Bioch.cours Enzymologie – Neel. 1/6 Biochimie. Enzymologie. 1) Une nécessité : le catalyseur – enzyme : les réactions chimiques sont régit par la loi d’action de masse : A+B↔C+D Keq = [C].[D] [A].[B] Exemple : 2 CO2 ↔ 2 CO + O2. Cependant, les réactions sont très lentes et la vie serait impossible sans la présence de catalyseurs. Les catalyseurs : Ils diminuent l’énergie d’activation et augmentent la vitesse de réaction. Mais ils n’apparaissent pas Energie libre. Energie d’activation sans catalyseur. dans l’équation. Avec catalyseur. Etat initial. Dans 99% des cas, se sont des protéines = des enzymes (♀). En effet quelques ARN peuvent être ΔG de la réaction globale. Etat final. des catalyseurs. En général ils catalysent une réaction spécifique. 1) Nomination des enzymes : En général, on utilise le suffixe –ase. Si l’enzyme a une fonction spéciale : Graisse. Lipase. Amidon. Amylase. Oxydation. Oxydase. Déshydrogénation. Déshydrogénase. Décarboxylation. Décarboxylase. Déroulement de la réaction Bioch.cours Enzymologie – Neel. 2/6 Le nom est en deux parties : Radical_ : nom du substrat. _suffixe : ase. Exemple : Hexokinase. ATP + D-hexose D-hexose-6-P + ADP. L’hexokinase est appelée : ATP D-hexose phosphotransférase. 2) Fonctionnement d’une enzyme : Ce sont des protéines de grande taille qui possède une région spécifique de catalyse : le site actif. Les acides aminés des enzymes participent à la fixation du substrat et maintiennent la structure tridimensionnelle. Ce sont les changements de types de liaison (ionique, Van der Waals) qui permettent la catalyse. A la fin de la réaction, il y a un retour à l’état initial. S’il y a une délétion d’un acide aminé au niveau du site actif, l’enzyme ne fonctionne plus. Mais si cette délétion est proche du site actif, il peut y avoir une baisse de l’activité enzymatique. Les conséquences varient selon la localisation de la mutation. Parfois, les enzymes ont besoin de la présence de métaux rares proches de leur site actif pour fonctionner correctement. Certaines ne peuvent avoir d’activité catabolique qu’en présence d’une coenzyme. Système complet : holoenzyme = apoenzyme (l’enzyme proprement dite) + coenzyme. La coenzyme peut être reliée par une liaison faible (le plus souvent, ionique, Van der Waals) ou par une liaison covalente. Dans le cas de liaisons faibles la coenzyme est considéré comme un cosubstrat. Exemple : rôle important en anaérobie. CH3 – CO – COOH Pyruvate. CH3 – CHOH – COOH Lactate. NAD + H+. Coenzyme : lacticodéshydrogénase. D + G. D. NAD +. CoE. A + G. CoE + G. A. Bioch.cours Enzymologie – Neel. 3/6 3) les grandes familles de coenzyme : - facteurs coenzymatique à structure nucléotidique : l’ATP est une source d’énergie facilement utilisable. Mais elle joue aussi le rôle de transporteur de phosphore dans l’activation des sucres (oses) et des aminoacides. C’est quasiment un cosubstrat : ATP + R–OH R–OP + ADP. - nucléotide complexe : Coenzymes pyrimidiques : dérivée de la vitamine PP (amide nicotinique) antipellagreuse. Elles servent de transporteur d’hydrogène avec :-NAD : nicotinamide dinucléotide (= niacine). -NADP. Enzymes flaviniques : dérivée de la vitamine B2 : la riboflavine. Elles servent de transporteurs d’hydrogène (par exemple : dans le cycle de Krebs). Ce sont : -FMN : Flavine Mono Nucléotide. -FAD : Flavine Adénine Dinucléotide. ACP : Acyl Carrier Protein : ce sont des activateurs de la synthèse des acides gras. Ils sont dérivés de l’acide pantothénique. La coenzyme A (CoA) : dérivée de l’acide pantothénique (la vitamine B5). Elles activent les acides gras : Vit. B5 + Cystéine amine + ADP CoA. la méthyl cobalamine / 5’désoxyadénine cobalamine : elles sont dérivées de la vitamine B12. leur rôle est de participer aux transferts de radicaux méthyl. Elles sont souvent associées à une autre coenzyme, la THF (Tétra Hydro Folate) : elle permet le passage du méthyl-malonylCoA au succinylCoA. Elle est dérivée de l’acide folique. Le folate permet le transport et l’interconversion des radicaux monocarbonés (méthyl, formyl,…). Une carence en folate entraînera une anémie mégaloblastique. la B12 participe à la synthèse de bases puriques. Bioch.cours Enzymologie – Neel. 4/6 Exemple clinique : Une gastrite se traduit par un déficit en facteurs intrinsèques. Il existe donc un problème d’absorption de B12 donc une carence en folate et donc une anémie mégaloblastique. Il faut alors injecter la B12 pour corriger l’anomalie (étant donné que la prise de médicament per os sera inutile). SH | (CH2)2 Homocystéine. | H–C–NH3+ | COO– Méthionine. Méthionine synthase. S–CH3 | (CH2)2 | H–C–NH3+ | COO– Méthyl-cobalamine. B12 Méthyl H4 folate. H4 folate. Hydroxycobalamine. (dans le cytosol). B12 CH3 | H–C–COO– | C–S–CoA || O CH3 | H–C–H | C–S–CoA || O B12 5’ – désoxyadénosylcobalamine. Méthylmalonyl-CoA-mutase L-Méthylmalonyl-CoA. Succinyl-CoA. dérivé de la vitamine B6 : ce sont les pyridoxine, pyridoxal phosphate et pyridoxamine. Ils interviennent dans les réactions de désamination et de transamination. H | R1–CH–COOH + O=C–E | pyridoxal NH2 phosphate. acide aminé 1 Base de Schiff 1. Base de Schiff 2. Base de Schiff 3. acide aminé 2 + pyridoxal phosphate. Base de Schiff 4. Bioch.cours Enzymologie – Neel. - les coenzymes dans les réactions de carboxylation : CH3 –CO–COOH + TPP les dérivés de la vitamine B1 (thiamine pyrophosphate) : 5/6 COOH | CH3 –C–OH | TPP ils interviennent dans les réactions de décarboxylation : CH3 –C–H + TPP || O CO2 H | CH3 –C–OH | TPP la biotine (B8) permet la carboxylation. l’acide lipoïque : c’est un transporteur d’hydrogène, lorsque le pont S–S s’ouvre : CH2 CH2 | S CH2 CH2 | S CH2 CH2 COOH CH2 il est impliqué dans la décarboxylation oxydative de l’acide pyruvique et de l’acide αcétoglutarique. 4) Notion de Vitamine : ce sont des substances azotées indispensables à la vie. Elles doivent être fournies en petites quantités de façon continue, pour un fonctionnement normal de l’organisme. On est incapable de les synthétiser nous même, il nous faut donc les importer grâce à notre alimentation. Ce sont souvent des coenzymes. 5) Cinétique enzymatique : a) Notion de produit et de substrat : A B + C (par exemple : clivage catabolique) A+B C + D (échange de groupe) A+B C (synthèse) Substrat(s). Il se lie à l’enzyme. Plusieurs substrats possibles Produit(s). Parfois plusieurs produits. Bioch.cours Enzymologie – Neel. 6/6 Les enzymes sont présentes en très petites quantités. La quantification de ces molécules est donc très difficile. Heureusement, l’activité catalytique des enzymes nous fournit un moyen sensible et spécifique pour les mesures de la vitesse de la réaction catalysé par cette enzyme. La vitesse est d’ailleurs souvent proportionnelle à la quantité d’enzyme présente. On mesure soit la disparition du substrat, soit l’apparition du produit. On effectue des mesures colorimétriques à l’aide d’un spectromètre selon la loi de Berre Lambert : DO = cl. DO : densité optique (sans unité). : coefficient d’extinction molaire. c : la concentration. l : longueur du trajet optique. On utilise souvent comme unité le katal : c’est l’apparition d’1 mole de substrat à 30°C λ doit avoir la longueur d’onde d’absorption maximum. l λ I1 λ I0 I0 < I1. On fait ensuite une courbe d’étalonnage en prenant des valeurs connues : DO On mesure la densité optique sur le photospectromètre qui correspond sur la courbe à une concentration α d’un produit. A α B C Concentrations. Vitesse. Plusieurs facteurs vont affecter la réaction : Vmax. -la concentration du substrat. -la concentration du produit. -la présence d’inhibiteur. -la température (souvent proportionnelle à la vitesse de réaction) mais si trop élevée, dénaturation irréversible de la réaction. -le pH de la réaction. (optimal à 7 sauf dan les lysosomes ou le pH ≈ 4) La vitesse dépend de la quantité d’enzyme présente. Vitesse. E1. E2. E3. E1 > E2 > E3. S