Microbiologie et technologies d`analyse

BTS BIOANALYSES ET CONTROLES
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Pour le vendredi 2 octobre 2009
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LE BIOETHANOL
Le bioéthanol est un biocarburant destiné aux moteurs à essence. Il est produit à partir d’amidon
provenant de céréales ou de pommes de terre ou à partir de saccharose provenant de betteraves ou de
canne à sucre. Par des procédés de fermentation industrielle, ces substrats végétaux sont transformés en
éthanol. En 2003, la production mondiale de bioéthanol s'est élevée à 22 milliards de litres.
1. Production de bioéthanol par Klebsiella oxytoca P2
Des études ont été réalisées pour produire de l’éthanol comme biocarburant, à partir de l’amidon de
pomme de terre. La fermentation du maltose et de l’amidon par une souche de Klebsiella oxytoca P2 est
étudiée dans des bioréacteurs de laboratoire de deux litres.
1.1. Caractères bactériologiques de la souche productrice
1.1.1. Le document 1 fournit une coupe transversale de l’ensemble membrane-paroi de
Klebsiella oxytoca.
- Légender le schéma (à rendre avec la copie).
- Donner le principe de la coloration de Gram et indiquer le résultat obtenu pour
Klebsiella oxytoca.
1.1.2. Klebsiella oxytoca est une bactérie capsulée.
- Quelle est la nature chimique de cette capsule ?
- En déduire l’aspect macroscopique des colonies de Klebsiella oxytoca.
- Comment la capsule peut-elle être simplement mise en évidence lors d’un
examen microscopique ?
- Quelles sont les propriétés biologiques conférées par la capsule ?
1.1.3. Donner les types trophiques de Klebsiella oxytoca vis à vis du carbone et de
l’énergie.
1.1.4. Proposer un protocole permettant la mise en évidence de la voie d’attaque du
maltose chez Klebsiella oxytoca P2. Indiquer le résultat attendu.
1.1.5. On ensemence une gélose à l’amidon avec Klebsiella oxytoca P2.
- Quel réactif utilise-t-on pour la lecture après incubation ?
- Qu’observe-t-on dans le cas d’une réaction positive ?

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1.1.6. Le profil numérique obtenu avec Klebsiella oxytoca P2 en galerie miniaturisée API
20E est le suivant :
5 244 773
- Expliquer le principe de l’identification probabiliste.
- Compléter la fiche de résultats fournie dans le document 2 (à rendre avec la
copie).
- Indiquer la signification biochimique d’un caractère « VP+ ».
- Préciser à l’aide du document 2 si les caractères obtenus sont conformes à ceux
habituellement rencontrés chez Klebsiella oxytoca.
- L’indice de typicité de la souche étudiée est-il égal à 1 ? Justifier.
1.2. Etude de la croissance de Klebsiella oxytoca P2 en bouillon de Luria
Une préculture de Klebsiella oxytoca P2 en milieu de Luria (milieu « LB » dont la composition est
donnée ci-dessous) est ensemencée dans une fiole d’Erlenmeyer contenant 100 mL de milieu LB
stérile. La croissance à 37°C est suivie par méthode turbidimétrique à 600 nm.
Composition du milieu « LB » (Luria Broth)
Peptone 10 g
Extrait de levure 5 g
NaCl 5 g
1.2.1. Donner le(s) rôle(s) des constituants du milieu LB.
1.2.2. Quel est le principe de la méthode turbidimètrique ?
1.2.3. L’absorbance initiale de la culture est égale à 0,165. Il n’y a pas de phase de
latence. En fin de phase exponentielle, l’absorbance corrigée est égale à 2,460. Le
taux de croissance est égal à 0,9 h-1.
- Pourquoi l’absorbance est-elle dite « corrigée » ?
- Expliquer l’absence de phase de latence.
- Calculer la concentration bactérienne initiale (Donnée : 0,1 unité d’absorbance
à 600 nm correspond à une suspension d’environ 108 bactéries par mL.
- Définir et déterminer le temps de génération.
- Calculer la durée de la phase exponentielle.

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1.3. Fermentation de Klebsiella oxytoca P2 et production d’éthanol
1.3.1. La production industrielle de bioéthanol peut également être réalisée avec des
levures de l’espèce Saccharomyces cerevisiae. Comparer la structure cellulaire
d’une levure avec celle d’une bactérie.
1.3.2. Dans quatre fermenteurs contenant 0,8 L de bouillon de Luria, on introduit un
substrat :
- 50 g de maltose dans le premier,
- 10 ; 20 et 40 g d’amidon respectivement dans le second, troisième et dernier
fermenteur.
Les conditions de fermentation sont les suivantes : anaérobiose, pH = 6,
température = 30°C, agitation = 100 rpm.
- A t = 0, un volume V de préculture est ajouté dans chaque fermenteur de façon
à obtenir une biomasse initiale de 0,033 mg.mL-1. Sachant que la préculture
présente une absorbance de 0,5 UA à 600 nm, calculer le volume V de
préculture ajoutée dans chaque fermenteur (Donnée : 0,1 unité d’absorbance à
600 nm correspond à une biomasse de 0,033 mg.mL-1).
- Calculer les concentrations finales en substrat glucidique dans chaque
fermenteur.
- Quel apport doit être effectué pendant la fermentation afin de maintenir le pH
constant ? Justifier.
1.3.3. Les résultats obtenus sont représentés graphiquement dans les documents 3 et 4.
Exploiter ces documents afin de compléter le tableau fourni dans le document 5 (à
rendre avec la copie), après avoir donné les formules littérales permettant de
calculer le rendement de conversion et la productivité volumétrique. Quelle
condition de fermentation semble la plus intéressante sur le plan industriel pour
produire de l’éthanol ?

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2. Etude de bactéries phytopathogènes
Les bactéries de l’espèce Pectobacterium carotovora (anciennement Erwinia carotovora) provoquent des
dégâts substantiels à des cultures économiquement importantes et aux récoltes stockées. Ces bacilles
Gram négatif sont responsables chez la pomme de terre de maladies telles que la « pourriture noire ».
2.1. Pouvoir pathogène de Pectobacterium carotovora : étude du document 6
2.1.1. Le pouvoir pathogène des bactéries peut se manifester selon deux processus parfois
associés. Les citer et les définir.
2.1.2. Identifier la sous-espèce responsable de la maladie dans les régions où le climat est
tempéré. Quelle est la conclusion de l’étude en ce qui concerne le pouvoir
pathogène de cette bactérie ?
2.1.3. Quelle solution pourrait être envisagée pour contrôler la maladie ?
2.1.4. Le pouvoir pathogène des genres Klebsiella et Pectobacterium s’exprime chez des
hôtes appartenant à des règnes différents. Pourtant ces deux genres appartiennent à
la même famille.
- Donner le nom de cette famille et préciser ses principaux caractères.
- Sans les développer, citer les méthodes moléculaires utilisées pour comparer les
bactéries à des fins taxonomiques.
2.2. Isolement et mise en évidence des bactéries responsables
Le document 7 présente le protocole d’isolement de Pectobacterium sur milieu CVP.
2.2.1. Quel caractère est utilisé pour mettre en évidence ce genre bactérien sur le milieu
CVP ? Préciser le nom du substrat utilisé et l’aspect des colonies recherchées.
2.2.2. Un autre composé joue un rôle sélectif dans ce milieu. Indiquer son nom et son
spectre d’action.

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Feuille à rendre avec la copie
Document 1
Document 2
API 20 E
ONPG
ADH
LDC
ODC
CIT
H2S
URE
TDA
IND
VP
GEL
GLU
MAN
INO
SOR
RHA
SAC
MEL
AMY
ARA
OX
Klebsiella oxytoca
99
0
80
0
89
0
78
0
99
80
0
100
100
99
100
99
99
100
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100
0