampon de pH
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II - Méthode d’étude des protéines
Détermination de la séquence d’une protéine
Réaction d’un acide aminé avec la ninhydrine
O
(Schéma simplifié)
+
3 HN
OH
COOH + 2
CH
ninhydrine
OH
R
O
O
O
+
NH
Pourpre de Ruhemann*
= 570 nm
+ RCHO + CO2
O
O
* Dans le cas de la proline, et dans ce cas seulement, le composé coloré absorbe à 440 nm
C. Lacombe
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II - Méthode d’étude des protéines
Détermination de la séquence d’une protéine
• Détermination de l’extrémité N-terminale
* aminopeptidase : détache sélectivement le premier acide
aminé (puis le deuxième, … etc)
* réaction d’Edman (qui permet un séquençage)
S
Phénylisothiocyanate (PITC)
C
S
S
N
+
-O
C
O
C
C
N H2
CH
R1
Acide aminé
H
N
NH
HO
CH
C
R1
O
Phénylthiocarbamyl
N
C
O
NH
CH
R1
Phénylthiohydanthoïne
AA (PTH-Aa
identifié par chomatographie)
Détermination de l’extrémité C-terminale
* carboxypeptidase : détache sélectivement le dernier acide
aminé (puis l’avant-dernier, … etc)
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II - Structure secondaire
La liaison peptidique :
- double liaison partielle
- C , C, O, N, H, C ’ sont dans un même plan
C. Lacombe
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III - Structure secondaire
N
C'
N
C
C
C'
N
C'
Définition des angles de torsion du squelette peptidique
Définition des angles de torsion du squelette peptidique
: rotation autour liaison C -N
Angle
: rotation autour liaison C -C
C
N
H
H
Angle
C
O
H
C
N
R
C
C
C. Lacombe
O
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III - Structure secondaire
Extrémité N-terminale
Hélice
Liaison peptidique
Feuillet
Liaison
hydrogène
Liaison
hydrogène
Extrémité C-terminale
L’hélice est souvent représentée par un rectangle ou un cylindre.
Le feuillet est toujours symbolisé par une flèche
C. Lacombe
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II - Structure secondaire :
caractéristiques hélice
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Liaison H entre C=O atome i et NH atome i+4
Liaison H = 2,86 Å
3,6 résidus/tour
Radicaux extérieurs à l’hélice
Plan liaisons peptidiques // axe hélice
Plutôt résidus à R petite et non chargée
Pro = point de rupture
= -57°
-45° < < -50°
Liaisons H // axe de l’hélice
C. Lacombe
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III - Structure secondaire
K G
E
E
K
S
K
A
K
A
V
L
K
A
A
I
W
G
A
Représentation d’un peptide amphiphile en hélice en roue
hélicoïdale (représentation d’Edmunson)
Mise en évidence d’une face polaire et d’une face apolaire de l’hélice.
(Les résidus hydrophiles sont entourés d’un cercle)
C. Lacombe
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III - Structure secondaire :
caractéristiques feuillet
•
•
•
•
•
•
•
Liaisons H entre segments ou chaînes
Structure à plat étirée
Chaînes // ou anti //
C alternativement en-dessous et au-dessus
Une liaison peptidique/2 participe à liaison H
// distance entre 2 chaînes = 0,32 nm
anti // d. entre 2 chaînes = 0,35 nm
• Liaisons H
C. Lacombe
= -119°
= + 113°
= -139°
= + 135°
axe de la chaîne
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II - Structure secondaire : coude
Le groupement C=O
du résidu numéroté 1
forme une liaison
hydrogène avec le NH
du résidu numéroté 4
(et vice-versa) ce qui
provoque un coude .
C. Lacombe
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III - Structure tertiaire
Repliement tridimensionnel de la chaîne protéique stabilisé
par différents types de forces :
Ile
Trp
Interactions
hydrophobes
Val
Leu
Phe
S-S
Met
pont disulfure
COO-
liaison hydrogène
liaison ionique
+
3 HN
C. Lacombe
OC=O
H-O
+
COO - NH 3
26
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