ONCOLOGIE TRANSLATIONNELLE // Coordonné par S. Faivre

ONCOLOGIE
TRANSLATIONNELLE
Coordonné par S. Faivre (hôpital Beaujon, Clichy)
C. Tournigand (hôpital Saint-Antoine, Paris)
// Nature
// New England Journal of Medicine
// Clinical Cancer Research
La résistance aux inhibiteurs
de RAF associée à l’apparition
de variants d’épissage
de BRAF(V600E)
>Poulikakos PI, Persaud Y, Janakiraman M et al. RAF inhibitor
resistance is mediated by dimerization of aberrantly spliced
BRAF(V600E). Nature 2011;480(7377):387-90.
L
es inhibiteurs de RAF montrent une activité
clinique contre les mélanomes dont les cellules
tumorales sont mutées pour BRAF(V600E). RAF,
normalement, est activé, une fois dimérisé, à la
suite de sa liaison à RAS-GTP. La forme mutante
BRAF(V600E), elle, ne nécessite pas d’être sous
forme dimérique pour être active, ce qui la rend
indépendante de l’activation préalable de RAS.
Cela entraîne, dans les cellules porteuses de cette
mutation, une activation constitutive de la voie
oncogénique MEK/ERK. Néanmoins, cette forme
mutante est plus sensible in vivo aux inhibiteurs
de RAF, tels que la vémurafénib, que la forme
sauvage car elle agit préférentiellement sous
forme monomérique. Malheureusement, l’activité
clinique des inhibiteurs de RAF est souvent limitée
en raison de la survenue de
résistance. Ce phénomène
est souvent lié à l’activation
La dimérisation des formes
de RAS qui survient à la
tronquées de BRAF(V600E)
suite soit de mutations, soit
de l’activation en amont de
rend insensible les tumeurs
récepteurs à tyrosine kinase.
aux inhibiteurs RAF
Cela entraîne la dimérisation
de BRAF(V600E) qui devient
alors moins sensible aux inhibiteurs (1).
Afin d’identifier de nouveaux mécanismes de
résistance, les auteurs ont développé des lignées
résistantes au vémurafénib, en exposant pendant
2 mois à 2 μM les cellules de mélanome SKMEL239 porteuses, à l’état hétérozygote, de la forme
mutante V600E de BRAF. Cinq clones résistants
ont été sélectionnés dans lesquels aucune mutation de RAS ou activation de récepteurs à tyrosine
kinase n’a pu être mise en évidence. En revanche,
dans 3 clones, l’analyse de l’expression protéique
de BRAF révèle une forme de 61 KDa en plus de
la forme normale de 90 KDa. L’analyse par réaction de polymérisation en chaîne (PCR) des ADN
complémentaires issus de ces 3 clones montre
l’existence de 2 transcrits : un premier de 2,3 Kb
correspondant à la forme entière sauvage de
BRAF et un second de 1,7 Kb correspondant à la
forme contenant la mutation V600E de BRAF dans
laquelle une délétion des exons 4-8 est apparue.
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Ce second transcrit code pour une protéine BRAF
tronquée dont la taille estimée est de 61 KDa.
Cette nouvelle forme de la protéine BRAF est
appelée p61BRAF(V600E). De manière intéressante,
la délétion des exons 4-8 n’apparaît pas au niveau
de la séquence génomique, ce qui suggère qu’un
défaut d’épissage est responsable de l’apparition
de cette nouvelle forme de la protéine BRAF. Pour
comprendre le rôle de p61BRAF(V600E), les auteurs
l’ont tout d’abord exprimée dans des cellules 293H,
SKMEL-239 parentale et HT-29. Dans tous les cas,
l’activation de la voie ERK devient alors résistante
au vémurafénib. À l’aide d’ARN interférents ciblant
soit la jonction exon 3-9, soit une région située
dans les exons 4-8, les auteurs inhibent alors
spécifiquement, dans les cellules SKMEL-239
résistantes, la forme BRAF sauvage ou la forme
p61BRAF(V600E), respectivement. Or, seule la perte
d’expression de p61BRAF(V600E) rend les cellules de
nouveau sensibles au vémurafénib, ce qui confirme
le rôle de cette isoforme dans la résistance. Pour
mieux comprendre ce phénomène, les auteurs
ont coexprimé, dans les cellules 293H, 2 formes
de la protéine p61BRAF(V600E), l’une avec une
étiquette Flag, l’autre avec une étiquette V5. Après
immunoprécipitation avec un anticorps anti-Flag,
la présence de la forme marquée par l’étiquette
V5 a été révélée par Western-Blot. Les résultats montrent que les 2 formes de la protéine
p61BRAF(V600E) forment un complexe et sont
donc capables de se dimériser sans que RAS ne
soit présent. En additionnant une mutation R509H
dans les constructions utilisées ci-dessus, mutation qui abolit la dimérisation de RAF sauvage, les
auteurs notent que cette mutation bloque aussi
la dimérisation de la protéine p61BRAF(V600E/
R509H). Or, cette simple mutation R509H fait que
la signalisation ERK dans les cellules exprimant
cette nouvelle isoforme redevient sensible au traitement par le vémurafénib. Ces résultats suggèrent
que la dimérisation constitutive de la protéine
p61BRAF(V600E) est un déterminant majeur de
la résistance des cellules vis-à-vis de cette molécule. Pour vérifier la pertinence clinique de cette
observation, les auteurs ont analysé les tumeurs de
19 patients initialement hétérozygotes BRAF(V600)/
BRAF. Avant le traitement par le vémurafénib,
1 seul transcrit de 2,3 Kb était détectable chez
tous les patients. En revanche, après leur traitement, 6 patients présentaient 2 types de transcrit
dans leur tumeur : l’un de 2,7 Kb, l’autre de taille
inférieure. Dans tous les cas, les variants d’épissage
observés touchaient une région identique de la
protéine BRAF que celle observée dans les clones
obtenus in vitro, suggérant ainsi que ces cellules
deviennent résistantes en raison de la dimérisation
constitutive de formes tronquées de BRAF(V600E).
Ces résultats mettent en évidence que la résistance au vémurafénib et, par extension, aux
autres inhibiteurs de BRAF, peut provenir de la
formation de formes tronquées de RAF capables
de dimériser en absence d’activation de RAS.
Néanmoins, malgré l’apparition de cette résistance,
les tumeurs devraient rester sensibles à des inhibiteurs qui agissent en aval de BRAF. Ainsi, l’utilisation d’inhibiteurs de MEK en combinaison avec les
inhibiteurs de RAF devrait prévenir ou ralentir la
survenue de résistance provenant de l’apparition
de variants d’épissage de BRAF(V600E) et donc
accroître leur efficacité thérapeutique.
Référence bibliographique
1. Poulikakos PI, Rosen N. Mutant BRAF melanomas −
dependence and resistance. Cancer Cell 2011;19(1):11-5.
A. Escargueil,
université Pierre-et-Marie-Curie, Paris.
Implication du couple
TFAP2E-DKK4
dans la chimiorésistance
du cancer colorectal
> Ebert MPA, Tänzer M, Balluff B et al. TFAP2E-DKK4 and
chemoresistance in colorectal cancer. N Engl J Med 2012;366(1):
44-53.
L
es facteurs prédictifs de la réponse à la chimiothérapie du cancer colorectal sont partiellement
connus. L’implication de modifications génétiques et, plus récemment, épigénétiques a été
montrée (1). Les altérations épigénétiques les mieux
étudiées sont les modifications de la méthylation de
l’ADN génomique (hypo- ou hyperméthylation) et
des modifications des histones (constituant un “code
des histones”) régulant la transcription des gènes.
M.P.A. Ebert et al. (2) se sont intéressés aux rôles
du facteur de transcription AP-2 ε (TFAP2E) et de
la protéine DKK4 en tant que facteurs prédictifs
de la réponse à la chimiothérapie dans le cancer
colorectal. La famille des facteurs de transcription AP-2 comprend 5 facteurs (α, β, γ, δ et ε),
impliqués dans divers processus biologiques au
cours du développement et durant l’oncogenèse.
L’expression de ces facteurs semble être tissu-
spécifique, et certains semblent se comporter
comme des facteurs suppresseurs de tumeurs ;
TFAP2C dans le cancer du sein, TFAP2D et TFAPE
sont hyperméthylés dans les cancers colorectaux
et de la prostate.
Les auteurs se sont tout d’abord intéressés à
l’état de méthylation de TFAP2E dans des prélèvements tumoraux et de tissus sains avoisinants de
74 patients. Chez 38 patients (51 %), TFAP2E était
hyperméthylé sans qu’il y ait de corrélation avec
les caractéristiques clinicohistologiques classiques.
L’hyperméthylation de TFAP2E se traduit bien par
une diminution de la transcription de ce gène dans
les prélèvements, sans qu’il y ait néanmoins une
corrélation parfaite.
L’étape suivante, classique dans l’étude des facteurs
de transcriptions, est de déterminer les gènes
régulés par ceux-ci. Pour cela, des études in vitro
sur lignées cellulaires ont été effectuées.
Après la transfection de lignées tumorales de cancer
du côlon en vue de surexprimer TFAP2E, les analyses
transcriptomiques ont permis d’identifier les gènes
dont l’expression était significativement modifiée
par rapport aux lignées non transfectées. Parmi ces
gènes, DKK4 était significativement sous-exprimé.
Cette régulation s’est trouvée confirmée par le
fait que les lignées tumorales non transfectées
expriment fortement DKK4 et que cette expression
est fortement diminuée lorsque l’on réexprime
TFAP2E en le déméthylant grâce à l’azacytidine.
DKK4 ayant été impliqué dans l’inefficacité de la
chimiothérapie du cancer colorectal, les auteurs
ont donc étudié le rôle du couple TFAP2E-DKK4
dans les phénomènes de résistance aux molécules
utilisées dans le cancer colorectal sur des modèles
de lignées cellulaires.
Les lignées tumorales transfectées pour surexprimer
TFAP2E survivent moins longtemps en présence
de 5-FU (−20 % par rapport aux témoins), alors
que celles transfectées pour surexprimer DKK4
survivent mieux (+10 % par rapport aux témoins),
les cellules cotransfectées pour surexprimer les 2
ayant un résultat intermédiaire.
Afin de valider ces données, l’état de méthylation
de TFAP2E a ensuite été évalué dans 4 cohortes
différentes constituées de 76 patients atteints
de cancer colorectal métastatique en cours de
chimiothérapie ou de radiochimiothérapie.
Ils étaient traités par : capécitabine + oxaliplatine
versus 5-FU i.v. + oxaliplatine pour la première,
FOLFIRI ou FOLFOX pour la deuxième (n = 44),
radiochimiothérapie + cétuximab pour la troisième,
radiochimiothérapie + 5-FU pour la quatrième.
Les troisième et quatrième cohortes concernaient
des patients atteints de cancer rectal.
Dans ces 4 cohortes, il existait une corrélation entre
la réponse thérapeutique et l’hypométhylation de
TFAP2E, avec un risque relatif (RR) de 5,74 (hypométhylé versus hyperméthylé), et, à l’inverse, le
statut hyperméthylé était significativement associé
à l’absence de réponse. À noter que cela est vérifié
quelle que soit la chimiothérapie (FOLFOX, CAPOX,
FOLFIRI, 5-FU seul), ainsi qu’en cas de radiothérapie
ou d’utilisation de cétuximab.
Ces résultats suggèrent, d’une part, que l’hyperméthylation de TFAP2E est un facteur prédictif de
résistance aux chimiothérapies à base de 5-FU dans
le cancer colorectal et, d’autre part, que le blocage
de DKK4 pourrait être une voie intéressante dans
cette situation.
Ces résultats devront être confirmés sur de plus
grands effectifs, et notamment en situation adjuvante, cas où l’identification des patients à risque
ou chez qui la chimiothérapie est inefficace est un
objectif prioritaire.
Références bibliographiques
1. Esteller M. Epigenetics in cancer. N Engl J Med 2008;
358(11):1148-59.
2. Ebert MPA, Tänzer M, Balluff B et al. TFAP2E-DKK4 and
chemoresistance in colorectal cancer. N Engl J Med 2012;
366(1):44-53.
L. Teixeira,
hôpital Saint-Antoine, Paris.
Chimiothérapie adjuvante
par FOLFOX dans les cancers
coliques de stade III : efficace
quel que soit le statut MSI !
> Zaanan A, Fléjou JF, Emile JF et al. Defective mismatch repair
status as a prognostic biomarker of disease-free survival in
stage III colon cancer patients treated with adjuvant FOLFOX
chemotherapy. Clin Cancer Res 2011;17(23):7470-8.
L
e FOLFOX (5-FU + oxaliplatine + acide folinique)
a montré sa supériorité par rapport au 5-FU seul
dans le traitement adjuvant des cancers coliques
de stade III, pour lesquels il constitue le traitement
de référence. Plusieurs études ont montré que les
tumeurs ayant un phénotype MSI (MicroSatellite
Instability) ne bénéficient pas d’une chimiothérapie
adjuvante par 5-FU (1, 2) mais peu de données
sont disponibles concernant l’impact de ce phénotype sur la chimiothérapie standard actuelle par
La Lettre du Cancérologue • Vol. XXI - n° 3 - mars 2012 |
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ONCOLOGIE
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Coordonné par S. Faivre (hôpital Beaujon, Clichy)
C. Tournigand (hôpital Saint-Antoine, Paris)
FOLFOX. Le but de cette étude était d’évaluer la
valeur pronostique du statut MSI chez les patients
opérés d’un cancer colique de stade III et traités
par FOLFOX.
Il s’agit d’une étude rétrospective multicentrique
française ayant inclus tous les patients consécutifs
opérés d’un cancer colique de stade III et ayant
reçu une chimiothérapie adjuvante par FOLFOX
entre juin 2003 et décembre 2007 dans 9 centres.
Le statut MSI a été déterminé soit par réaction
en chaîne par polymérase (PCR) [analyse des
5 marqueurs mononucléotidiques habituels : NR21,
NR24, NR27, BAT25 et BAT26], soit par immunohistochimie (IHC) [analyse de la perte d’expression
de hMSH1, hMLH2 et hMSH6]. Le critère principal
de jugement était la survie sans maladie à 3 ans.
Sur un total de 520 patients opérés d’un cancer
colique de stade III, 303 répondaient aux critères
d’inclusion de l’étude (chimiothérapie adjuvante
uniquement par FOLFOX, débutée dans les
6 semaines suivant la chirurgie, traitement et suivi
effectués dans le même centre que la chirurgie
et tissu tumoral disponible). Le statut MSI a été
déterminé par IHC chez 210 patients, par PCR
chez 46 patients et par les 2 techniques (avec des
résultats concordants) chez les 47 autres.
Au total, 34 patients (11,2 %) avaient une tumeur
MSI. Le nombre médian de cycles de FOLFOX était
respectivement de 9,7 chez les patients avec tumeur
MSI et de 10,5 chez les patients avec tumeur MSS
(MicroSatellite Stable) et le suivi médian a été
respectivement de 48 et 41 mois dans ces 2 groupes.
Les résultats principaux de cette étude sont les
suivants :
➤ le taux de survie sans maladie à 3 ans était
de 90,5 % dans le groupe MSI et de 73,8 % dans
le groupe MSS respectivement (HR = 2,16 ; IC95 :
1,09-4,27 ; p = 0,027) ;
➤ le taux de survie globale à 5 ans était de 96,8 %
dans le groupe MSI versus 86,9 % dans le groupe
MSS (HR = 2,11 ; IC95 : 0,63-7,05 ; p = 0,23) ;
➤ en analyse univariée, selon un modèle de
Cox incluant toutes les variables clinico-pathologiques pronostiques habituelles, le stade tumoral
(stade IIIA-B versus IIIC), le ratio ganglions envahis/
ganglions examinés (< 0,113 versus ≥ 0,113) et le
statut MSI (versus MSS) étaient significativement
associés à une meilleure survie sans maladie ;
➤ en analyse multivariée, le statut MSI était le
seul facteur indépendant de bon pronostic, associé
à une meilleure survie sans maladie (HR = 4,48 ;
IC95 : 1,34-14,99 ; p = 0,015).
Cette large étude multicentrique est la première
à montrer un impact pronostique significatif du
statut MSI dans les cancers coliques de stade III recevant une chimiothérapie adjuvante par FOLFOX.
Les tumeurs de stade III ayant un phénotype MSI
incluses ici ont un excellent pronostic avec un
taux de survie sans maladie supérieure à 90 %.
Trois études antérieures (3-5) n’avaient pas montré
d’impact pronostique significatif du statut MSI chez
des patients traités par FOLFOX mais, contrairement à la présente étude, leur puissance statistique
était insuffisante et elles incluaient des tumeurs
de stades II et III.
Si le statut MSI a donc ici une valeur pronostique,
rien ne peut être conclu quant à sa potentielle
valeur prédictive du bénéfice de la chimiothérapie
adjuvante par FOLFOX, car seule une étude randomisée comparant le FOLFOX à un bras témoin par
5-FU seul est capable d’apporter des résultats clairs
sur ce point. Ces résultats devraient être connus
prochainement, puisque l’analyse du statut MSI
dans les essais MOSAIC et NSABP-C07 est en cours.
Sous réserve d’être validés, les résultats de cette
étude rétrospective suggèrent que l’oxaliplatine
pourrait permettre de “réverser” la résistance
au 5-FU des tumeurs MSI. Les données d’études
précliniques in vitro permettent d’expliquer ces
différences de comportement des tumeurs MSI visà-vis de la chimiothérapie par 5-FU seul ou associé
à l’oxaliplatine. En effet, il a été montré qu’en
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cas de déficience du système de réparation MMR
(MisMatch Repair), caractéristique du phénotype
MSI, les lésions de l’ADN étaient réparées principalement par le système BER (Base Excision Repair),
démontré efficace pour contrecarrer le déséquilibre en dNTP (désoxynucléotides triphosphate)
spécifiquement induit par le 5-FU, ce qui expliquerait la résistance de ces tumeurs MSI au 5-FU.
À l’inverse, les adduits à l’ADN induits par l’oxaliplatine semblent être moins bien reconnus par le
système de réparation MMR que ceux induits par
le cisplatine par exemple, ce qui pourrait expliquer
la sensibilité des tumeurs MSI au FOLFOX rapportée
dans l’étude de A. Zaanan et al.
En attendant d’être confirmés par des études
randomisées, les résultats de cette étude incitent
donc à traiter par FOLFOX tous les cancers coliques
de stade III, quel que soit leur statut MSI.
Références bibliographiques
1. Ribic CM, Sargent DJ, Moore MJ et al. Tumor
microsatellite-instability status as a predictor of benefit
from fluorouracil-based adjuvant chemotherapy for colon
cancer. N Engl J Med 2003;349(3):247-57.
2. Sargent DJ, Marsoni S, Monges G et al. Defective
mismatch repair as a predictive marker for lack of efficacy
of fluorouracil-based adjuvant therapy in colon cancer.
J Clin Oncol 2010;28(20):3219-26.
3. Zaanan A, Cuilliere-Dartigues P, Guilloux A et al.
Impact of p53 expression and microsatellite instability
on stage III colon cancer disease-free survival in patients
treated by 5-fluorouracil and leucovorin with or without
oxaliplatin. Ann Oncol 2010;21(4):772-80.
4. Des Guetz G, Lecaille C, Mariani P et al. Prognostic
impact of microsatellite instability in colorectal cancer
patients treated with adjuvant FOLFOX. Anticancer Res
2010;30(10):4297-301.
5. Kim ST, Lee J, Park SH et al. Clinical impact of
microsatellite instability in colon cancer following
adjuvant FOLFOX therapy. Cancer Chemother Pharmacol
2010;66(4):659-67.
A. Lièvre,
hôpital Ambroise-Paré,
Boulogne-Billancourt.