Le sujet proposé a un caractère pluridisciplinaire

BTS BIOANALYSES ET CONTROLES
1e année - TP n°1
AFBB
TECHNIQUES DE MICROBIOLOGIE
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BREVET DE TECHNICIEN SUPERIEUR
BIOANALYSES ET CONTROLES
Techniques de microbiologie
Au cours de l’épreuve, le jury appréciera les qualités d’organisation, le respect des règles d’hygiène
et de sécurité en laboratoire.
Pour une bonne réalisation de l’épreuve, une gestion optimale du temps imparti est nécessaire en
fonction des temps d’incubation. Le candidat prendra soin de bien lire l’ensemble du sujet avant de
commencer les manipulations.
Tous les milieux ensemencés (boites, tubes) doivent être identifiés avec vos initiales inscrites au
feutre indélébile.

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Observation et culture des micro-organismes
1. Les manipulations stériles en microbiologie
1.1. Notions théoriques
Tous les instruments du microbiologiste devront être stériles et utilisés dans la zone de travail stérile créée
par le bec Bunsen (zone d’environ 30 cm de diamètre). Les prélèvements et les transferts de produits
devront être effectués dans cette zone stérile. Le poste de travail de microbiologie met en jeu une
organisation précise des différents matériels. Cette organisation doit permettre d’assurer la stérilité du
travail.
Organisation du poste de travail en microbiologie (pour un droitier) :
1.2. Manipulation
But : transférer avec une pipette Pasteur quelques gouttes d’eau stérile dans un milieu de culture en
bouillon stérile aussi. Après incubation, le bouillon ne devrait montrer aucun signe de développement
bactérien si le transfert à été effectué en conditions stériles.
Mode opératoire : prendre une pipette Pasteur, casser l’extrémité et stériliser celle-ci par passage rapide
dans la flamme du bec Bunsen. Effectuer le prélèvement d’eau stérile et transférer celle-ci dans le
bouillon. Homogénéiser le bouillon par mouvement de rotation. Incuber 24 heures à 37°C.
1.3. Compte-rendu (après lecture lors du 2e jour)
Observer le tube.
Présenter le résultat obtenu ci-dessous et conclure en ce qui concerne la qualité du travail réalisé (stérilité
de la manipulation).

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2. Observation microscopique de micro-organismes
2.1. Notions théoriques
Un champ microscopique ou champ d’observation est la zone d’observation éclairée qui apparaît au
manipulateur lors d’une observation au microscope. Le diamètre du champ microscopique est fonction de
l’objectif utilisé.
2.2. Manipulation
2.2.1. Observation de levures
Mode opératoire : dans un tube contenant 5 mL d’eau physiologique stérile, introduire à l’aide d’une
pince Brucelles un « grain » de levure de boulanger lyophilisée. Noter le tube « S ». Homogénéiser au
« Vortex ». Déposer à l’aide d’une pipette Pasteur, une petite goutte de cette suspension de
Saccharomyces cerevisiae au centre d’une lame et recouvrir la goutte d’une lamelle. Observer aux
objectifs x10 puis x40.
2.2.2. Observation de moisissures
Mode opératoire : déposer à l’aide d’une pipette Pasteur au centre d’une lame une goutte de bleu de
méthylène. Prélever quelques filaments de Penicillium (moisissure du fromage) et les dissocier dans le
colorant. Recouvrir d’une lamelle et observer aux objectifs x10 puis x40.
2.2.3. Observation de bactéries lactiques
ETAT-FRAIS
FROTTIS COLORE (GRAM)
Déposer au centre d’une lame à l’aide d’une pipette Pasteur,
une petite goutte de lait fermenté.
Recouvrir la goutte d’une lamelle.
Observer à l’objectif x40.
Procéder au dépôt comme pour l’état-frais, puis étaler la
goutte sur les ¾ de la lame. Laisser sécher complètement le
frottis. Fixer les bactéries en passant la lame trois fois dans la
flamme du bec Bunsen. Laisser refroidir.
Réaliser la coloration de Gram (Cf. fiche technique
« examens microscopiques »).
Laisser sécher. Observer aux objectifs x40 puis x100 à
immersion.

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2.2.4. Observation de bactéries dans un bouillon de culture
A partir du bouillon « B » fourni en tube à hémolyse, effectuer les mêmes examens que précédemment
(état-frais, Gram).
2.3. Compte-rendu
Représenter schématiquement les micro-organismes observés.
Décrire leurs morphologies respectives (et le mode de groupement pour les bactéries).
3. La culture des micro-organismes
3.1. Notions théoriques
Dans la plupart des laboratoires de microbiologie (ceux qui pratiquent des analyses dites « de routine » :
laboratoires d’analyses médicales, laboratoires de contrôles agro-alimentaires ou cosmétiques…), le
travail est basé sur l’identification des micro-organismes, et éventuellement leur dénombrement. La
première étape de ce travail est de réussir à isoler le micro-organisme afin de n’étudier que celui-ci. Les
bactéries et les levures forment sur milieu solide des colonies visibles à l’œil nu. Une colonie est
généralement formée par la division d’une seule cellule : elle donc normalement constituée d’individus
identiques. L’étude des différents caractères (morphologiques, culturaux, biochimiques ou antigéniques)
peut donc être pratiquée sur cette colonie, afin d’identifier l’espèce l’ayant formée.
L'isolement est une technique qui permet de séparer les bactéries d’une suspension monomicrobienne
polymicrobienne. L'isolement permet d'obtenir des colonies espacées les unes des autres, afin de les
observer et les caractériser. Pour ce faire, on utilise une anse de platine ou une pipette Pasteur boutonnée.
L’ensemenceur est stérilisé avant utilisation.
3.2. Manipulation
3.2.1. Préparation de boites de Pétri contenant un milieu solide stérile
But : obtenir un milieu en boite de Pétri prêt à l’emploi pour une analyse et montrer l’importance des
conditions de réalisation de cette opération.
Mode opératoire : les boites de Pétri sont fournies vides et stériles. Le milieu de culture (gélose
« Sabouraud » pour les levures et « MRS » pour les bactéries lactiques) stérile est fourni en flacon placé à
100°C pendant 15 minutes puis maintenu « en surfusion » à environ 50°C. Introduire dans trois boites, à
proximité du bec Bunsen, une couche d’environ 4 mm de milieu gélosé en surfusion.

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Laisser solidifier pendant quelques minutes de la façon suivante :
Poser le couvercle sur chaque boite après solidification.
3.2.2. Ensemencement d’un milieu liquide
But : obtenir une culture de levures dans un milieu nutritif liquide.
Mode opératoire :
Introduire stérilement une goutte de suspension de levures « S » dans le bouillon fourni.
Incuber 24 heures à 37°C.
3.2.3. La technique de l’isolement
But : obtenir des colonies de micro-organismes isolées sur milieu solide en boite de Pétri à partir :
- de la suspension de levures « S » sur milieu Sabouraud coulé en boite de Pétri ;
- du lait fermenté sur milieu MRS coulé en boite de Pétri ;
- du bouillon « B » sur milieu Trypticase-Soja fourni.
Mode opératoire :
Suivre les instructions de la fiche « la technique d’isolement ».
Incuber les boîtes retournées 24 heures à 37°C.
3.3. Compte-rendu (après lecture lors du 2e jour)
Décrire les colonies obtenues (Cf. fiche « la technique d’isolement »).