Milieu de Mossel pour Bacillus cereus

BTS BIOANALYSES ET CONTROLES
1e année - TP n°16
AFBB
TECHNIQUES DE MICROBIOLOGIE
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BREVET DE TECHNICIEN SUPERIEUR
BIOANALYSES ET CONTROLES
Epreuve E5 – Unité U52
Techniques de microbiologie
Au cours de l’épreuve, le jury appréciera les qualités d’organisation, le respect des règles d’hygiène
et de sécurité en laboratoire.
Pour une bonne réalisation de l’épreuve, une gestion optimale du temps imparti est nécessaire en
fonction des temps d’incubation. Le candidat prendra soin de bien lire l’ensemble du sujet avant de
commencer les manipulations.
Documents interdits – Calculatrice autorisée
1er JOUR – DUREE DE L’EPREUVE : 3h00
Les techniques d’analyses microbiologiques de l’alimentation animale sont les mêmes que celles utilisées
pour l’alimentation humaine. Il n’y a pas de normes officielles, mais la qualité microbiologique de
l’aliment doit respecter un cahier des charges établi par chaque fabricant.
Le cahier des charges d’un industriel présente les mentions suivantes :
CRITERES
SEUIL MAXIMAL
Micro-organismes revivifiables à 30°C par gramme de produit
107
Bacillus cereus par gramme de produit
104
Staphylococcus aureus par gramme de produit
103
Salmonella pour 25 grammes de produit
Absence
Listeria monocytogenes pour 25 grammes de produit
Absence
Moisissures par gramme de produit
102
Antibiotiques
Absence
On se propose de vérifier le respect de plusieurs aspects mentionnés dans le cahier des charges.

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CONTROLE MICROBIOLOGIQUE DES TOURTEAUX DE SOJA
DESTINES A L’ALIMENTATION ANIMALE
1. Dénombrements
10 grammes de tourteaux de soja ont été introduits puis broyés dans 90 mL de milieu tryptone sel pendant
5 minutes. 5 mL de suspension mère sont fournis en tube étiqueté « S ».
1.1. Matériels et réactifs
 suspension mère « S »
 7 tubes de milieu tryptone sel stérile de 9 mL
 pipettes stériles de 1 mL
 12 tubes contenant 9 mL d’eau peptonée stérile
 3 milieux de Mossel en boîte de Pétri
 3 milieux de Baird Parker en boîte de Pétri
 pipette automatique P200 et cônes stériles
 billes de verre stériles
1.2. Réalisation des dilutions décimales
Effectuer, en milieu tryptone sel, 7 dilutions décimales de la suspension S.
1.3. Dénombrement en milieu liquide des micro-organismes revivifiables à 30°C
Ensemencer les tubes d’eau peptonée avec 1 mL des dilutions 10-4 à 10-7 de la suspension « S » en triple
essai. Homogénéiser chaque tube. Incuber 24 heures à 30°C.
1.4. Dénombrement des Bacillus cereus
Ensemencer en surface (v = 0,1 mL) sur milieu de Mossel, en simple essai, la suspension mère « S » et
chacune des dilutions 10-1 et 10-2. Incuber 24 heures à 30°C.
1.5. Dénombrement des Staphylococcus aureus
Prélever 1 mL de suspension mère « S » et répartir l’inoculum sur trois milieux de Baird Parker (soit
environ trois fois 0,33 mL). Incuber 24 heures à 30°C.
1.6. Compte-rendu
Pour chaque dénombrement, justifier le choix de la technique utilisée (milieu, dilutions et volumes
ensemencés). La composition des milieux est fournie en annexe.

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2. Confirmation de la présence de Bacillus cereus par identification en
microméthode et recherche d’enzymes spécifiques
Après un dénombrement sur milieu de Mossel, une colonie typique a été isolée sur gélose Trypticase soja.
2.1. Matériels et réactifs
 culture de la souche à identifier
 un tube d’eau physiologique stérile de 5 mL
 gélose viande-foie en surfusion
 gélose trypticase soja en boîte de Pétri
 Galerie API 20E
 étalon 2 de Mac Farland
 gélose au lait en boîte de Pétri
 gélose à l’amidon en boîte de Pétri
 disques oxydase et peroxyde d’hydrogène
2.2. Mode opératoire
Effectuer les observations microscopiques nécessaires puis un test d’orientation rapide.
Ensemencer les milieux fournis.
2.3. Compte rendu
Indiquer les résultats des observations microscopiques et du test d’orientation rapide.
Conclure.
3. Recherche de Listeria monocytogenes et de Salmonella
25 grammes de tourteaux de soja ont été introduits puis broyés dans 225 mL d’eau peptonée. Après
incubation 18 heures à 37°C, 1 mL de ce milieu de préenrichissement est fourni en tube à hémolyse noté
« P ».
3.1. Matériels et réactifs
 milieu de préenrichissement « P »
 lames et réactifs pour coloration de Gram
 un milieu de Agosti et Ottaviani coulé en boite de Pétri
 un milieu SM2 coulé en boite de Pétri

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3.2. Mode opératoire
Effectuer les observations microscopiques nécessaires.
Isoler sur les milieux fournis.
3.3. Compte rendu
Indiquer les résultats des observations microscopiques et conclure.
4. Détection d’antibiotiques dans les tourteaux
L’objectif de cette recherche est de déceler la présence d’antibiotiques promoteurs de croissance. La
viande commercialisée « Label Rouge » doit être exempte d’antibiotiques. La détection est réalisée par
une méthode de diffusion en milieu gélosé. Deux extraits de tourteaux sont analysés.
4.1. Matériels et réactifs
 culture de Micrococcus en bouillon nutritif
 un tube de 10 mL de milieu Mueller-Hinton en surfusion
 deux extraits de tourteaux A et B
 une solution d’antibiotique notée T
 un milieu Mueller-Hinton en boite de Pétri stérile
 une pipette stérile de 1 mL
 emporte pièce
4.2. Mode opératoire
Introduire 0,5 mL de culture de Micrococcus dans le tube de milieu Mueller-Hinton.
Couler en boite de Pétri sur le milieu Mueller-Hinton fourni.
Laisser solidifier sur une surface horizontale.
Creuser dans la gélose six puits à l’aide de l’emporte pièce.
Déposer 1 goutte de chaque extrait et de la solution témoin dans les puits.
Incuber 24 heures à 37°C.

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Annexe 1
Milieu de Mossel pour Bacillus cereus
Composition :
Peptone 10,0 g
Extrait de viande 1,0 g
Mannitol 10,0 g
Jaune d'oeuf à 20 % 10 %
Sulfate de Polymyxine B 0,01 g
Rouge de phénol 0,025 g
Chlorure de sodium 10,0 g
Agar 14,0 g
pH=7,2
Préparation :
40 g par litre. Autoclavage classique.
Le jaune d'œuf est ajouté après stérilisation du milieu à l'autoclave dans le milieu en surfusion à raison de 10 %
environ de l'émulsion à 20 %.
Lecture :
Les colonies rouges sont mannitol -. Les colonies jaunes sont mannitol +. Les colonies entourées d'un halo de précipitation
sont lécithinase +. En règle générale, le halo trouble dépasse le halo clair dû à la lipoprotéase pour Bacillus cereus. Les
bactéries cultivant résistent à la polymyxine. Bacillus cereus est mannitol - et lécithinase +.
Annexe 2
Milieu Baird-Parker pour Staphylococcus aureus
Composition :
peptone 10,0 g
extrait de viande de boeuf 4,0 g
extrait de levure 2,0 g
pyruvate de sodium 10,0 g
glycocolle 12,0 g
émulsion de jaune d'oeuf 50,0 cm3
Tellurite de potassium 0,1 g
Chlorure de lithium 5,0 g
Agar 20,0 g
pH = 7,2
Préparation :
63 g par litre. Le milieu de base est autoclavé. Tellurite et jaune d’œuf sont ajoutés ensuite à raison de 1 cm3 pour 20 cm3 de
milieu de base. De la sulfaméthazine peut être ajoutée pour inhiber Proteus.
Lecture :
Trois caractères sont lus :
- la présence d'une lipoprotéinase par un halo transparent autour des colonies ;
- la présence d'une lécithinase par un halo trouble autour des colonies ;
- la réduction du tellurite en tellure noir par la couleur de la colonie.
S. aureus est lipoprotéinase + (en général), lécithinase + et réduit le tellurite en tellure. (colonies noires de 1 à 2 mm de
diamètre).