JUIN 2010 MICROBIOLOGIE BTS ABM – 1e année – BTS Blanc AFBB Page 1 BREVET DE TECHNICIEN SUPERIEUR ANALYSES DE BIOLOGIE MEDICALE Epreuve E4 – Unité U42 Microbiologie Documents et calculatrice interdits DUREE DE L’EPREUVE : 2h00 Les Pseudomonas sont des bactéries saprophytes que l'on rencontre dans les sols, sur les végétaux et surtout dans les eaux douces. Pseudomonas aeruginosa ou bacille pyocyanique est de loin, dans le genre Pseudomonas, l'espèce la plus fréquemment isolée en bactériologie médicale. Peu abondant chez le sujet sain, il occasionne de nombreuses infections opportunistes. Il est à l'origine de 10% des infections nosocomiales. JUIN 2010 MICROBIOLOGIE BTS ABM – 1e année – BTS Blanc AFBB Page 2 1e PARTIE : Etude des caractères phénotypique des Pseudomonas 1. Définir les mots ou expressions suivants : - saprophyte ; - infection opportuniste ; - infection nosocomiale. 2. Les Pseudomonas sont des bactéries à Gram négatif. 2.1. Décrire l’aspect des cellules de cette espèce lors d’une observation au microscope optique après coloration de Gram. 2.2. Citer les molécules composant la paroi de ces bactéries. 2.3. Représenter de manière détaillée la molécule de cette paroi ayant une fonction antigénique. 3. Les Pseudomonas sont des bactéries mobiles. 3.1. Décrire l’aspect des cellules de cette espèce au microscope optique lors d’un examen « à l’état frais ». 3.2. Représenter schématiquement la ciliature de ces bactéries. 4. Les Pseudomonas sont des bactéries prototrophes, hétérotrophes et chimioorganotrophes. Donner la signification de ces types trophiques. 5. Les Pseudomonas sont des bactéries aérobies strictes. 5.1. Décrire une technique permettant de mettre en évidence ce caractère. 5.2. Donner et justifier le résultat obtenu après incubation. 6. Donner le nom de l’enzyme respiratoire présente chez P. aeruginosa, pour laquelle le substrat artificiel utilisé pour sa mise en évidence est le dichlorure de N,N,N,N-tétraméthyl-1,4phénylénediamine. Présenter le protocole de réalisation et de lecture de ce test. 7. En l’absence de dioxygène, Pseudomonas aeruginosa est capable de se développer en présence d’un autre accepteur final d’électrons, l’ion nitrate. 7.1. Comment appelle-t-on ce phénomène ? 7.2. Préciser le nom de l’enzyme catalysant la réaction. 7.3. Expliquer la mise en évidence de cette enzyme au laboratoire. JUIN 2010 MICROBIOLOGIE BTS ABM – 1e année – BTS Blanc AFBB Page 3 8. Le milieu de référence pour l’isolement de P. aeruginosa est la gélose cétrimide, dont la composition est fournie ci-dessous (pour un litre de milieu) : peptone de gélatine peptone de caséine bromure de tétradonium (cétrimide) sulfate de potassium chlorure de magnésium agar pH = 7,1 16,0 g 10,0 g 0,2 g 10,0 g 1,4 g 10,0 g 8.1. Analyser la composition de ce milieu. 8.2. Les colonies obtenues sont vertes et fluorescentes sous rayonnement ultra-violet. Expliquer pourquoi. 9. Le système API® 20 NE permet l’identification de P. aeruginosa. Il comporte la recherche du caractère « PNPG ». L’enzyme catalysant l’hydrolyse de ce substrat synthétique est codée par un gène faisant partie de l’opéron lactose. 9.1. Donner le principe du test « PNPG » (ou du test « ONPG » en macrométhode). 9.2. Nommer l’enzyme recherchée. 9.3. Définir le terme « opéron ». 9.4. Expliquer succinctement la régulation de l’expression des gènes de l’opéron lactose. 2e PARTIE : Comportement des Pseudomonas vis à vis des agents antimicrobiens 1. Définir brièvement la stérilisation, la désinfection et l’antisepsie. 2. La sélectivité de la gélose au cétrimide peut être renforcée par l’ajout d’un antibiotique, l’acide nalidixique. P. aeruginosa possède une résistance naturelle à l’acide nalidixique. 2.1. A quelle famille appartient cet antibiotique ? 2.2. Quel est son mode d’action ? 2.3. Définir la résistance naturelle. 2.4. Un antibiotique peut être bactériostatique ou bactéricide. Définir ces termes. 2.5. Le spectre d’activité de l’ofloxacine est plus large que celui de l’acide nalidixique. Définir le spectre d’activité d’un agent antimicrobien. JUIN 2010 MICROBIOLOGIE BTS ABM – 1e année – BTS Blanc AFBB Page 4 3. La ticarcilline (formule ci-dessous), la pipéracilline et la ceftazidime (céphalosporine 3e génération) sont actives sur P. aeruginosa. 3.1. A quelle famille ces antibiotiques appartiennent-ils ? 3.2. Nommer et représenter la partie active de la molécule. 3.3. Expliquer la notion de génération en ce qui concerne la classification des céphalosporines. 4. Certaines souches (10 à 20 %) de P. aeruginosa présentent une résistance vis à vis des antibiotiques de cette famille (question précédente). Cette résistance est liée à la présence d’une enzyme inactivant l’antibiotique, et dont la synthèse est déréprimée. 4.1. Donner le nom de cette enzyme et localiser précisément son site d’action sur la molécule d’antibiotique. 4.2. Expliquer la mise en évidence de cette enzyme au laboratoire. 5. Pour contrer cette résistance, la ticarcilline peut être associée à l’acide clavulanique, molécule dont l’activité antibactérienne intrinsèque est faible. Pourtant, l’activité antibactérienne de la ticarcilline est restaurée par cette association. Expliquer le rôle de l’acide clavulanique. 6. La résistance de P. aeruginosa aux aminosides est également fréquente. Des enzymes (phosphotransférases, acétyltransférases…) modifient l’antibiotique qui est ainsi inactivé. Il s’agit d’une résistance extra-chromosomique. 6.1. Quel est le mode d’action des aminosides ? 6.2. Citer un exemple d’aminoside. 6.3. Quels sont les supports génétiques de la résistance extra-chromosomique ? 6.4. Pourquoi les résistances extra-chromosomiques sont-elles redoutées, notamment en milieu hospitalier ? 7. Afin d’adapter convenablement le traitement du malade infecté par P. aeruginosa, il est nécessaire de déterminer in vitro l’activité des antibiotiques sur ce germe (document 1). 7.1. Proposer un protocole complet permettant de déterminer cette activité à partir d’une souche de P. aeruginosa isolée sur milieu tryticase-soja en boite de Pétri. 7.2. Interpréter le résultat obtenu pour le disque repéré sur le document 1. 7.3. Une méthode alternative est proposée dans le document 2. - Exposer le principe de cette méthode. - Définir et déterminer la CMI en chloramphénicol pour la souche testée. JUIN 2010 MICROBIOLOGIE BTS ABM – 1e année – BTS Blanc Document 1 A rendre avec la copie Antibiogramme par la méthode des disques Conclusion : AFBB Page 5 JUIN 2010 MICROBIOLOGIE BTS ABM – 1e année – BTS Blanc Document 2 A rendre avec la copie E-test (antibiotique testé : chloramphénicol ; unité µg.mL-1) CMI = AFBB Page 6