BTS BIOANALYSES ET CONTROLES AFBB Pour le vendredi 2 octobre 2009 Microbiologie et technologies d'analyse Page 1 / 8 Devoir maison 08 INI B Microbiologie et technologies d'analyse LE BIOETHANOL Le bioéthanol est un biocarburant destiné aux moteurs à essence. Il est produit à partir d’amidon provenant de céréales ou de pommes de terre ou à partir de saccharose provenant de betteraves ou de canne à sucre. Par des procédés de fermentation industrielle, ces substrats végétaux sont transformés en éthanol. En 2003, la production mondiale de bioéthanol s'est élevée à 22 milliards de litres. 1. Production de bioéthanol par Klebsiella oxytoca P2 Des études ont été réalisées pour produire de l’éthanol comme biocarburant, à partir de l’amidon de pomme de terre. La fermentation du maltose et de l’amidon par une souche de Klebsiella oxytoca P2 est étudiée dans des bioréacteurs de laboratoire de deux litres. 1.1. Caractères bactériologiques de la souche productrice 1.1.1. Le document 1 fournit une coupe transversale de l’ensemble membrane-paroi de Klebsiella oxytoca. - Légender le schéma (à rendre avec la copie). - Donner le principe de la coloration de Gram et indiquer le résultat obtenu pour Klebsiella oxytoca. 1.1.2. Klebsiella oxytoca est une bactérie capsulée. - Quelle est la nature chimique de cette capsule ? - En déduire l’aspect macroscopique des colonies de Klebsiella oxytoca. - Comment la capsule peut-elle être simplement mise en évidence lors d’un examen microscopique ? - Quelles sont les propriétés biologiques conférées par la capsule ? 1.1.3. Donner les types trophiques de Klebsiella oxytoca vis à vis du carbone et de l’énergie. 1.1.4. Proposer un protocole permettant la mise en évidence de la voie d’attaque du maltose chez Klebsiella oxytoca P2. Indiquer le résultat attendu. 1.1.5. On ensemence une gélose à l’amidon avec Klebsiella oxytoca P2. - Quel réactif utilise-t-on pour la lecture après incubation ? - Qu’observe-t-on dans le cas d’une réaction positive ? BTS BIOANALYSES ET CONTROLES AFBB Pour le vendredi 2 octobre 2009 Microbiologie et technologies d'analyse Page 2 / 8 Devoir maison 08 INI B 1.1.6. Le profil numérique obtenu avec Klebsiella oxytoca P2 en galerie miniaturisée API 20E est le suivant : 5 244 773 - Expliquer le principe de l’identification probabiliste. - Compléter la fiche de résultats fournie dans le document 2 (à rendre avec la copie). - Indiquer la signification biochimique d’un caractère « VP+ ». - Préciser à l’aide du document 2 si les caractères obtenus sont conformes à ceux habituellement rencontrés chez Klebsiella oxytoca. - L’indice de typicité de la souche étudiée est-il égal à 1 ? Justifier. 1.2. Etude de la croissance de Klebsiella oxytoca P2 en bouillon de Luria Une préculture de Klebsiella oxytoca P2 en milieu de Luria (milieu « LB » dont la composition est donnée ci-dessous) est ensemencée dans une fiole d’Erlenmeyer contenant 100 mL de milieu LB stérile. La croissance à 37°C est suivie par méthode turbidimétrique à 600 nm. Composition du milieu « LB » (Luria Broth) Peptone 10 g Extrait de levure 5g NaCl 5g 1.2.1. Donner le(s) rôle(s) des constituants du milieu LB. 1.2.2. Quel est le principe de la méthode turbidimètrique ? 1.2.3. L’absorbance initiale de la culture est égale à 0,165. Il n’y a pas de phase de latence. En fin de phase exponentielle, l’absorbance corrigée est égale à 2,460. Le taux de croissance est égal à 0,9 h-1. - Pourquoi l’absorbance est-elle dite « corrigée » ? - Expliquer l’absence de phase de latence. - Calculer la concentration bactérienne initiale (Donnée : 0,1 unité d’absorbance à 600 nm correspond à une suspension d’environ 108 bactéries par mL. - Définir et déterminer le temps de génération. - Calculer la durée de la phase exponentielle. BTS BIOANALYSES ET CONTROLES AFBB Pour le vendredi 2 octobre 2009 Microbiologie et technologies d'analyse Page 3 / 8 Devoir maison 08 INI B 1.3. Fermentation de Klebsiella oxytoca P2 et production d’éthanol 1.3.1. La production industrielle de bioéthanol peut également être réalisée avec des levures de l’espèce Saccharomyces cerevisiae. Comparer la structure cellulaire d’une levure avec celle d’une bactérie. 1.3.2. Dans quatre fermenteurs contenant 0,8 L de bouillon de Luria, on introduit un substrat : - 50 g de maltose dans le premier, - 10 ; 20 et 40 g d’amidon respectivement dans le second, troisième et dernier fermenteur. Les conditions de fermentation sont les suivantes : anaérobiose, pH = 6, température = 30°C, agitation = 100 rpm. - A t = 0, un volume V de préculture est ajouté dans chaque fermenteur de façon à obtenir une biomasse initiale de 0,033 mg.mL-1. Sachant que la préculture présente une absorbance de 0,5 UA à 600 nm, calculer le volume V de préculture ajoutée dans chaque fermenteur (Donnée : 0,1 unité d’absorbance à 600 nm correspond à une biomasse de 0,033 mg.mL-1). - Calculer les concentrations finales en substrat glucidique dans chaque fermenteur. - Quel apport doit être effectué pendant la fermentation afin de maintenir le pH constant ? Justifier. 1.3.3. Les résultats obtenus sont représentés graphiquement dans les documents 3 et 4. Exploiter ces documents afin de compléter le tableau fourni dans le document 5 (à rendre avec la copie), après avoir donné les formules littérales permettant de calculer le rendement de conversion et la productivité volumétrique. Quelle condition de fermentation semble la plus intéressante sur le plan industriel pour produire de l’éthanol ? BTS BIOANALYSES ET CONTROLES AFBB Pour le vendredi 2 octobre 2009 Microbiologie et technologies d'analyse Page 4 / 8 Devoir maison 08 INI B 2. Etude de bactéries phytopathogènes Les bactéries de l’espèce Pectobacterium carotovora (anciennement Erwinia carotovora) provoquent des dégâts substantiels à des cultures économiquement importantes et aux récoltes stockées. Ces bacilles Gram négatif sont responsables chez la pomme de terre de maladies telles que la « pourriture noire ». 2.1. Pouvoir pathogène de Pectobacterium carotovora : étude du document 6 2.1.1. Le pouvoir pathogène des bactéries peut se manifester selon deux processus parfois associés. Les citer et les définir. 2.1.2. Identifier la sous-espèce responsable de la maladie dans les régions où le climat est tempéré. Quelle est la conclusion de l’étude en ce qui concerne le pouvoir pathogène de cette bactérie ? 2.1.3. Quelle solution pourrait être envisagée pour contrôler la maladie ? 2.1.4. Le pouvoir pathogène des genres Klebsiella et Pectobacterium s’exprime chez des hôtes appartenant à des règnes différents. Pourtant ces deux genres appartiennent à la même famille. - Donner le nom de cette famille et préciser ses principaux caractères. - Sans les développer, citer les méthodes moléculaires utilisées pour comparer les bactéries à des fins taxonomiques. 2.2. Isolement et mise en évidence des bactéries responsables Le document 7 présente le protocole d’isolement de Pectobacterium sur milieu CVP. 2.2.1. Quel caractère est utilisé pour mettre en évidence ce genre bactérien sur le milieu CVP ? Préciser le nom du substrat utilisé et l’aspect des colonies recherchées. 2.2.2. Un autre composé joue un rôle sélectif dans ce milieu. Indiquer son nom et son spectre d’action. BTS BIOANALYSES ET CONTROLES AFBB Pour le vendredi 2 octobre 2009 Microbiologie et technologies d'analyse Page 5 / 8 Devoir maison 08 INI B Feuille à rendre avec la copie Document 1 OX ARA AMY 99 80 MEL 0 SAC 78 RHA IND 0 SOR TDA 89 INO URE 0 MAN H2S 80 GLU CIT 0 GEL ODC 99 VP LDC Klebsiella oxytoca ADH API 20 E ONPG Document 2 0 100 100 99 100 99 99 100 100 100 0 BTS BIOANALYSES ET CONTROLES AFBB Pour le vendredi 2 octobre 2009 Microbiologie et technologies d'analyse Document 3 Document 4 Page 6 / 8 Devoir maison 08 INI B BTS BIOANALYSES ET CONTROLES AFBB Pour le vendredi 2 octobre 2009 Microbiologie et technologies d'analyse Page 7 / 8 Devoir maison 08 INI B Feuille à rendre avec la copie Document 5 Concentration Substrat initiale en substrat (g.L-1) Temps (h) Concentration en Rendement de (g d’éthanol /g de substrat éthanol (g.L-1) initialement présent) 0,50 Maltose 50 36 25 Amidon 10 36 4 Amidon 20 48 Amidon 40 72 Productivité conversion volumétrique (g d’éthanol.L-1.h-1) 0,11 Document 6 Thermodependence of growth and enzymatic activities implicated in pathogenicity of two Erwinia carotovora subspecies (Pectobacterium spp.) - Bruno Smadja, Xavier Latour, Sameh Trigui, Jean François Burini, Sylvie Chevalier, and Nicole Orange. Abstract : The occurrence of the disease and the scale of the damage are temperature dependent. Disease development consists first of active multiplication of the bacteria in the infection area and then production of numerous extracellular enzymes. We investigated the effects of various temperatures on these two steps. We assayed the specific growth rate and the pectate lyase and protease activities for eight strains belonging to E. carotovora subsp. atroseptica and E. carotovora subsp. carotovora in vitro. The temperature effect on growth rate and on pectate lyase activity is different for the two subspecies, but protease activity appears to be similarly thermoregulated. Our results are in agreement with ecological data implicating E. carotovora subsp. atroseptica in disease when the temperature is below 20 °C. The optimal temperature for pathogenicity appears to be different from the optimal growth temperature but seems to be a compromise between this temperature and temperatures at which lytic activities are maximal. Detection and characterization of bacteria from the potato rhizosphere degrading N-acyl-homoserine lactone - S. Jafra, J. Przysowa, R. Czajkowski, A. Michta, P. Garbeva, and J.M. Van der Wolf Abstract: Quorum sensing plays a role in the regulation of soft rot diseases caused by the plant pathogenic bacterium Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum.[…] Experiments in planta revealed that Ochrobactrum sp. strain A44 significantly inhibited the maceration of potato tuber tissue. Since A44 did not produce antibiotics, the attenuation of the decay might be due to the quenching of quorum-sensing-regulated production of pectinolytic enzymes. The strain can potentially serve to control P. carotovorum subsp. carotovorum in potato. 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