Microbiologie et technologies d`analyse

BTS BIOANALYSES ET CONTROLES
AFBB
Epreuve E3 – Unité U32
DEVOIR MAISON
Pour le jeudi 22 avril 2010
Microbiologie et technologies d'analyse
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Durée conseillée : 3 heures
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Le genre Raoultella
1. Caractères phénotypiques du genre Raoultella (30 points)
Le genre Raoultella présente les caractères généraux de la famille des Enterobacteriaceae. Il rassemble
des bacilles à Gram négatif, immobiles, capsulés, fermentant le lactose avec production de gaz, ADH
négative et donnant une réponse positive aux tests LDC et VP. La plupart des souches assimilent le
citrate. Les espèces du genre Raoultella cultivent à 10 °C et elles assimilent le L-sorbose ce qui permet
des les distinguer des Klebsiella.
1.1.
Quels sont les principaux caractères de la famille des Enterobacteriaceae ?
1.2.
Réaliser un schéma détaillé des enveloppes cellulaires présentes chez Raoultella.
1.3.
Indiquer la nature chimique et les fonctions de la capsule.
1.4.
Le document 1 fournit la composition d’un milieu d’isolement de Raoultella, le milieu de
Wong et al.
1.5.
1.4.1.
S’agit-il d’un milieu empirique ou synthétique ? Justifier la réponse.
1.4.2.
Analyser la composition de ce milieu.
1.4.3.
En déduire le type trophique de Raoultella vis à vis des facteurs de croissance.
1.4.4.
Préciser l’aspect des colonies formées par Raoultella sur ce milieu.
A l’aide de la formule de la lysine fournie ci-dessous, écrire l’équation de la réaction catalysée
par la LDC (formules chimiques exigées).
Figure 1
1.6.
Le document 2 présente une voie de fermentation présente chez Raoultella.
1.6.1.
Identifier cette voie et compléter le document 2 (à rendre avec la copie).
1.6.2.
Décrire les modalités de mise en évidence de cette voie en macrométhode. Préciser
le résultat obtenu pour Raoultella.
1.6.3.
Citer trois autres voies de fermentation ainsi qu’un exemple de micro-organisme par
voie citée.
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1.6.4.
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Le rendement énergétique de l’oxydation d’une molécule de glucose est-il plus élevé
lors de la fermentation ou lors de la respiration ? Justifier la réponse.
1.7.
Représenter le résultat obtenu lorsque des bactéries du genre Raoultella sont ensemencées
puis incubées (24 heures à 37°C) sur milieu Citrate de Simmons.
1.8.
Le profil biochimique obtenu expérimentalement sur microgalerie API 20E avec une souche
suspecte est le suivant :
Caractères
Profil obtenu
1.8.1.
ONPG ADH LDC ODC CIT
+
-
+
+
+
H2S URE TDA IND
-
-
-
+
VP
+
GEL GLU MAN INO SOR RHA SAC MEL AMY ARA OX
-
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
A l’aide de la formule de l’ONPG (ortho-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside) fournie
ci-dessous, écrire l’équation de la réaction d’hydrolyse de ce substrat (formules
chimiques exigées). Expliquer la coloration jaune observée lorsque le résultat est
positif.
Figure 2
1.8.2.
Quel est le principe de lecture des tests « GLU » à « ARA » ?
1.8.3.
En utilisant l’extrait de la base de données API 20E (document 3), pour les deux
espèces proposées, calculer la probabilité d’observer le profil biochimique obtenu
expérimentalement (poser les calculs sans les effectuer).
1.8.4.
1.9.
L’indice de typicité sera-t-il égal à 1 ? Justifier la réponse.
Proposer un protocole simple permettant de différencier Raoultella et Klebsiella.
2. Caractères génotypiques du genre Raoultella (10 points)
En 2001, Drancourt et al. publient les résultats d'une analyse phylogénétique (séquences des ARNr
16S, séquences des gènes rpoB codant pour la sous-unité bêta de l'ARN polymérase et bla codant pour
une -lactamase) réalisée sur les souches types des espèces du genre Klebsiella. Leurs résultats
permettent d'individualiser trois groupes au sein de ce genre. Le groupe I est constitué de Klebsiella
pneumoniae, le groupe II rassemble les espèces Klebsiella ornithinolytica, Klebsiella planticola et
Klebsiella terrigena et le groupe III est constitué de Klebsiella oxytoca. En se basant sur leurs résultats
et sur les résultats obtenus par d'autres équipes (notamment sur des résultats d'hybridations ADN-ADN),
Drancourt et al. valident la publication du genre Raoultella et des espèces Raoultella ornithinolytica,
Raoultella planticola et Raoultella terrigena.
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2.1.
Indiquer la nature chimique, la composition et les fonctions de l’ ARNr 16S.
2.2.
Citer un antibiotique ayant pour cible cet ARNr 16S, et un autre capable d’inhiber l'ARN
polymérase.
2.3.
Quel est le comportement des bactéries possédant le gène bla vis à vis des -lactamines ?
Justifier la réponse.
2.4.
Donner le principe d’une étude d'hybridation ADN-ADN entre deux souches bactériennes.
2.5.
Citer et définir le paramètre calculé à l’issue de ce type d’étude.
2.6.
Quel autre critère moléculaire aurait pu être calculé pour valider la publication du genre
Raoultella ? En donner la définition.
3. Aspects sanitaires concernant Raoultella (20 points)
Les espèces du genre Raoultella ont pour principal habitat les plantes, le sol et l'eau. Chez l'homme,
elles peuvent se comporter comme des bactéries pathogènes opportunistes. L'importance du genre
Raoultella en microbiologie alimentaire est liée au fait que Raoultella ornithinolytica et Raoultella
planticola possèdent le gène hdc (codant pour une histidine décarboxylase) et qu'elles peuvent être
responsables d'intoxications à l'histamine. Lors d'intoxications à l'histamine, on peut observer une
diarrhée non sanglante et souvent brève, des céphalées, des signes cutanés (eczéma, urticaire…), des
douleurs abdominales, un malaise général, des nausées, des vomissements, des palpitations et des
vertiges. De nombreuses espèces de poissons peuvent provoquer des intoxications histaminiques et
celles-ci sont également observées après l'ingestion de fromages.
3.1.
Comment appelle-t-on le mode de vie des bactéries du genre Raoultella ?
3.2.
Définir l’expression « bactérie pathogène opportuniste ».
3.3.
Le genre Raoultella appartient aux coliformes.
3.3.1.
Rappeler les caractères des coliformes. Citer une autre espèce appartenant aux
coliformes.
3.3.2.
Présenter l’intérêt de dénombrer les coliformes dans l’eau et les aliments.
3.3.3.
Les coliformes peuvent être dénombrés en milieu solide ou en milieu liquide. La
composition de deux milieux couramment utilisés est fournie document 4.
commenter la composition de ces milieux et préciser les modalités de mise en
évidence des coliformes dans ces milieux.
3.3.4.
La méthode normalisée ISO 4832, (dénombrement des coliformes par comptage des
colonies), définit les coliformes par la taille de la colonie et la production d’acide sur
milieu VRBL. Le dénombrement sur Pétrifilm CC constitue une alternative possible.
Définir « méthode normalisée » et « méthode alternative ».
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3.3.5.
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Pour les fromages à pâte molle au lait traité thermiquement, le journal officiel fournit
les indications suivantes en ce qui concerne les coliformes : m=104/g ; M=105/g ;
n=5 ; c=2. Donner la signification de m, M, n, c.
3.3.6.
25 grammes de fromages à pâte molle sont broyés dans 225 mL d’eau peptonée afin
de constituer une suspension mère. Le dénombrement des coliformes dans cette
suspension mère sur Pétrifilm CC donne les résultats fournis document 5. Calculer
la concentration en coliformes dans l’aliment analysé et conclure.
3.3.7.
Lors d'un autre dénombrement de coliformes, réalisé en milieu liquide, par la
méthode du NPP, les résultats suivants ont été obtenus :
+ : tube positif pour la recherche de coliformes
- : tube négatîf pour la recherche de coliformes
volume de l’inoculum : 1 mL
A l'aide du tableau de la norme ISO 7218, présenté dans le document 6, exprimer le
résultat de ce dénombrement (exposer la démarche et le calcul).
3.3.8.
3.4.
Comparer les résultats obtenus avec les deux méthodes de dénombrement.
Le document 7 est un extrait d’une étude japonaise sur la production d’histamine par les
bactéries appartenant aux genres Raoultella et Klebsiella.
3.4.1.
Indiquer les différentes étapes du protocole de production et de dosage de
l’histamine produite par les souches bactériennes étudiées.
3.4.2.
3.5.
Interpréter les résultats de l’électrophorèse des produits d’amplification des gène hdc.
Proposer deux mesures permettant de limiter les risques d’intoxication histaminique.
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Document 1
Composition du milieu de Wong et al.
Eau désionisée : 800 mL
Lactose : 5 g
Désoxycholate de sodium : 1 g
Na2HPO4 : 0,7 g
KNO3 : 1,08 g
NaH2P : 0,3 g
MgSO4.H2O : 0,2 g
MnSO4 : 0,1 g
FeCl2 : 0,005 g
ZnCl2 : 0,005 g
CoCl2 : 0,005 g
Mo(OH)2 : 0,005 g
Dissoudre à chaud et stériliser par filtration.
Ajuster le pH à 6,8.
Ajouter 0,03 g de rouge neutre, 0,004 g de cristal violet et 15 g d'agar.
Stériliser à l'autoclave.
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Document 2 (à rendre avec la copie)
Voie de fermentation _______________________ chez les bactéries VP +
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Document 3
Extrait de la base de données API 20E
Caractères
ONPG ADH LDC ODC CIT
H2S URE TDA IND
Raoultella ornithinolytica
100
0
99
99
99
0
85
0
Raoultella terrigena
100
0
99
6
52
0
0
0
VP
100 65
0
75
GEL GLU MAN INO SOR RHA SAC MEL AMY ARA OX
0
100 100 99 100 100 100 100 100 100
0
0
99
0
99
99
Document 4
Composition des milieux de BLBVB et VRBL
VRBL
Peptone : 7,0 g
Extrait de viande : 3,0 g
Lactose : 10,0 g
Désoxycholate de sodium : 1,5 g
Cristal violet : 2,0 mg
Rouge neutre : 30,0 mg
Chlorure de sodium : 5,0 g
Agar : 15,0 g
pH = 6,8
BLBVB
Peptone : 10,0 g
Lactose : 10,0 g
Bile : 20,0 ml
Vert brillant : 13,0 mg
pH = 7,4
99
99 100 100 100 99
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Document 5
Résultats obtenus sur Pétrifilm CC
-
Dilution de la suspension mère ensemencée : 10-1
-
Volume de l’inoculum : 1 mL
ESSAI 1
ESSAI 2
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Document 6
Tableau de la norme ISO 7218
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Document 7
Extrait de publication scientifique
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