enzymo - Jamiati
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ENZYMOLOGIE Pr Layachi CHABRAOUI Pr Wafae KABBAJ Cours1ère Année Médecine Rabat 2011-2012 ENZYMOLOGIE? L'enzymologie est la partie de la biochimie qui étudie les propriétés structurales et fonctionnelles des enzymes. Elle s’intéresse aussi à décrire la vitesse des réactions catalysées par les enzymes (cinétique enzymatique). Introduction Les organismes vivants sont le siège d’innombrables réactions biochimiques. Ces réactions constituent le métabolisme c’est à dire la biosynthèse et le catabolisme d’un grand nombre de molécules biologiques. Ces réactions se déroulent dans des conditions physiologiques (pH:7,4 et température :37oC) grâce à la présence des enzymes Sans la présence des enzymes, la vie serait impossible Les enzymes ont donc un rôle vital Contenu du cours ● Structure et propriétés des enzymes ● Cinétique enzymatique ● Mécanisme de la réaction enzymatique Chapitre 1 Structure des enzymes Objectifs: à l’issu de l’enseignement l’étudiant doit être en mesure de: Expliquer les différents types de classifications des enzymes et dresser les différents groupes Décrire la structure des enzymes et des coenzymes Expliquer le mode d’action des enzymes Citer les facteurs qui influencent la cinétique enzymatique Expliquer le mode d’action des différents facteurs influençant la cinétique enzymatique 1- Définitions 1.1- Les enzymes Des protéines spécialisées dans la catalyse de réactions. ⇒Catalyseurs biologiques très puissants Elles augmentent la vitesse des réactions chimiques, sans en modifier l’équilibre. A + B C +D Les protéines enzymatiques sont synthétisées par des êtres vivants. Cette synthèse est déterminée génétiquement. Chaque enzyme est le produit d’expression d’un gène Parfois 2 gènes 1.2- Un substrat (S):est la molécule qui est transformée sous l’action de l’activité de l’enzyme 1.3- Un produit (P): est la molécule qui apparaît au cours d’une réaction catalysée par l’enzyme P Site actif S S Enzyme S + E substrat Enzyme Enzyme ES P + E produit 1.4- Le site actif : la partie de l’enzyme qui fixe le substrat. 2- Historique 1730: La digestion est un phénomène plus chimique que mécanique 1850: Pasteur démontra que la fermentation du sucre en alcool par la levure est catalysée par une substance qui existe dans la levure En zyme dans levure 1897: Buchner a extrait de la levure les premières enzymes 1929: La 1ère enzyme purifiée et cristallisée est l’uréase Urée Uréase CO2 + 2NH3 Depuis, plus de 3000 enzymes sont décrites 3- PROPRIETÉS ET CARACTÉRISTIQUES DES ENZYMES 3.1- Agissent en très faible quantité: une molécule de catalase peut hydrolyser 5 millions de molécules d’H2O2 en une min dans des conditions de pH et de température physiologiques 3.2- Ne sont pas consommées au cours de la réaction: comme les catalyseurs chimiques, elles se retrouvent intactes à la fin de la réaction 3.3- Sont spécifiques: Une enzyme transforme un S donné (spécificité de substrat) grâce à une réaction donnée (spécificité de réaction) Spécificité liée à la réaction : Spécificité étroite Exemple: décarboxylation R CH oxydase COOH oxydation NH2 désamination AA (S) Spécificité vis à vis du substrat: HK et GK Spécificité étroite Certaines E peuvent distinguer entre la forme D et L ou entre la forme α et β = stéréospécificité Spécificité large R-P HK, PAL Phosphatase alcaline R+ P 3.4- Mode d’action des enzymes S P énergie état de transition sans catalyseur Energie d’activation catalyseur enzyme état initial état final Les enzymes abaissent l’énergie d’activation déroulement de la réaction exemple H2O2 ½ O 2 + H2O Sans catalyseur : 18 kcal/mole d’H2O2 Catalyseur chimique (le platine) : 11,7 kcal/mole d’H2O2 Enzyme (catalase) : 2 Kcal/mole d’H2O2 Les enzymes abaissent l’énergie d’activation Elles ne modifient pas l’équilibre Elles augmentent la vitesse de réaction 3.5- Les enzymes sont régulables L’activité catalytique de nombreuses enzymes varie en réponse à des signaux métaboliques (inhibiteurs, activateurs) 4- Structure des enzymes - Enzymes entièrement protéiques ex: Chymotrypsine = holoprotéines totalité - Enzymes formées de deux parties hétéroprotéines cofacteur apoenzyme Une partie protéique: apoenzyme Une partie non protéique: cofacteur - ion métallique - coenzyme, groupement prosthétique Apoenzyme: intervient dans la spécificité, thermolabile Cofacteur: effectue la réaction chimique, thermostable 4.1- Les enzymes holoprotéiques: Les enzymes sont des protéines globulaires. Elles peuvent être formées: - d’une seule chaîne polypeptidique Exemple: le lysozyme - de plusieurs chaînes identiques ou différentes Exemples: Isoenzymes (LDH, CPK) enzymes allostériques 4.1.1- Le site actif - Définition: = enzymatique: acides aminés qui entrent en contact avec le S 4-1 La protéine site actif - le site de fixation qui se combine au substrat - le site catalytique qui agit sur le substrat pour lui faire subir la réaction chimique. - Constitution: serine, cystéine, histidine, tyrosine S - Mise en évidence des AA du site actif: a- Utilisation des composés qui se fixent spécifiquement à un AA Diisopropylfluorophosphate (DFP): Serine Parachloromercuribenzoate: Cystéine Dérivés arsenicaux: Cystéine b- Méthodes de génie génétique 4.1.2- Relation entre la structure spatiale et la fonction catalytique Exemple: : la trypsine: enzyme pancréatique Zymogène Trypsinogène Nt Val-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys (inactif) His His 49 S 29 Ser S 183 S S entérokinase : E intestinale Val-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys Trypsine (active) + Site actif His His 29 49 S Ser 183 S S S Le départ de l’hexapeptide, fortement chargé (-) par les 4 Asp, modifie la conformation de la protéine, en favorisant la formation d’hélice α. 4.1.3- forme du site actif 1890: Fischer a proposé que la forme du substrat est complémentaire de la forme du site actif de l’enzyme = modèle de la clé et de la serrure 1958: Koshland a proposé que l’enzyme et le substrat adaptent mutuellement leurs formes respectives Une molécule d’enzyme n’est pas rigide mais flexible = modèle de l’ajustement induit (comme la main et le gant) 4-2 Enzymes hétéroprotéiques: à Cofacteurs - de nature inorganique: les ions métalliques, - de nature organique: les coenzymes Lorsque le coenzyme se lie à la protéine enzymatique par une liaison covalente, on parle de groupement prosthétique Lorsque la liaison est faible on parle de cofacteur cosubstrat apoenzyme 4-2-1 Ions métalliques Mg2+, Mn2+, Cu2+, Zn2+, Fe2+… Exemples: Fer: les cytochromes Zn2+ dans l’alcool déshydogénase forme un pont entre l’enzyme et son substrat 4-2-2 Coenzyme Molécule indispensable à la réaction enzymatique. La réaction se produit avec le coenzyme et non avec la protéine (coenzyme = site catalytique) L’apoenzyme intervient dans la spécificité (site de fixation) Mode d’action des coenzymes Exemple: A-X + Co A + Co-X Co-X + B A-X + B B-X + Co A + B-X AH2 + FAD FADH2 + B déshydrogénase hydrogénase A + FADH2 BH2 + FAD Le coenzyme n’est pas spécifique: plusieurs enzymes différentes peuvent avoir le même coenzyme certaines enzymes ont besoin d’un ion métallique et d’un groupement prosthétique: cas des cytochromes: noyau porphyrique + Fe2+ 5- NOMENCLATURE ET CLASSIFICATION DES ENZYMES Avant 1961 : les enzymes ont été dénommées selon le nom du S sur lequel elles agissent en ajoutant le suffixe "ase" Exemple: Substrat Enzyme amidon urée amylase uréase E1 Décarboxylase Acide aminé E2 Aminotransférase E3 Oxydase 1961: l’union internationale de biochimie (UIB) : nouvelle classification des enzymes selon le type de réaction catalysée 6 classes d’enzymes 5.1- Les oxydoréductases nécessitent un coenzyme (NAD, NADP, FAD ou FMN) Aox + Bred • Hydroxylases: Ared + Box (=monooxygénases) -CH3 -CH2- catalysent la fixation d’un atome d’oxygène -CH2OH -CHOH- • Déshydrogénases: lactate déshydrogénase CH3- CHOH-COOH + NAD+ CH3-CO-COOH ac. pyruvique ac. lactique + NADH + H+ • Cytochromes: ont un coenzyme héminique avec un ion, qui présente 2 états d’oxydation, ce qui en fait un transporteur d’électrons. Fe2+ Fe3+ + 1eréduit oxydé 5.2- Les transférases catalysent le transfert de groupement autre que l’hydrogène entre deux substrats nécessitent un coenzyme E A-X + B A + B-X • les transaminases: transfèrent les radicaux aminés -NH2 d’un AA à un acide cétonique accepteur. Le coenzyme est le phosphate de pyridoxal. • les phosphokinases ou kinases: transfèrent un P sur une molécule d’ADP. L’ion Mg++ est indispensable. ATP + glucose • Les transacétylases: • Les transméthylases: ADP + glucose 6P transfèrent les radicaux acétyles(-CH2COOH), le coenzyme est CoA transfèrent les radicaux méhyles (-CH3), d’une molécule à une autre, le coenzyme est l’acide tetrahydrofolique. 5.3- Les hydrolases Catalysent la rupture d’une liaison avec fixation des éléments d’une molécule d’eau. A-B + H2O A-H + B-OH • Les estérases: hydrolysent les esters en acides gras et en alcool RCOO-CH2-R’ + H2O RCOOH + R’CH2OH • Les lipases : hydrolysent les glycérides en glycérol et en acides gras • Les osidases: hydrolysent les osides glucosidase, galactosidase • Les enzymes protéolytiques: hydrolysent les liaisons peptidiques R-CO-NH-R’ + H2O RCOOH + NH2-R’ 5.4- Les lyases catalysent la rupture des liaisons C-C, C-N, C-O, C-S - décarboxylase d’acide cétonique: le coenzyme est la thiamine pyrophosphate (TPP) R-CO-COOH - décarboxylase d’acides aminés: R CH COOH R-CHO + CO2 le coenzyme est le phosphate de pyridoxal R-CH2-NH2 + CO2 NH2 Cas de la pyruvate déshydrogénase: 5 coenzymes TPP, NAD+, FAD, Coenzyme A et Lipoate 5.5- Les isomérases catalysent le déplacement de groupes à l’intérieur d’une molécule sans que la formule brute varie Epimérases: provoquent des interconversions d’oses galactose Mutases: glucose catalysent le transfert d’un radical d’une partie d’une molécule à une autre H CH3 CH2 C CH2 COOH CO CO CoA CoA Methyl malonyl CoA 5.6- Les ligases: COOH Succinyl CoA catalysent la condensation de 2 molécules. A+B A-B ATP AMP + P-O-P 6- PRINCIPAUX COENZYMES Origine des coenzymes 1- métabolisme 2- Vitamine (ATP, S adénosyl méthionine) (= amine vitale) Un certain nombre de coenzymes dérivent de vitamines, notamment de vitamines hyrosolubles et en particulier les vitamines du groupe B - Coenzymes intervenant dans les réactions d’oxydoréduction (4 coenzymes) - Coenzymes intervenant dans le transfert de groupement (6 coenzymes) 6.1- Coenzymes intervenant dans les réactions d’oxydoréduction 6.1.1- Nicotinamide adénine dinucléotide (NAD+) et NADP+ NAD+ ● Structure CO- NH2 nucléotide O HO P (Vit B3ou Vit PP) N+ O O H H H OH H OH O NH2 N nucléotide N HO P O Nicotinamide O O H H H OH H OH N Adénine N centre actif CO- NH2 O HO P N+ O O H H H OH H OH O NH2 NADP+ N N N HO P O O N O H H H OH O HO P O H OH NAD+ ● Mécanisme réactionnel AH2 + Substrat réduit NAD+ (ou NADP+) H H H CO- NH2 CO- NH2 AH2 + N N+ B A + NADH + H+ (ou NADPH) Substrat oxydé + Substrat oxydé NADH + H+ (ou NADPH) BH2 + NAD+ + (ou NADP ) Substrat réduit Ce sont des coenzymes de type Cosubstrats + H+ ● Spectre d’absorption Mesure de la densité optique en fonction de λ NAD+ (forme oxydée) DO NADH (forme réduite) 260 350 Longueur d’onde (nm) dosage des enzymes à NAD+ ou à NADP+ Exemple: LDH ● Spécificité NAD+ Localisation mitochondriale Coenzyme d’oxydation NADP+ Localisation cytoplasmique Coenzyme d’hydrogénation, de biosynthèse [NAD+] > [NADP+] La plupart des enzymes sont spécifiques soit du NAD+ soit du NADP+ sauf qq exceptions comme la glutamate déshydrogénase ● Origine Le NAD+ et le NADP+ s’apparentent à la vitamine B3 ou PP (pellagre preventive) L’avitaminose PP entraîne une maladie appelée pellagre 6.1.2- Flavine mononucléotides (FMN) et Flavine adénine dinucléotide (FAD) ● Structure FMN Flavine mononucléotides: ribitol O (CHOH)3 CH2 CH2 O P OH CH3 N N O NH CH3 N O Noyau isoalloxazine = flavine = vit B2 OH Flavine Adénine Dinucléotide: FAD FMN (CHOH)3 CH2 CH3 N N O NH CH3 CH2 O OH P O OH P O O N O NH2 N N CH2 O H H H OH H OH N N Ac adenylique ● Mécanisme réactionnel H N AH2 + N E A + N N H FAD ou FADH2 ou FMN FMNH2 jaunes incolores Les FMN et FAD sont appelés ferments jaunes FMN et FAD sont liés à l’enzyme: groupements prosthétiques ● Origine Le FAD et le FMN dérivent de la flavine ou vitamine B2 Les déshydrogénases à FAD les plus importantes sont les NADH déshydrogénases qui permettent la réoxydation du NADH Déshydrogénase à FAD NAD+ NADH + H+ FAD FADH2 6.1.3- Les ferroporphyrines: Coenzymes associés aux cytochromes grpt prosthétique + Fe ● Structure CH3 CH2-CH2 N CH3 CH3 N Fe N N Cyt C S CH2-CH2 S CH2 CH2 CH2 COOH CH2 CH3 CH2 COOH ● Rôle Jouent un rôle important dans le transfert d’électron Fe2+ Fe3+ + 1eréduit oxydé 6.1.4- Acide lipoïque ● Structure Ce coenzyme a la structure d’un Acide gras saturé à 8 C avec un pont disulfure entre C6-C8. 7 1 COOH S ● Rôle: CH2 2 3 4 5 6 CH2 CH2 CH2 CH2 CH CH2 S S S + 2H SH 8 SH Transporteur d’H2 L’acide lipoïque est attaché par covalence à l’enzyme par son carboxyle à un reste lysine de l’enzyme : groupement prosthétique 6.2- Coenzymes intervenant dans le transfert de groupement 6.2.1- Thiamine pyrophosphate (TPP) ● Structure: dérivé de la vitamine B1 ou thiamine H NH2 centre actif S C N CH2 N+ CH2 CH3 N Cycle pyrimidique OH OH CH2 O CH3 O P P O O Cycle thiazole Thiamine = vitamine B1 ● Rôle: Transporteur d’acétaldéhyde dans les réactions de décarboxylation COOH Ex: Pyruvate DH C=O CH3 CO2 + CH3 O C H Acétaldéhyde Ac. pyruvique La carence en vitamine B1 entraîne une maladie : le Béri-béri OH NH2 ● Structure O CH2 H O N N O H H O H OH P N 6.2.2- Coenzyme A (CoA-SH) ou N Coenzyme d’Acylation Dérive d’une vit amine du groupe B: ac pantothénique OH OH O P O O OH O P OH ● Rôle Transporteur d’acétyle et d’acide gras O CH2 CH3 C CH3 H OH C O C NH Acide pantothénique CoA-SH + CH3COOH CH2 CH3CO-SCoA acétyle CoA CH2 C NH O CoA-SH + R-COOH RCO-SCoA acyl CoA CH2 CH2 SH Thioéthylamine ou mercaptoethylamine 6.2.3- Acide tetrahydrofolique ● Structure: (FH4) dérive de la vitamine B9: acide folique OH N 4 Acide folique 2 1 NH2 N 5 6 8 7 CH2 NH 9 NH2 CH2 CH2 COOH COOH Glu Ac. Para amino benzoïque N H H N CH2 NH CO NH CH COOH H ● Rôle CH H OH N CO NH N N. pteridine FH4 10 : transporteur d’unités à un C (CH3) CH2 Sur N5 Sur N10 N CH2 5 entre N5 et N10 N 10 CH2 CH2 COOH 6.2.4- S adénosyl méthionine COOH ● Structure: NH2 CH NH2 CH2 Met N N CH2 N CH3 S+ CH3 H N O H H OH H OH ● Rôle: transporteur de radicaux méthyles (donneur) adénosine 6.2.5- Adénosine 5’ triphosphate NH2 ● Structure: N O HO P OH O P OOH N O O O P N O N O OH H H H OH H OH AMP ADP ATP ● Rôle: transfert de groupements ATP ADP + P ATP AMP + P-P ATP adénosyl + P + P-P adénine 6.2.6- Phosphate de pyridoxal ● Structure: = vit B6 CHO CH2OH CH2-NH2 CH2OH CH2OH CH2OH OH OH OH CH3 CH3 CH3 N N pyridoxine ● Rôle: dérive de la vit B6 N pyridoxal pyridoxamine Transport de groupement aminé: NH2 Pyridoxal = vit B6 O HO P CH2-NH2 O CHO O NH3 CH3 OH OH CH3 N Phosphate de pyridoxal HO P O CH3 OH OH CH3 N Phosphate de pyridoxamine Phosphate de Pyridoxal Transamination Décarboxylation Chapitre 2: La cinétique enzymatique Objectifs: Reconnaître la cinétique d’une enzyme Définir la vitesse maximale (Vmax) et la constante de Michaelis (KM) Représenter graphiquement la cinétique d’une enzyme en fonction des différentes variables 1- RAPPEL DE L’ORDRE D’UNE REACTION A P A- réaction d’ordre 0 [A] V V= t B- réaction d’ordre 1 [A] =k dt [A] V V= t -d[A] [A] -d[A] = k[A] dt Rappel de calcul de la vitesse d’une réaction A K1 P V = V de disparition de A (d’apparition de P): A K1 K2 V=− d[ A] d[P ] = K 1 [ A] = dt dt P V de l’allée = V de disparition de A (apparition de P):V = − d[ A] d[P] = K [ A] = 1 dt dt V de retour = V d’apparition de A (disparition de P): V = − équilibre K1[A] = K2[P] Keq = K1 [P ] = K 2 [A ] d[P ] d[ A] = K 2 [P] = dt dt K1 A+B P K2 V de l’allée= V de disparition de A et B (apparition de P ): V = K1[A][B] V de retour= V d’apparition de A et B (disparition de P): V = K2[P] K1 [P] = Keq= K 2 [ A ][B] équilibre K1[A][B] = K2[P] K1 A +B K2 C+ D V de l’allée= V de disparition de A et B (apparition de C et D): V=K1[A][B] V de retour= V d’apparition de A et B (disparition de C et D): V=K2[C][D] K1[A][B] = K2[C][D] Keq= K1 [C][ D] = K 2 [ A ][B ] 2- CINETIQUE DES REACTIONS ENZYMATIQUES Ce qui est fondamental dans les réactions enzymatiques, c’est la combinaison E-S. Après formation du complexe, le substrat est transformé en produit et l’enzyme retrouve sa structure initiale. S +E K1 K2 ES K3 K4 P +E La V de la réaction enzymatique est influencée par: [S], [E], température, pH, effecteurs. 2.1- V de la réaction en fonction de [S] L’étude de la cinétique enzymatique a été réalisée essentiellement par Michaelis et Menten en 1913. 2.1.1 Courbe de Michaelis-Menten [E] fixe et faible V V=Vmax [E] =[ES] Saturation de l’enzyme Vmax Ordre 0 Courbe de Michaelis-Menten Ordre 1 S S S S S S S S S S S S S S S S S [S] Interprétation de la courbe de MM - Aux faibles conc de substrat, la vitesse de la réaction est proportionnelle à celle du substrat (réaction d’ordre 1) - Lorsque la conc de S augmente, la vitesse ne s’accroît plus dans les mêmes proportions (réaction d’ordre mixte) - Aux fortes conc de S la vitesse devient constante, indépendante de cette concentration (réaction d’ordre 0): l’enzyme est saturée par son substrat. Ce phénomène est particulier à la cinétique enzymatique. 1.1.2- Détermination de l’équation de Michaelis-Menten K1 S+ E K2 S +E ES K3 K1 K2 ES K3 K4 Conditions initiales P +E ES (rapide) V= f([S]) ? [E] = concentration totale de l’enzyme [ES] = concentration du complexe Enz-Sub [E]L = concentration de l’enzyme libre P + E (lente) [E] = [E]L+ [ES] [E]L= [E] - [ES] V= K3[ES] Vitesse de formation de [ES] = Vitesse de disparition de [ES] = d[ES] = K1[E]L[S] = K1([E]-[ES])[S] dt - d[ES] = K2[ES] + K3[ES] = [ES] (K2+K3) dt Etat stationnaire: V de formation de [ES] = V de disparition de [ES] K1([E]-[ES])[S] = [ES] (K2+ K3) K1([E]-[ES])[S] = [ES] (K2+ K3) ([E]-[ES])[S] [ES] (K2+K3) = KM = K1 [E][S] - [ES][S] = [ES] KM [E] [S] [ES] = [ES](KM+[S]) = [E][S] Or, V = K3[ES] V KM+[S] = K3 [E] [S] V=Vmax [E]=[ES] KM+[S] Vmax = K3 [E] V= Vmax [S] KM+[S] Equation de M-M V= Vmax [S] KM+[S] Cas particulier Si V= Vmax 2 Vmax = Vmax [S] 2 KM+[S] 2[S]= KM +[S] KM = [S] V Vmax Vmax 2 KM [S] 1.1.3- Signification de Vmax et de KM Vmax est atteinte lorsque toute l’enzyme est saturée par le substrat KM est la valeur de S pour laquelle la vitesse de la réaction est Vmax/2 KM est une grandeur expérimentale qui peut varier avec la structure du S, le pH, la température. Chaque enzyme a un KM caractéristique pour un S KM indique l’affinité de l’enzyme pour le S KM affinité 1.1.4- Représentation de Linweaver et Burk [S] KM 1 = KM +[S] = + V Vmax [S] Vmax [S] Vmax [S] 1 V V= Vmax [S] KM+[S] 1 1 + 1 KM = V Vmax [S] Vmax Y = a x + b KM/Vmax 1/Vmax -1/KM 1 [S] Cette représentation offre l’avantage de permettre la détermination plus précise de KM et Vmax. De plus, étant une droite, elle nécessite moins de points expérimentaux. 1.2- Influence de la concentration en enzyme V V E3 E2 E1 [S] [E] La vitesse d’une réaction est proportionnelle à la quantité d’enzyme 1.3- Influence de la température V to optimale Mouvement des molécules Dénaturation de la protéine température 20 30 40 50 60 1.4- Influence du pH V cholinestérase pepsine La plupart des enzymes 2 Le pH agit: 4 6 8 10 12 Conformation de la protéine Association E-S Action catalytique de l’enzyme pH 1.5- Effet des effecteurs Rôle des effecteurs: Physiologique: Régulation du métabolisme cellulaire Biochimique: Permettre de mieux comprendre le mode d’action des enzymes compétitive réversibles inhibiteurs irréversibles activateurs effecteurs allostériques non compétitive incompétitive 1.5.1- Inhibiteurs 1.5.1.1- Inhibition réversible 1.5.1.1.1- Inhibition compétitive Exercée par un composé dont la structure ressemble à celle du S E + S E + I KI = K1 K2 ES S E + P EI (Inactif) [E] [I] [EI] [EI] = [E] [I] KI [E] = [E]L + [ES] + [EI] Vmax [S] V = KM(1+[I]/KI) + [S] K’M K’M= KM(1+[I]/KI) i Vmax [S] V = KM(1+[I]/KI) + [S] 1 V [I] 1 1 + (1+ ) = KI [S] Vmax Vmax KM V Sans I [I] Vmax 1/ V [I] Vmax/2 1/Vmax [S] KM K’M K’’M KM -1/KM -1/K’M -1/K’’M affinité Quand [S] augmente , l’effet de l’inhibiteur disparaît: L’inhibition compétitive est levée par un excès de substrat Vmax n’est pas modifiée 1/[S] Exemples: La succinate déshydrogénase COOH COOH Succinate déshydrogénase CH2 CH2 CH FAD FADH2 COOH CH COOH succinate Fumarate COOH COOH CH2 CH2 CO COOH malonate COOH oxaloacétate Inhibiteurs compétitifs de la succinate déshydrogénase Inhibition par le produit de la réaction Glucose 6 phosphatase Glucose 6P + H 2O glucose + H3PO4 Les amines quaternaires sont des inhibiteurs compétitifs de la cholinestérase CH3 CH3 N+ CH2 CH2 O CO acétylcholinestérase Choline + ac. acétique CH3 CH3 acétylcholine R1 R2 R3 N+ R4 Amines quaternaires Antimétaboliques En s’introduisant dans l’organisme, ils donnent naissance à des composés anormaux et ralentissent certains métabolismes. fluorouracile 2-amino adénine La sulfamide Action anti-cancéreuse NH2 NH2 COOH SO2-NH2 bactérie N-ptéridine +Ac. para amino-benzoïque + Glu E Ac. folique X des bactéries Ac. para aminobenzoïque sulfamide Action antibactérienne 1.5.1.1.2- Inhibition non compétitive E + S E + I ES + I ES EI ESI E S + P inactifs i Cu2+, Ag2+… [E]= [E]L+ [ES] + [EI]+ [ESI] V’max V= Vmax [S] 1+ [I]/KI KM + [S] V Vmax V’max a V’’max b KM 1 1 (1+[I]/KI) + (1+[I]/KI) = [S] Vmax Vmax V 1 1/V [i] sans i 1/V’’max 1/V’max 1/Vmax [S] 1/[S] -1/KM Ce type d’inhibition n’est pas levé par un excès de substrat KM est inchangé, l’affinité de E pour S n’est pas affectée Vmax est diminuée par l’inhibiteur Le type le plus courant de cette inhibition se produit avec des réactifs capables de se combiner réversiblement avec les groupement SH des radicaux Cys indispensables à l’activité enzymatique comme les métaux lourds (Cu2+, Ag2+, Hg2+…..) Certaines enzymes par contre, ont besoin de certains ions comme Mg2+, cet ion peut être chélaté par EDTA (éthylène diamine tétra acétique). 1.5.1.1.3- Inhibition incompétitive l'inhibiteur ne se lie que sur ES S E + S ES + I ESI [E]= [E]L+ [ES] + [ESI] E +P Vmax i [S] 1+[I]/KI V= KM + [S] 1+[I]/KI V Vmax sans I V’max i 1 1 1 = KM (1+[I]/KI) + V Vmax [S] Vmax 1/V 1/V’ max 1/Vmax [S] -1/KM’ -1/KM 1/[S] Cet inhibiteur déplace l’eq, abaisse KM. Une partie de ES reste bloquée sous forme ESI, donc Vmax est diminuée Tableau récapitulatif des inhibitions réversibles KM Compétitive Non compétitive Incompétitive Vmax Pente 1.5.1.2- Inhibition irréversible: inactivation totale de l’enzyme 1er exemple: E-S-CH2-CONH2 + HI E-SH + ICH2CONH2 E à Cys l’iodoacétamide Complexe inactif réaction irréversible 2ème exemple: Diisopropyl fluorophosphate (DFP) : arme biologique E - CH2 F CH3 E-CH2OH + E à Ser CH CH3 O P O CH CH3 CH3 O DFP O CH3 CH CH3 O P O CH CH3 CH3 O réaction irréversible Complexe inactif Ex. enzyme à sérine: acétylcholinestérase 3ème exemple: Acide cyanhydrique (HCN): Poison respiratoire Forme un complexe stable avec le fer des cytochromes (enzymes respiratoires cellulaires) et provoque leur inhibition + HF 1.5.2- Activateurs 1.5.2.1- Activation par protection de l’enzyme Des composés qui protègent les enzymes contre les oxydations dans les enzymes à Cys se comportent comme des activateurs E-SH + SH-G E à Cys E-S ------ SG + H2 Glutathion 1.5.2.2- Activation par les ions Concerne les enzymes qui nécessitent des ions pour leur activité Exemple: Mg2+ est un activateur des kinases 1.5.2.3- Activation par action sur les subunités enzymatiques Protéine kinase protéine + Protéine-P + ATP ADP Les protéines kinases sont activées par l’AMPc Site actif Site de fixation de l’activateur C + R E inactive S AMPc C + Subunité catalytique active R AMPc 3- ENZYMES ET EFFECTEURS ALLOSTERIQUES 3.1- Cinétique des E allostériques 3.1.1- V en fonction de [S] Interprétation de la courbe des E allostériques V E michaelienne - Les petites quantités de substrat sont transformées lentement - La vitesse augmente à partir d’un seuil E allostérique - Effet coopératif [S] Contrairement aux enzymes michaeliennes, les enzymes allostériques n’exercent leur action qu’à des concentrations en substrat élevées ont une structure quaternaire, formées d’un nombre pair de sous unités. S La fixation de S au 1er site entraîne un changement A de conformation des autres sites, ce qui modifie l’affinité pour le S. On dit qu’il y a un effet coopératif. En plus du site actif où se fixe le substrat, l’enzyme possède un ou plusieurs sites allostériques où peuvent se fixer des effecteurs allostériques (activateurs ou inhibiteurs). Ces effecteurs n’ont aucune analogie structurale avec le substrat. i 2.2- Action des effecteurs allostériques Ce sont des substances qui agissent comme activateurs ou inhibiteurs en modifiant la conformation des sites de liaison au substrat, ce qui change l’affinité pour le substrat Activateurs allostériques Augmentent l’affinité de l’enzyme pour le substrat, lui permettant d’agir à de faible concentration en substrat inhibiteurs allostériques Activateur V Comme les inhibiteurs non compétitifs diminuent l’affinité de l’enzyme pour le substrat Vmax 2 KM(a)KM KM(I) Inhibiteur [S] 2.3- Model des E allostériques S S Model de Monod Wyman et Changeux (MWC) 1- possèdent 2 sites: site actif et des sites régulateurs (activateur et inhibiteur) i A 2- formées de plusieurs sous unités identiques (= protomères) 3- existent sous 2 états en équilibre: état catalytique R et état inhibé T R A ou S T i Relâché Tendu (actif) (inactif) transition allostérique Allostérie Autre forme 4- effet coopératif:du à la présence de plusieurs sous unités (protomères) la fixation d’une molécule de S sur un protomère déplace l’équilibre vers la forme active 2.4- Importance des enzymes allostériques Ont un rôle de régulation très important dans la cellule: Permettent l’adaptation du métabolisme au besoin de la cellule En général l’enzyme allostérique catalyse la 1ère réaction, limitante d’une voie métabolique Son activité peut être contrôlée par des activateurs ou inhibiteurs appartenant à cette voie métabolique A E1 B E2 C E3 D E E allostérique Inhibition feed back ou retroinhibition X X= inhibiteur allostérique Les effecteurs allostériques ont une action spécifique sur les enzymes allostérique, en se fixant sur leur sites allostériques MECANISME DE LA REACTION ENZYMATIQUE 1- Chymotrypsine: hydrolyse les peptides au niveau de la Tyr et de Phe R-CO-NH-R’ + H2O RCOOH + NH2-R’ Le site actif : His 57, Asp 102 et Ser 195 1ère étape: acylation peptide H O C O R' H O N C R' N C N O- H N H O- (Asp102) (His 57) CH2 O N C R O (Asp102) (His 57) (Ser 195) Enzyme H O R H N CH2 (Ser 195) Enzyme acylchymotrypsine 2ème étape: désacylation O H O C O - H H N N O C (His 57) C O CH2 N N H O- (Asp102) (His 57) (Ser 195) Enzyme acylchymotrypsine C H R O (Asp102) OH O O CH2 (Ser 195) Enzyme R 2- Acétylcholinestérase enzyme Site anionique His NH Site estérasique CH2 CH3 acétylcholine CH3 + N N CH2 CH2 O O OH CH2 C CH3 Ser CH3 un déplacement d’électron va fragiliser la liaison ester et provoquer sa rupture HO Tyr H 2O CH3 CH3 N+ O CH2 CH3 choline CH2 OH + HO C CH3 Ac. acétique 3- Transaminases Permettent le transfert réversible du groupement amine d’un AA à un acide α cétonique. Le coenzyme des transaminases est le phosphate de pyridoxal Site actif d’une transaminase OH CH3 OH CH3 HOOC HOOC N CH NH2C HO R CH H 2O CH2 O P N R N CH2 O P Base de schiff COOH OH CH3 + H 2O HOOC C R R N N C O OH CH3 + N NH2 CH2 O P Ac. α cétonique CH2 O P Phosphate de pyridoxamine DOSAGE DES ENZYMES La quantité d’enzyme peut être mesurée par son activité enzymatique E A + B C Pour déterminer l’activité enzymatique, il faut connaître: 1- la stœchiométrie de la réaction 2- les besoins de l’enzyme en cofacteurs 3- KM 4- le pH optimum de l’enzyme 5- la gamme de température oùl’enzyme est stable 6- une méthode analytique permettant la détermination de la concentration du substrat qui disparaît ou du produit obtenu 1- Unité de l’activité enzymatique Unité internationale (UI) = la quantité d’enzyme qui produit la transformation d’une micromole (µ mole) de S par min à 25oC Le katal (kat) = la quantité d’enzyme transformant une mole de substrat par sec Activité spécifique = le nombre d’UI par mg de la protéine enzymatique DO = ε [C] l NAD+ (forme oxydée) DO NADH (forme réduite) 260 AH2 + NAD+ 350 E Longueur d’onde (nm) A + NADH + H+ 2- Intérêt de dosage des enzymes Le fonctionnement normal de l’organisme est le résultat de l’action harmonieuse de tous les systèmes enzymatiques Dosage des enzymes dans les liquides biologiques et les tissus révèle des anomalies pathologiques: Phosphatase acide dans le sérum Cancer de la prostate La présence de certaines enzymes dans le sérum est le signe d’une nécrose tissulaire Mais dans certains cas la même activité enzymatique peut être due a les enzymes différentes selon leur origine tissulaires. C’est le cas des isoenzymes L’électrophorèse des isoenzymes permet de localiser l’origine de la nécrose 3- Les isoenzymes Ce sont des enzymes qui ont la même propriété catalytique mais qui différent par leur propriétés physicochimique. Les isoenzymes peuvent différer d’un tissu à un autre. LDH Ac. pyruvique Ex.: Lactate déshydrogénase (LDH): Ac. lactique LDH: 4 sous unités de 2 types, H et M Forme H (coeur) Forme M (muscle et foie) 1 2 3 4 5 - + dépôts 1 2 Coeur 3 4 5 Muscle et foie En plus de ces anomalies, il existe des déficits héréditaires de certaines enzymes qui sont à l’origine de maladies métaboliques graves: Ex: maladie Enzyme altérée Albinisme: Tyrosine hydroxylase Phénylcétonurie: Phénylalanine hydroxylase Homocystinurie: Cystathionine β synthétase
