ACTUALITÉS NÉPHROLOGIQUES 2010
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PLACE DES MICRO-ARN EN NÉPHROLOGIE ET TRANSPLANTATION par D. ANGLICHEAU* Les études d’expression des gènes se sont jusqu’alors essentiellement focalisées sur les ARN messagers (ARNm). Les micro-ARN (miARN) représentent une classe abondante d’ARN naturels non codants, hautement conservés au cours de l’évolution, de petite taille (~19-25 nucléotides), qui jouent un rôle clé dans la régulation de l’expression des gènes. Même si le premier miARN a été décrit en 1993 [1, 2], ce n’est qu’au cours des dernières années que la reconnaissance de leur rôle important dans la régulation des gènes a conduit à un intérêt croissant pour leur identification et leur caractérisation [3]. L’engouement créé par la découverte de ces petits ARN régulateurs conduit maintenant à leur étude dans tous les champs de la biologie et de la recherche biomédicale et des données émergeantes suggèrent aussi leur rôle dans des processus physiologiques ou pathologiques d’intérêt pour le néphrologue, comme la régulation du système immunitaire, la fibrogenèse, la kystogenèse… Notre objectif est ici de fournir les bases de compréhension de la biologie des miARN et de proposer une revue de la littérature sur l’implication des miARN en néphrologie et transplantation. * Service de Transplantation rénale et de Soins intensifs, Hôpital Necker, Université René Descartes, Paris. MÉDECINE-SCIENCES FLAMMARION/LAVOISIER – ACTUALITÉS NÉPHROLOGIQUES 2010 (www.medecine.lavoisier.fr) 168 D. ANGLICHEAU BIOLOGIE DES MICRO-ARN Découverte des micro-ARN On doit à l’équipe de Victor Ambros la première observation expérimentale qui conduira à la découverte des miARN. Cette équipe publie en 1993 un résultat original : un ARN de 22 nucléotides semble jouer un rôle capital lors du développement de Caenorhabidis elegans [1]. Fait notable, cet ARN ne code pas une protéine, mais réduit l’expression d’un autre gène en se fixant sur sa région 3’ non traduite. Il faut attendre 7 ans pour qu’un autre gène agissant de façon similaire soit rapporté [4] et c’est en 2001, avec trois articles originaux publiés dans la même édition du journal Science, que le terme miARN apparaît et que ce mécanisme de régulation de gènes apparaît fondamental après avoir été identifié également dans des organismes supérieurs [5-7]. Parallèlement à l’identification des miARN, on découvre la notion d’ARN interférence au cours de laquelle l’introduction d’un petit ARN double brin d’une vingtaine de nucléotides conduit à l’extinction de l’ARN messager porteur de séquences complémentaires et à la perte de fonction du produit du gène [8]. Ces deux découvertes parfaitement convergentes sont à l’origine de la démonstration d’un nouveau mode de régulation de l’expression des gènes. Synthèse des micro-ARN Les gènes des miARN peuvent être codés dans des unités transcriptionnelles indépendantes, dans des clusters polycistroniques ou dans les introns de gènes codant des protéines [9]. Les miARN sont d’abord transcrits par une ARN polymérase II dans le noyau, sous la forme de longs précurseurs (primary miRNA, pri-miRNA) [10]. Ces précurseurs sont alors clivés en un produit intermédiaire appelé « premiRNA » (precursor miRNA) par l’enzyme nucléaire Drosha, une ribonucléase spécifique des ARN double brin. Indépendamment de Drosha, une fraction des pré-micro-ARN d’origine intronique peut aussi être générée par l’action combinée du spliceosome et d’une enzyme appelée lariat-debranching enzyme (LDBR) [11]. Le pré-micro-ARN est un ARN long d’environ 70 nucléotides, replié en tige-boucle par complémentarité de bases imparfaite entre la première moitié et la deuxième moitié de sa séquence. Le pré-micro-ARN est ensuite transporté dans le cytoplasme via un mécanisme dépendant de l’exportine-5, où il est clivé par une enzyme de la famille Dicer qui le sépare de la boucle, pour libérer un petit ARN double brin de 19 à 25 nucléotides : dans ce petit duplex, le futur miARN est imparfaitement apparié à une molécule similaire (petit ARN long lui aussi d’une vingtaine de nucléotides). Au cours de la dernière étape de la maturation du miARN, ce duplex est ouvert ; un des brins de cette molécule s’associe avec une protéine de la famille Argonaute formant ainsi le complexe « RISC » (RNA-induced silencing complex), alors que le fragment complémentaire est dégradé. Mécanisme d’action des micro-ARN Quand le complexe RISC identifie l’ARNm cible complémentaire ou partiellement complémentaire de la séquence du miARN, il inhibe l’expression du PLACE DES MICRO-ARN EN NÉPHROLOGIE ET TRANSPLANTATION 169 gène par répression de la traduction ou par dégradation de l’ARNm. Les miARN ne sont souvent que partiellement complémentaires de leurs ARN cibles. Si la complémentarité est (quasi) parfaite entre le miARN et l’ARNm, l’ARNm cible est clivé et dégradé par une protéine Argonaute. Plus fréquemment, la complémentarité est imparfaite, et le mécanisme conduisant à l’inhibition de l’expression du gène est dans cette situation encore discuté, et pourrait impliquer l’inhibition de la traduction au niveau de l’initiation ou de l’étape d’élongation, la dégradation rapide de la protéine nouvellement synthétisée, la séquestration de l’ARNm dans des structures cytoplasmiques de stockage et de dégradation des ARNm appelées corps P (processing bodies, P-bodies), et/ou la dégradation de l’ARNm (revue dans [12]). Les sites de fixation des miARN sont généralement situés vers l’extrémité 3’ non traduite (untranslated region, UTR) des ARNm cibles. Fonctions des micro-ARN L’impact de la régulation de l’expression des gènes par les miARN semble particulièrement vaste : des centaines de miARN ont été clonés et des milliers ont été prédits par analyse bio-informatique [13]. Un seul miARN est directement responsable de la répression de centaines de gènes et régule le niveau d’expression de milliers d’autres [14], conduisant à l’hypothèse que de nombreux gènes sont régulés par des miARN [15]. Les miARN seraient capables de réguler au moins un tiers de l’ensemble du génome humain. On prédit également par analyse bio-informatique que la plupart des miARN sont capables de réguler des dizaines de gènes cibles. Enfin, de nombreux gènes peuvent avoir de multiples sites de fixation de miARN qui représentent des cibles pour un ou plusieurs miARN. Les miARN semblent jouer un rôle clé dans des processus biologiques divers comme le développement (revue dans [16]), la prolifération cellulaire, la différenciation, l’apoptose, l’oncogenèse [17]… La dérégulation de l’expression de miARN a aussi été associée à plusieurs cancers et d’autres types de maladies [18]. IMPLICATION DES MICRO-ARN EN NÉPHROLOGIE Développement du système urinaire L’implication des miARN dans des processus biologiques se fonde essentiellement in vivo sur l’invalidation du gène Dicer, qui code la ribonucléase responsable de la maturation des pré-micro-ARN en micro-ARN double brin. L’invalidation complète de Dicer conduit à une létalité embryonnaire [19]. Plus récemment, de nombreux travaux ont utilisé la technique de l’invalidation conditionnelle de gène pour aboutir à une extinction de Dicer spécifique d’un type cellulaire donné (voir ci-dessous). Pastorelli et coll. ont invalidé Dicer dans le bourgeon urétéral et donc, au cours du développement, dans l’épithélium du tube collecteur et l’urothélium [20] conduisant 170 D. ANGLICHEAU à des microkystes tubulaires originaires des tubes collecteurs et à une hydronéphrose apparaissant dès 3 semaines. Un transgène Pepck-Cre a été utilisé pour cibler l’invalidation de Dicer dans les cellules tubulaires proximales. Ces mutants, qui présentaient bien une diminution de l’expression de divers miARN dans le tissu cortical, avaient une histologie et une fonction rénales normales dans des conditions contrôles. En revanche ces mutants s’avéraient plus résistants à l’ischémie/reperfusion. Après 32 minutes d’ischémie rénale bilatérale suivies de 48 heures de reperfusion, l’urée était respectivement de 217 et 67 mg/dl et la créatininémie de 2,2 et 0,8 mg/dl chez les souris sauvages et les souris mutantes [21]. Développement des podocytes Trois groupes ont généré une invalidation spécifique de Dicer dans les podocytes en utilisant la même stratégie faisant appel à un transgène NPHS2-Cre [22-26]. Ces travaux ont démontré le rôle clé des miARN dans le développement, la structure et la fonction podocytaires. Dans ce modèle, les mutants deviennent protéinuriques en 2 à 4 semaines et évoluent vers l’insuffisance rénale terminale. Les anomalies podocytaires sont caractérisées par une hypertrophie, des vacuolisations, des effacements des pédicelles, une dédifférenciation marquée par une désorganisation du cytosquelette et une réduction précoce de l’expression de la synaptopodine. Le tableau évolue vers une atteinte glomérulaire caractérisée par une expansion mésangiale, des dépôts extracellulaires, des dilatations des capillaires glomérulaires et finalement une glomérulosclérose et une atteinte tubulo-interstitielle avec dilatations tubulaires et fibrose tubulo-interstitielle. Shi et coll. ont réalisé une analyse transcriptomique complémentaire qui a révélé que de nombreux ARN messagers dont l’expression était augmentée dans les glomérules mutants étaient potentiellement ciblés par miR-30 [25]. La famille de miARN miR-30 comporte six gènes sous forme de trois clusters de deux gènes sur trois chromosomes différents. Tous ses membres comportent la même séquence de reconnaissance des ARN messagers. Shi et coll. ont pu montrer que miR-30d avait une expression réduite dans les glomérules mutants alors que les précurseurs de miR-30 étaient augmentés. De plus, ils ont récemment montré que le transforming growth factorβ1 (TGF-β1) réduisait l’expression de miR-30 dans des podocytes en culture avec un impact sur l’expression de gènes cibles [27]. De façon concordante, nous avons montré que des cytokines pro-inflammatoires réduisaient l’exposition de miR-30a dans des cultures primaires de cellules épithéliales rénales [28]. Enfin, il a été montré que l’hyperexpression in vitro de miR-30a dans des cellules HeLa conduisait à une répression de centaines de protéines [29]. Tous ces résultats suggèrent l’implication significative des miARN de la famille miR-30 dans les cellules rénales. Transition épithélio-mésenchymateuse La transition épithélio-mésenchymateuse (TEM), un processus dynamique au cours duquel des cellules perdent leurs caractéristiques épithéliales et développent des propriétés mésenchymateuses, est actuellement reconnue, bien que contro- PLACE DES MICRO-ARN EN NÉPHROLOGIE ET TRANSPLANTATION 171 versée, comme un contributeur important de la fibrose rénale. Plusieurs miARN, incluant miR-205 et les miARN de la famille miR-200 (miR-200a, miR-200b, miR-200c, miR-141, miR-429) semblent jouer un rôle majeur dans l’induction de l’EMT induite par le TGF-β1 dans les cellules tubulaires rénales [30]. Ces miARN répressent les facteurs transcriptionnels ZEB1 et S1P1 qui eux-mêmes répressent l’expression de E-cadhérine. Par conséquent, la répression de ces miARN libère ZEB1 et S1P1 qui viennent réduire l’expression de E-cadhérine et induire ainsi le phénomène d’EMT. Diabète Plusieurs travaux récents suggèrent l’implication des miARN au cours du développement de la néphropathie diabétique. Kato et coll. ont montré qu’un miARN, miR-192, avait une expression augmentée sous l’effet du TGF-β1 in vitro dans les cellules mésangiales et in vivo dans les glomérules dans un modèle murin de diabète induit par la streptozotocine [31]. Ils ont pu montrer que miR-192 ciblait et diminuait l’expression de la protéine régulatrice S1P1 (E-box repressor Smad-1 interacting protein). Cette protéine se fixe sur les régions promotrices du gène Col1a2. Par conséquent, la répression de S1P1 induite par miR-192 est susceptible d’augmenter les dépôts de collagène induits par le TGF-β1. Le même groupe a récemment rapporté des informations clés sur l’implication de miARN dans la régulation de Akt par le TGF-β1 [32]. Il a en effet été montré que le TGF-β active Akt dans les cellules mésangiales en induisant miR-216a et miR-217, ces deux miARN ciblant PTEN (phosphatase and tensin homologue), un inhibiteur de l’activation de Akt. Ces deux miARN sont localisés dans le second intron d’un ARN non codant dont le promoteur est activé par le TGF-β et miR-192, selon un mécanisme qu’ils avaient démontré antérieurement [31]. L’activation de Akt par ces miARN conduit à une survie des cellules glomérulaires mésangiales et à leur hypertrophie, deux caractéristiques similaires aux effets du TGF-β. Pour résumer, ces travaux mettent en évidence un mécanisme d’activation de Akt liée à une répression de PTEN par deux miARN qui sont régulés en amont par le TGF-β et miR-192. Wang et coll. ont montré que l’expression de miR-377 est augmentée dans plusieurs modèles de néphropathie diabétique et dans des cellules mésangiales exposées à de fortes concentrations de glucose ou au TGF-β1 [33]. L’hyperexpression stable de miR-377 dans des cellules mésangiales augmente l’expression de fibronectine dans ces cellules, de même que celle d’autres gènes potentiellement importants dans la physiopathologie de la néphropathie diabétique. Polykystose hépatorénale Un micro-ARN pourrait jouer un rôle important dans la kystogenèse. Lee et coll. ont étudié le profil d’expression des miARN dans des cholangiocytes dans un modèle de rat de polykystose rénale autosomique récessive, mais aussi dans le foie de ces animaux et de patients porteurs de polykystose hépatique et ont démontré une réduction d’expression de miR-15a dans toutes ces circonstances [34]. Ce micro-ARN répresse le régulateur du cycle cellulaire Cdc25a. Au total, 172 D. ANGLICHEAU il est suggéré que miR-15a pourrait induire la formation de kystes en induisant une prolifération cellulaire induite par Cdc25a. Dans le modèle murin HANSPRD de polykystose rénale, une étude des profils d’expression d’ARN messagers et de miARN a mis en évidence des anomalies d’expression nombreuses accompagnant la kystogenèse portant sur 935 ARN messagers et 30 miARN, et la mise en évidence in silico de couples fonctionnels potentiels ARN messager/ miARN [35]. Autres néphropathies La séquence du miARN miR-23b apparaît capable de cibler plusieurs membres de la cascade de signalisation TGF-β1/Smad. Un travail préliminaire de Shang et coll. suggère l’implication de miR-23b au cours des néphropathies par le biais d’une modulation du complexe TGF-β1/Smad [36]. L’expression podocytaire et tubulaire de miR-23b est augmentée dans les reins de souris transgéniques Albumine/TGF-β1 et chez des rats après néphrectomie subtotale. In vitro, l’exposition de podocytes et de cellules tubulaires au TGF-β1 augmente l’expression de miR-23b. Plusieurs gènes d’intérêt ont pu être vérifiés in vitro comme cibles de ce miARN incluant le récepteur de type II du TGF-β, Smad3 et le TGF-β1 lui-même, suggérant l’existence d’une boucle de régulation négative de la voie de signalisation du TGF-β1. La modulation de l’expression de miR-23 dans les podocytes en culture altère l’expression de synaptopodine, WT1, de la néphrine et de la podocine et influence la motilité des cellules tubulaires en culture, l’hyperexpression de miR-23b diminuant la motilité et la répression de miR-23b augmentant la motilité des cellules tubulaires. La même équipe a récemment rapportée l’implication possible de miR-21 au cours des néphropathies [37]. miR-21 est un miARN ubiquitaire d’expression fréquemment augmentée dans les cancers, agissant comme un oncogène (« oncomir ») et lié à la différenciation, la prolifération cellulaire, l’apoptose et la régulation de la matrice extracellulaire. Ce miARN a été détecté dans les cellules tubulo-interstitielles du rein normal et ce groupe a montré qu’il était surexprimé dans les glomérules de souris transgéniques Albumine/TGF-β1, dans des reins de rats après néphrectomie subtotale des 5/6e et enfin au cours de néphropathies d’origine diverse chez l’homme. Chez les souris transgéniques Albumine/ TGF-β1, l’inhibition de miR-21 conduit à une augmentation de l’expression d’ARN messagers cibles de miR-21 incluant Pdcd4, PTEN et Smad7. L’augmentation d’expression des cibles de miR-21 est corrélée avec une réduction du nombre de podocytes et une augmentation du clivage de la caspase-3. In vitro, miR-21 inhibe l’apoptose de podocytes et de cellules épithéliales tubulaires en culture en réprimant plusieurs gènes pro-apoptotiques (Pdcd4, p53) et active des métalloprotéinases matricielles. Un groupe a étudié le profil d’expression des miARN dans les biopsies rénales de patients atteints de néphropathie à dépôts mésangiaux d’IgA [38] et de lupus [39]. Toutefois, d’importantes limitations méthodologiques, en particulier le très faible nombre d’échantillons, rendent les résultats d’interprétation très délicate [40]. Le Tableau I résume les principaux miARN aux fonctions reconnues dans le rein et les néphropathies. 173 PLACE DES MICRO-ARN EN NÉPHROLOGIE ET TRANSPLANTATION TABLEAU I. – MICRO-ARN AUX FONCTIONS RECONNUES DANS LE REIN ET LES NÉPHROPATHIES. miR GÈNES CIBLES EXPRESSION ET RELATION AVEC VALIDÉS LES NÉPHROPATHIES RÉFÉRENCE miR-15a Cdc25a Modèle de rat polykystique [34] miR-17-92 PTEN et Bim Glomérules hypertrophiés, hypercellularité, expansion mésangiale, protéinurie [75] miR-21 – Expression glomérulaire et interstitielle ; inhibition de l’apoptose [37] miR-23b – Expression podocytaire et tubulaire ; modulation de la voie de signalisation du TGF-β [36] Famille miR-30 CTGF Forte expression glomérulaire (et perte d’expression chez les souris Dicer–/–) [22, 23, 25] miR-192 ZEB1 et ZEB2 Expression rénale augmentée chez les souris diabétiques et par le TGF-β dans les cellules mésangiales de souris ; expression augmentée par les fortes concentrations de glucose dans les cellules mésangiales humaines ; responsable d’une synthèse de collagène [31-33] Famille miR-200 ZEB1 et ZEB2 Transition épithélio-mésenchymateuse [30, 76] Cluster miR-216a, PTEN, YB-1 miR-217 Expression rénale augmentée chez les souris diabétiques et par le TGF-β dans les cellules mésangiales de souris [32] miR-377 Expression augmentée par les fortes concentrations de glucose dans les cellules mésangiales humaines ; responsable de synthèse de fibronectine [33] PAK1 et MnSOD CTGF : connective tissue growth factor ; TEM : transition épithélio-mésenchymateuse ; miR : microARN ; MnSOD : manganèse superoxyde dismutase ; PAK1 : p21-activated kinase ; PTEN : phosphatase and tensin homolog ; YB-1 : Y-box protein-1. IMPLICATION DES MICRO-ARN EN IMMUNOLOGIE ET EN TRANSPLANTATION Implication des micro-ARN dans le système immunitaire Des données récentes suggèrent le rôle des miARN dans la régulation du développement des cellules de l’immunité et dans la modulation de l’immunité innée et adaptative [41, 42]. Le Tableau II résume les principaux miARN aux fonctions reconnues en immunologie. 174 D. ANGLICHEAU TABLEAU II. – MICRO-ARN HUMAINS AUX FONCTIONS RECONNUES EN IMMUNOLOGIE. MIR GÈNES CIBLES FONCTION let-7i TLR4 Régule la réponse innée [64] miR-16 TNF-α Fixation aux régions ARE des extrémités 3’ non traduites ; induit la dégradation de TNF-α [77] miR-17-5p AML-1 Inhibe la prolifération, la différenciation et la maturation des monocytes [78] miR-17~92 Bim, PTEN (cluster) Régule la transition pro- vers pré- du dévelop- [58, 59, 75] pement B et T miR-20a AML-1 Inhibe la prolifération, la différenciation et la maturation des monocytes [78] miR-32 PFV1, ORF2 Limite la réplication du PFV1 en ciblant le génome viral [66] miR-106a AML-1 Inhibe la prolifération, la différenciation et la maturation des monocytes [78] mir-125b TNF-α Diminue au cours de la réponse à l’inflammation permettant la production de TNF-α [63] miR-132 – Régule la réponse immunitaire aux infections bactériennes ; impliqué dans la voie de signalisation CREB [51] miR-146a TRAF6, IRAK1 Expression macrophagique et épithéliale augmentée après activation des TLR-2, -4 et -5 ou exposition au TNF-α ou à IL-1b ; régule la réponse immunitaire aux infections bactériennes RÉFÉRENCE [51] miR-150 Myb Régule la production de lymphocytes B matures ; régule la transition pro- vers pré-B ; régule l’activation des lymphocytes T [44, 57] miR-155 PU.1, c-Maf Régule la réponse immunitaire aux infections [50, 51, 63] bactériennes/virales ; requis pour les fonctions lymphocytaires normales, la réponse des centres germinatifs, la commutation de classes, la génération de plasmocytes ; détermine la différenciation Th1/Th2 ; stimule la prolifération granulo-monocytaire [45, 57, 65] miR-181a DUSP5, DUSP6, Régule le développement B/T ; module la SHP2, PTPN22, sensibilité des lymphocytes T aux antigènes en BCL-2, CD69 contrôlant l’expression de multiples phosphatases de la voie de signalisation du TCR miR-181b AID Commutation de classes des lymphocytes B activés miR-223 – Régule la granulopoïèse miR-122 – Requis pour la réplication du virus VHC [47] [55, 56] [67] ARE : AU rich element ; TLR: Toll like receptor ; PFV-1: primate foamy virus type 1 ; TCR: T cell receptor ; VHC: virus de l’hépatite C. PLACE DES MICRO-ARN EN NÉPHROLOGIE ET TRANSPLANTATION 175 MICRO-ARN ET DÉVELOPPEMENT ET MATURATION DES CELLULES DE L’IMMUNITÉ Des études récentes montrent le rôle des miARN dans le développement et la maturation lymphocytaire [43, 44] et dans la différenciation des lignées hématopoïétiques [45]. Par exemple, la caractérisation du répertoire de miARN de cellules lymphocytaires T à différents stades de maturation a révélé des modifications dynamiques définissant une signature de miARN spécifique de chaque stade [46]. En particulier, le miARN miR-181 est élevé au stade de cellules doubles-positives, quand les thymocytes exprimant à la fois le CD4 et le CD8 subissent la sélection positive et la sélection négative, suggérant le rôle de miR-181 dans ce processus. Si ce miARN est hautement exprimé par les cellules thymiques, il l’est moins dans les ganglions lymphatiques et dans la moelle osseuse. Dans les lymphocytes B dérivés de la moelle, l’expression de miR-181 diminue au cours du développement lymphocytaire B du stade pro-B au stade pré-B [45]. Ce miR-181 pourrait aussi jouer un rôle dans la régulation du développement lymphocytaire dans la mesure où l’expression de miR-181a dans les cellules souches hématopoïétiques et les cellules progénitrices conduit à une augmentation des cellules CD19+ et à une diminution des cellules CD8+ [45]. De plus, il a récemment été montré que miR-181b régulait les permutations de classe des lymphocytes B activés [47]. Le miARN miR-155 semble jouer un rôle important dans la maturation des cellules de l’immunité. Les cellules hématopoïétiques matures ont une expression de miR-155 plus faible que les cellules souches hématopoïétiques [48]. En revanche, ce miARN est rapidement induit dans les lymphocytes B et T après engagement de leur récepteur à l’antigène et chez différents types de leucocytes après exposition à des médiateurs de l’inflammation [43, 49-51]. La fonction de miR-155 semble ainsi être libérée au cours de la réponse immune à l’infection. L’importance d’une régulation adaptée de miR-155 est confirmée par le fait qu’il est anormalement surexprimé au cours de plusieurs hémopathies malignes et par sa capacité à déclencher des syndromes myéloprolifératifs ou des lymphomes à cellules B lorsqu’il est surexprimé dans plusieurs modèles animaux [52]. À un état de base non stimulé, l’absence de miR-155 ne conduit à aucune anomalie notable des lignées hématopoïétiques [43, 53]. En revanche les souris n’exprimant pas miR-155 ont une réponse humorale altérée à l’immunisation. Ce défaut a été caractérisé comme étant intrinsèque aux cellules B, lié à un défaut de formation des centres germinatifs et responsable d’une diminution de la permutation de classe en IgG1 [54]. Plusieurs gènes cibles de miR-155, comme PU.1 ou le gène codant la cytidine déaminase, semblent impliqués dans ce phénotype. Enfin, miR-155 semble aussi impliqué dans la régulation des lignées lymphocytaires T en induisant une différenciation Th1, possiblement par le ciblage du facteur transcriptionnel c-Maf [43, 53]. D’autres miARN semblent impliqués dans la régulation du développement des cellules hématopoïétiques, comme miR-223 qui régule la granulopoïèse [55, 56], miR-150 qui semble jouer un rôle clé dans la régulation de la différenciation lymphocytaire B [44, 57] ou le cluster miR-17~92 qui semble requis pour la transition du lymphocyte pro-B au lymphocyte pré-B [58, 59]. L’étude du profil d’expression des miARN dans les cellules T naïves, effectrices et mémoires a montré que l’expression de miARN très exprimés est modifiée au cours de la différenciation des cellules T [60]. Il a aussi été montré que les cellules 176 D. ANGLICHEAU T régulatrices sont caractérisées par un profil d’expression des miARN distinct de celui des lymphocytes T CD4+ conventionnels [61]. MICRO-ARN ET IMMUNITÉ INNÉE La technologie des microarrays sur des macrophages activés de souris a identifié le miARN miR-155 comme une voie commune de plusieurs types de médiateurs de l’inflammation [50], et trois miARN, miR-146a, miR-132 et miR-155, sont régulés en réponse à la stimulation par des endotoxines [51]. L’étude de l’induction de miR-146a par le LPS, le TNF-α et IL-1β a montré que cette induction était dépendante du NFκB et que les gènes cibles de miR-146a comportaient IL-1 receptor associated kinase (IRAK1) et TNF receptor-associated factor-6 (TRAF6), qui sont des composants clés de la voie de signalisation du Toll-like receptor 4 (TLR4). La fonction des miARN dans les macrophages est revue dans [62]. Dans des macrophages de souris, l’expression de miR-155 est augmentée par l’acide polyriboinosinic:polyribocytidylic [poly(I:C)], par l’interféron-β (IFN-β), et par divers ligands de TLR. Ces résultats suggèrent que miR-155 est aussi impliqué dans la réponse innée aux infections bactériennes et virales [50, 63]. D’autres miARN semblent impliqués dans la régulation de la réponse immune innée comme miR-125b, miR-132, miR-146a [51] ou encore let-7i qui régule l’expression de TLR4 [64]. MICRO-ARN ET IMMUNITÉ ADAPTATIVE Des miARN ont été impliqués dans la sensibilité des lymphocytes T aux pathogènes. Les cellules T qui surexpriment miR-181 présentent une activation plus forte de la cascade de signalisation du TCR en réponse à des complexes MHC-peptide de faible affinité [65]. Le phénotype de souris invalidées pour le gène miR-155 met en évidence le rôle complexe joué par miR-155 sur différents aspects de la réponse immune adaptative. L’absence de miR-155 conduit à une altération complexe de la réponse immune, évaluée par des tests fonctionnels sur les lymphocytes B, T et les cellules dendritiques, et conduit à l’échec d’acquisition d’une immunité protectrice contre des bactéries pathogènes [53]. D’autres études montrent le rôle de miARN au cours de la réponse à des infections bactériennes ou virales [51, 53, 66, 67]. MICRO-ARN ET LYMPHOCYTES T RÉGULATEURS Les lymphocytes T les plus affectés par la délétion de Dicer, la ribonucléase clé de la maturation des miARN, au stade de cellules doubles-positives sont les cellules T régulatrices, dont la réduction d’un facteur 6 dans le thymus et en périphérie conduit à une pathologie dysimmunitaire complexe chez les souris mutées comportant une splénomégalie, une augmentation de volume des ganglions lymphatiques intestinaux et une colite [61]. Plus récemment, pour tester le rôle des miARN dans les cellules T régulatrices matures, les groupes de Rudensky et de Bluestone ont développé des modèles de délétion spécifique de Dicer dans les cellules T régulatrices Foxp3 positives. Ces modèles apportent une autre preuve de l’implication majeure des miARN dans le maintien des capacités suppressives des cellules T régulatrices, ces souris développant des manifestations auto-immunes indistingables de celles causées PLACE DES MICRO-ARN EN NÉPHROLOGIE ET TRANSPLANTATION 177 par le déficit en Foxp3, le facteur transcriptionnel contrôlant la différenciation des cellules T régulatrices [68-70]. Micro-ARN et pathologie dysimmunitaire La compréhension progressive du rôle des miARN dans la régulation de l’ensemble du système immunitaire conduit à tester leurs profils d’expression et éventuellement leur implication physiopathologique au cours de diverses situations impliquant un dysfonctionnement du système immunitaire. C’est ainsi qu’une littérature naissante a pu envisager le rôle des miARN aux cours de maladies auto-immunes telles que la polyarthrite rhumatoïde [71-73] ou le lupus érythémateux disséminé [39, 74], essentiellement par le biais de comparaison entre des sujets sains et des malades des profils d’expression des miARN dans des matériels biopsiques ou des cellules mononucléées circulantes. Biomarqueurs de rejet aigu De façon similaire aux travaux effectués au cours de pathologies auto-immunes, nous avons émis l’hypothèse que le profil d’expression des miARN pouvait être altéré au cours du rejet aigu d’allogreffe rénale [28]. Par une analyse du profil d’expression de 365 miARN dans des biopsies de greffons rénaux atteints ou non de rejet aigu, nous avons pu mettre en évidence une signature d’expression de miARN au cours du rejet aigu cellulaire. Les niveaux d’expression de 53 miARN étaient significativement différents dans les deux groupes de biopsies, incluant 43 miARN significativement (p < 0,05) moins exprimés (let-7c, miR-10a, miR-10b, miR-125a, miR-200a, miR-30a-3p, miR-30b, miR-30c, miR-30e-3p, miR-32…) et 10 miARN (miR-142-5p, miR-142-3p, miR-155, miR-223, miR-146b, miR-146a, miR-342, miR-21, miR-650, miR-525-5p) significativement plus exprimés au cours du rejet aigu. Des analyses complémentaires menées in vitro ont permis de montrer que les miARN significativement plus exprimés provenaient des cellules immunes infiltrant le greffon et que plusieurs de ces miARN étaient significativement régulés par l’état d’activation des cellules mononuclées. D’autre part, des cellules épithéliales tubulaires rénales exposées à des cytokines pro-inflammatoires, mimant in vitro l’environnement inflammatoire du rejet, présentaient une altération de leur profil d’expression des miARN suggérant l’implication de miARN dans les altérations tubulaires induites par l’inflammation. CONCLUSION La découverte des miARN et de leurs fonctions de régulation de l’expression des gènes est maintenant considérée comme une des découvertes biomédicales les plus importantes de ces 15 dernières années. L’engouement suscité par les miARN donne lieu à une littérature de plus en plus abondante qui prend plusieurs directions. La première consiste à définir le profil d’expression des miARN dans les tissus ou les fluides biologiques au cours du développement ou au cours d’événements 178 D. ANGLICHEAU pathologiques. Cette approche peut constituer une étape importante vers une meilleure compréhension de la régulation des gènes au cours des processus pathologiques. L’étude des miARN peut aussi conduire au développement de nouveaux outils diagnostiques, les miARN, de par leur grande stabilité, pouvant constituer de nouveaux types de biomarqueurs diagnostiques. Enfin, la compréhension du rôle des miARN dans les processus pathologiques ouvre aussi la voie vers des thérapeutiques innovantes, les premiers essais cliniques chez l’homme ayant déjà commencé moins de huit ans après la première utilisation du mot miARN dans un article scientifique. BIBLIOGRAPHIE 1. LEE RC, FEINBAUM RL, AMBROS V. The C. elegans heterochronic gene lin-4 encodes small RNAs with antisense complementarity to lin-14. Cell, 1993, 75 : 843-854. 2. WIGHTMAN B, HA I, RUVKUN G. Posttranscriptional regulation of the heterochronic gene lin-14 by lin-4 mediates temporal pattern formation in C. elegans. Cell 1993, 75 : 855-862. 3. GROSSHANS H, FILIPOWICZ W. Molecular biology : the expanding world of small RNAs. Nature, 2008, 451 : 414-416. 4. PASQUINELLI AE, REINHART BJ, SLACK F et al. 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