PCEM2 : Physiologie : 2008-09 Endothélium et cellules sanguines Pr Philippe Nguyen Faculté de Médecine et CHU de Reims Objectifs • Comprendre la physiologie de : – La cellule endothéliale – L’hémostase – La coagulation plasmatique – La fibrinolyse • Définitions : – Hémostase, hémostase primaire, hémocompatibilité, coagulation plasmatique, fibrinolyse. Plan du cours : 1ère partie • Structure du vaisseau • Présentation de la cellule endothéliale • Présentation (morphologique) des cellules sanguines • Adhésion leucocytaire et migration transendothéliale • Interaction plaquettes-endothélium. Structure du vaisseau • Intima – Monocouche de cellules endothéliales – Tissu conjonctif • Média – Cellules musculaires lisses – Constituants extracellulaires : élastine, collagènes,protéoglycanes • Adventice – Collagènes – Fibroblastes • Vasa vasorum (vascularisation) et innervation adrénergique, cholinergiques, purinergiques Diamètr e Épaisseur Paroi CML Elastine Collagène Innervation Artères élastiques 1à2 cm 2 mm +++ +++ I,III + Artères musculaires 1mm 1 mm à 1 cm +++ ++ I,III ++ Artérioles 30 µm + + I,III +++ Capillaires 5-8 µm 1 µm 0 0 IV,V 0 Veinules 0,5 cm 0,5 mm + + + Veines 1à 3 cm + + + 20 µm 1,5 mm Cellule endothéliale Cellules aplaties (L:100 µm-l:10 µm Épaisseur :0,3 µm) disposées en mosaïque Processus physiologiques : -Tonus vaso-moteur -Traffic des leucocytes -Naissance de nouveaux vaisseaux -(notion de progéniteurs endothéliaux) Lumière Jonction intercellulaire Sous-endothélium NOYAU Corps de Weibel Palade JAM Jonction serrée Actine VE-Cadhérine Jonction d’adhérence Caténines Adhésion Signalisation et Ancrage au cytosquelette Vaisseau Diamètre en cm Contrainte de Cisaillement (en sec-1) Aorte ascendante Artère fémorale Artère de petit diamètre Capillaire Grosse veine Veine cave inférieure 2,3-4,5 50-300 0,5 350 0,03 1500 0,0006 2000-5000 0,5-1 200 2 50 Vasomotricité • Vasoconstriction : – Diminution du diamètre du vaisseau – Augmentation des forces de cisaillement à la paroi • Vasodilatation : – Augmentation du diamètre du vaisseau – Diminution des forces de cisaillement à la paroi Les différents types de cellules sanguines • Globules rouges ou hématies (lignée érythroblastique) • Leucocytes : – Polynucléaires • Neutrophiles • Eosinophiles • Basophiles – Monocytes – Lymphocytes • Plaquettes (lignée mégacaryocytaire) Globules rouges Morphologie : petite cellule anucléée Déformabilité de la membrane +++ Microscopie à balayage 5.10 12/L de sang Élément cellulaire majeur de la viscosité sanguine et du Cisaillement à la paroi Polynucléaires neutrophiles Morphologie : -10-12 µm -Cytoplasme abondant : granulations - Noyau réniforme (cellule immature) ; - Noyau segmenté (cellule mature) Polynucléaires éosinophiles Morphologie : -9-12 µm - Cytoplasme abondant : granulations - Noyau bilobé, réniforme Granulations éosinophiles Polynucléaires basophile Morphologie : -8-10 µm - Noyau rond Granulations basophiles histamine héparine Monocytes Morphologie : -9-15 µm - Noyau arrondi, indenté -Cytoplasme granuleux : Lymphocytes Morphologie : au repos G0 -7-9 µm - Noyau volumineux, à chromatine dense -Cytoplasme mince Plaquettes Microscopie électronique à balayage Plaquette au repos Plaquettes activées Pseudopodes Agrégats Microscopie optique Agrégat plaquettaire Hémocompatibilité de la cellule endothéliale • En l’absence d’activation cellulaire : – Les plaquettes et les globules rouges n’adhèrent pas à la surface de l’endothélium – Les leucocytes roulent sur l’endothélium et adhèrent de façon réversible • Éléments de cette hémocompatibilité : – Glycocalyx = protéoglycanes de la surface des membranes cellulaires – Glycosaminogycanes de la surface endothéliale = sulfate d’héparane. – Donc : répulsion électrostatique Adhésion leucocytaire (microscopie électronique) Noyau Granulations Endothélium Pseudopodes Adhésion leucocytaire, migration transendothéliale • Phénomène « inflammatoire » • Réponse à une agression tissulaire : – Microorganisme : exemple bactérie – Corps étranger : exemple particule minérale • Objectif : passage du leucocyte du sang vers le tissu – Destruction du microorganisme : exemple bactéricidie – Phagocytose de la particule minérale par les macrophages Adhésion leucocytaire, migration transendothéliale • Vasodilatation = ralentissement du flux • Roulement, attraction des cellules par les chémokines – Interleukine 8 (IL-8) … • Adhésion réversible puis irréversible – L-sélectine (sélectine leucocytaire) et E-sélectine (sélectine endothéliale) – Cette adhésion favorise l’activation endothélium/leucocytes de façon réciproque – Les cytokines pro-inflammatoires et certains composants de microorganisme (exemple : éléments de la paroi bactérienne) favorisent cette activation – Activation des intégrines leucocytaires : b2, b1 intégrines – Activation des molécules d’adhésion endothéliale : ICAM, VCAM Force de cisaillement Roulement L-sélectine PSGL-1 Sialyl Lewis X P- E-sélectine Glycam-1 CD34 MadCAM-1 Activation Adhésion ferme Etalement Activation Transmigration Adhésion leucocytaire, migration transendothéliale • Transmigration : – Rétraction des cellules endothéliales – Ouverture des jonctions : molécules d’adhésion JAM (junction adhesion molecule) et VE-Cadhérine – Mobilité cellulaire : • Adhésion, émission de pseudopodes, rétraction cellulaire • Activité protéasique • Radicaux libres = dérivés réactifs de l’oxygène • Passage dans les tissus : – Processus de différenciation : le monocyte devient « macrophage » ; le PN basophile devient « mastocyte » MACROPHAGES Interaction plaquettes-endothélium Plaquettes Microscopie électronique à balayage Plaquette au repos Plaquettes activées Pseudopodes Agrégats Microscopie optique Agrégat plaquettaire Plaquettes Granules denses (ME) : -Calcium Granules a Expression de récepteurs membranaires Morphologie : petite cellule anucléée Granulations Interaction plaquettes-endothélium • La plaquette n’adhère pas à la cellule endothéliale – Répulsion électrostatique – Production par la cellule endothéliale de monoxyde d’azote (NO) = vasodilatateur – Production par la prostacycline synthase endothéliale de PGI2 = vasodilateur et inhibiteur plaquettaire Interaction plaquettes-endothélium • Lors d’une brèche vasculaire : – Saignement = extravasation des cellules sanguines – Adhésion plaquettaire – Activation plaquettaire : • Production de thromboxane A2 par la cyclooxygénase plaquettaire – Vasoconstriction et activation plaquettaire – Vasoconstriction • Réduction du flux sanguin donc du saignement • Favorise l’adhésion des plaquettes Adhésion plaquettaire au sous-endothélium • Adhésion plaquettaire : – Adhésion médiée par le récepteur plaquettaire GPIb-IX-V – Se lie au facteur Willebrand – Le facteur Willebrand se lie aux protéines du sous-endothélium ( collagènes, laminine, vitronectine) – Activation plaquettaire : • Activation du récepteur GPIIb-IIIa • Dégranulation plaquettaire Facteur Willebrand (VWF) Gène Chr. 12, 178 kb, 52 exons, mRNA 9 kb Synthèse Cellule Endothéliale Mégacaryocyte Localisation Cellule endothéliale (Corps deWeibel-Palade) Sous-Endothélium Plasma Plaquettes (granules alpha) Concentration plasma 5-10 µg/ml Fonctions Protéine portant le F.VIII (de la coagulation) Médiateur de l’adhésion plaquettaire et de l’agrégation à fort cisaillement Glycoprotéine Multimères (MM 0.5- >15x106) Sous-unités (MM 2.7x105) Structure D.BARUCH Structure multimérique du Facteur Willebrand D.BARUCH C C N N C C C C N C C N C C NN NN NN C C 20x106 Da (ultra large Ms) N C C NN C C NN C C NN 5x105 Da N Plasma C. Endothéliale Modification conformationnelle du Facteur Willebrand Exposition de la liaison à GPIb Cisaillement : nul modéré élevé D’après Siedlecki aIIbb3 Activation plaquettaire Expression et activation de la b3 intégrine aIIbb3 ou GPIIbIIa + FIBRINOGENE Plaquettes Morphologie : petite cellule anucléée Granulations Granules denses (ME) : -Sérotonine -Calcium -ADP Granules a : Facteur Willebrand, fibrinogène PDGF, TGFa/b,, fibronectine Expression de récepteurs membranaires : -GPIb-V-IX (CD42) : F Willebrand -GPIIb-IIIa (CD41) : Fibrinogène -P-sélectine (CD62P) Agrégation plaquettaire • Activation du récepteur GPIIb-IIIa (b3 intégrine) • Liaison de GPIIb-IIIa activé au fibrinogène • Activation plaquettaire : – Dégranulation : facteur Willebrand plaquettaire, fibrinogène, Adénosine diphosphate ou ADP – Amplification du phénomène – Formation d’un caillot plaquettaire (« clou » plaquettaire = arrêt du saignement Thrombogénicité physiologique du sous endothélium FLUX SANGUIN aIIbb3 Plaquette vWF GPIb Fg Cellule endothéliale Matrice extracellulaire D.BARUCH Contact Adhésion Agrégation D’après Jackson SP, Mistry N, Yuan Y. Platelets and the injured vessel wall. Trends Cardiovasc Med 2001;10,192-197 Plan du cours : 2ère partie • Définition de la coagulation plasmatique • Définition de la fibrinolyse • Préparation à l’enseignement dirigé HEMOSTASE • Mécanismes participant à l’arrêt du saignement • Processus de cicatrisation • 3 phases : – Hémostase primaire : vasoconstriction + adhésion-agrégation plaquettaire – Coagulation : constitution d’un réseau de fibrine à partir d’une molécule plasmatique soluble : le fibrinogène – Fibrinolyse : dissolution du caillot de fibrine = reperméabilisation vasculaire Réseau de fibrine Coagulation plasmatique • Initiation : La brèche vasculaire/la cellule endothéliale altérée expose le facteur tissulaire • Activation enzymatique complexe aboutissant à la génération de thrombine • La thrombine transforme le fibrinogène (soluble) en réseau de fibrine insoluble (solidité +++) • La fibrine est colonisées par des cellules (leucocytes, plaquettes, fibroblastes) – Défense contre l’infection – Cicatrisation : facteurs de croissance, collagènes et protéines matricielles • Dans le sang circulant – Toutes ces protéines sont présentes dans le plasma, mais inactives/activables rapidement. – Le fibrinogène, substrat de la thrombine, est soluble coagulation • Lors d’une brèche vasculaire ou d’une activation endothéliale : – Exposition du facteur tissulaire – Fixation FT-VII avec une très forte affinité – Exposition des phospholipides anioniques (phosphatidylsérine) – Fixation des facteurs vitamine K dépendants sur les surfaces procoagulantes • Quel est le nom de la protéine capable d’initier la coagulation ? LE FACTEUR TISSULAIRE : - Glycoprotéine transmembranaire - Présente de façon très abondante dans les tissus, y compris le sous-endothélium - Exprimé par la cellule endothéliale et le monocyte en réponse à une stimulation infectieuse (lipopolysaccharides des parois bactériennes) ou inflammatoire (cytokines inflammatoires) - Récepteur du facteur VII de la coagulation LE FACTEUR TISSULAIRE : Structure du complexe FT/VIIa Structure cristallographique Transfert d ’énergie de fluorescence Coagulation plasmatique • Facteurs plasmatiques de coagulation – Nombreuses protéines impliquées dans la coagulation plasmatique – Un gène code pour une protéine – Protéines de synthèse hépatique : facteur V, fibrinogène – Protéines de la coagulation dépendant de la vitamine K : facteurs II, facteur VII, facteur X, facteur IX • Citer les différentes protéines impliquées dans la génération de thrombine. Lieu de synthèse. L’HEPATOCYTE • Facteur II : Prothrombine • Facteur VII : Proconvertine + Vitamine K • Facteur IX : Antihémophilique B • Facteur X : Stuart • Facteur V : Pro accélérine FOIE : lieu mal identifié • Facteur VIII : Antihémophilique A • Facteur XI : Rosenthal • Rôle de la vitamine K. • Rappel des facteurs dépendant de la vitramine K : – – – – Facteur II : Prothrombine Facteur VII : Proconvertine Facteur IX : Antihémophilique B (FAH B) Facteur X : Stuart g carboxylase dépendant de la vitamine K Glu-protéine Gla-protéine Capacité de se fixer aux Phospholipides par l’intermédiaire de Ca++ • Rôle dans la génération de thrombine : • Zymogènes (vitamine K dépendant) de sérine protéases : – – – – Facteur II : Prothrombine IIa : Thrombine Facteur VII VIIactivé Facteur IX IXactivé Facteur X Xactivé • Facteur XI : zymogène (non vit K dépendant) de sérine protéase X(a) • Cofacteurs (inactifs) d’enzymes – Facteur VIII : co-facteur du IXa – Facteur V : co-facteur du Xa Activité procoagulante des plaquettes • Activation plaquettaire : – exposition de phospholipides anioniques (phosphatidylsérine) – Émission de microparticules procoagulantes – Surface électronégatives = forte affinité pour les protéines de la coagulation • Phénomène de coagulation plasmatique. Coagulation plasmatique • Au niveau de la brèche vasculaire : – Génération de thrombine à partir d’un proenzyme : la prothrombine – La thrombine va cliver les molécules de fibrinogène pour obtenir des monomères de fibrine (réseau de fibrine encore soluble) – La thrombine va ensuite activer une transpeptidase – le facteur XIII, lequel stabilise le réseau de fibrine (fibrine solide, insoluble) Molécule de fibrinogène Régulation de la génération de thrombine • La génération de thrombine est régulée (négativement) par : – Au niveau plasmatique : l’antithrombine (inactive la thrombine) – Au niveau de la cellule endothéliale : la protéine C (sérine protéase) et son co-facteur la protéine S Fibrinolyse • Lors de la cicatrisation (5ème jour post-chirurgie par exemple) : – Lyse du caillot de fibrine – L’enzyme capable de détruire la fibrine est la plasmine, laquelle est formée progressivement au niveau du réseau de fibrine, à partir d’un pro-enzyme : le plasminogène Préparation à l’enseignement dirigé • Quel est le nom de la protéine capable d’initier la coagulation ? • Citer les différentes protéines impliquées dans la génération de thrombine. Lieu de synthèse. Rôle de la vitamine K. Rôle dans la génération de thrombine • Citer les protéines impliquées dans la régulation (négative) de la génération de thrombine. Lieu de synthèse. Rôle de la vitamine K. Rôle de la cellule endothéliale. • Citer les protéines impliquées dans la régulation de la génération de plasmine. Préparation à l’ED • La prothrombine est le précurseur d’enzyme (ou zymogène) d’une sérine protéase dépendant de la vitamine K – Qu’est-ce qu’une sérine protéase ? – Citez les autres sérines protéases, dépendant de la vitamine K et favorisant la génération de thrombine – Quelle est la modification post-traductionnelle de ces facteurs de coagulation ? – En quoi cette modification de structure permet-elle une fonction biologique normale ? Préparation à l’ED Le fibrinogène est une molécule soluble synthétisée par le foie. C’est l’un des substrats de la thrombine. C’est également le ligand de la glycoprotéine plaquettaire GPIIb-IIIa. - Le fibrinogène participe t’il à la coagulation plasmatique ? Si oui, de quelle façon ? - Le fibrinogène joue t’il un rôle dans l’hémostase primaire ? Si oui, de quelle façon ? - Citer d’autres substrats de la thrombine