3. Détermination de l`activité antimicrobienne de l`eau de mer

BTS BIOANALYSES ET CONTROLES
TECHNIQUES DE MICROBIOLOGIE
1e année - TP n°14
AFBB
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BREVET DE TECHNICIEN SUPERIEUR
BIOANALYSES ET CONTROLES
Epreuve E5 – Unité U52
Techniques de microbiologie
Au cours de l’épreuve, le jury appréciera les qualités d’organisation, le respect des règles d’hygiène
et de sécurité en laboratoire.
Pour une bonne réalisation de l’épreuve, une gestion optimale du temps imparti est nécessaire en
fonction des temps d’incubation. Le candidat prendra soin de bien lire l’ensemble du sujet avant de
commencer les manipulations.
Documents interdits – Calculatrice autorisée
1er JOUR – DUREE DE L’EPREUVE : 3h00
Durant l’été 1999, une mortalité massive des grands invertébrés marins et notamment des coraux et des
gorgones, a été observée en Méditerranée.
On noté une augmentation de la température de l’eau de mer d’environ 5°C entre 0 et 45 mètres de
profondeur durant les semaines précédant la nécrose. Cette hausse de la température aurait pu être
bénéfique à la prolifération de micro-organismes, susceptibles de participer à ce phénomène de nécrose.
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Recherche des causes de mortalité chez les gorgones de Méditerranée
1. Dénombrement des espèces revivifiables aérobies mésophiles sur les gorgones nécrosées
Un filtrat « F » en eau physiologique stérile a été obtenu à partir d’une gorgone nécrosée.
On réalise le dénombrement sur milieu 2216E de composition suivante pour un litre :

agar
15 g

peptone
5g

extrait de levure
1g

orthophosphate ferrique
0,1 g

eau de mer
750 mL

eau distillée
250 mL
1.1. Matériels et réactifs
 un tube à essais contenant le filtrat « F »
 un flacon de 120 mL de gélose 2216E en surfusion
 6 boîtes de Pétri stériles
 8 pipettes de 1 mL
 tubes d’eau physiologique stérile de 9 mL
 1 tube d’eau physiologique stérile de 5 mL
1.2. Mode opératoire
Mesurer l’absorbance à 600 nm du filtrat « F ».
En déduire les dilutions à effectuer pour réaliser le dénombrement demandé sachant que 1 UA
correspond à 109 bactéries par mL.
Ensemencer dans la masse (v = 1mL) les boîtes de Pétri avec les dilutions appropriées.
Incuber 24 heures à 30°C.
1.3. Compte rendu
Estimer la concentration bactérienne dans le filtrat « F »
Justifier le choix des dilutions ensemencées.
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2. Identification d’une souche microbienne retrouvée en quantité importante sur les
gorgones nécrosées
2.1. Matériels et réactifs
 culture de la souche à identifier sur gélose 2216E inclinée
 culture de la souche à identifier en bouillon 2216E
 un tube d’eau physiologique stérile de 5 mL
 lames et colorants pour coloration de Gram
 disques oxydase et peroxyde d’hydrogène
2.2. Mode opératoire et compte-rendu
Effectuer les observations microscopiques nécessaires puis un test enzymatique approprié.
Appeler un examinateur pour les observations microscopiques.
Indiquer les résultats des examens microscopiques et du test enzymatique sur le compte-rendu.
Proposer sur le compte rendu une liste de milieux à ensemencer pour la vérification des caractères de
la souche test (la galerie choisie devra être en microméthode).
Cette partie du compte-rendu devra être rendue 60 minutes avant la fin de l'épreuve.
Ensemencer les milieux fournis.
Incuber les milieux
Préciser la température d’incubation souhaitée sur le compte-rendu.
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3. Détermination de l’activité antimicrobienne de l’eau de mer (pouvoir auto-épurateur)
On désire déterminer la concentration minimale inhibitrice (CMI) de cette souche vis à vis du chlorure de
sodium (NaCl).
3.1. Matériels et réactifs
 culture de la souche en bouillon 2216E (utilisée en 2e partie)
 un tube de bouillon nutritif salé : [NaCl] = 100 g.L-1
 deux tubes de bouillon nutritif « ordinaire » stérile (10 mL)
 tubes à hémolyse stériles
 pipettes sérologiques de 2 mL stériles
 une anse calibrée de 10 µL
3.2. Mode opératoire
3.2.1. Préparation d’une suspension bactérienne à 106 bactéries par mL
Réaliser une dilution au 1/1000e en bouillon ordinaire de la culture de la souche en
bouillon 2216E. On obtient ainsi une suspension bactérienne à environ 106 bactéries par
mL.
3.2.2. Réalisation de la gamme de dilution du NaCl et mise en culture
En tubes à hémolyse stériles, préparer une série de 8 dilutions de la façon suivante :
Tube
Bouillon salé
Bouillon ordinaire stérile
Suspension à 106 B/mL
1
2
3
4
5
6
7
8
1,5
1,3
1,1
0,9
0,7
0,5
0,3
0,1
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
1,4
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
Prévoir le témoin nécessaire.
Incuber 24 heures à 30°C.
3.3. Compte rendu
Expliquer la préparation de la suspension à environ 106 bactéries par mL.
Calculer les concentrations finales en NaCl dans chaque tube.
Donner la composition et le rôle du témoin réalisé.
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Au cours de l’épreuve, le jury appréciera les qualités d’organisation, le respect des règles d’hygiène
et de sécurité en laboratoire.
Pour une bonne réalisation de l’épreuve, une gestion optimale du temps imparti est nécessaire en
fonction des temps d’incubation. Le candidat prendra soin de bien lire l’ensemble du sujet avant de
commencer les manipulations.
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2e JOUR – DUREE DE L’EPREUVE : 1h30
Durant l’été 1999, une mortalité massive des grands invertébrés marins et notamment des coraux et des
gorgones, a été observée en Méditerranée.
On noté une augmentation de la température de l’eau de mer d’environ 5°C entre 0 et 45 mètres de
profondeur durant les semaines précédant la nécrose. Cette hausse de la température aurait pu être
bénéfique à la prolifération de micro-organismes, susceptibles de participer à ce phénomène de nécrose.
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Recherche des causes de mortalité chez les gorgones de Méditerranée
1. Dénombrement des espèces revivifiables aérobies mésophiles sur les gorgones nécrosées
Compter les colonies.
Présenter les résultats sous forme de tableau.
Calculer le nombre de bactéries revivifiables aérobies par mL de filtrat.
Conclure sachant que les numérations sur l’eau de mer et les filtrats de gorgones saines ont donné les
résultats suivants :
 eau de mer :
6,0.102 UFC.mL-1
 filtrat de gorgone saine :
1,0.106 UFC.mL-1
2. Identification d’une souche microbienne retrouvée en quantité importante sur les
gorgones nécrosées
Procéder aux lectures.
Identifier le micro-organisme.
3. Détermination de l’activité antimicrobienne de l’eau de mer (pouvoir auto-épurateur)
Définir et déterminer la concentration minimale inhibitrice en NaCl.
Conclure sur le pouvoir auto-épurateur de l’eau de mer
Donnée : concentration en NaCl de l’eau de mer : 35 g.L-1.