Les Vésicules Extracellulaires comme nouveaux biomarqueurs de

Les Vésicules Extracellulaires comme nouveaux biomarqueurs de toxicité de
la pollution atmosphérique
A. HELIOT1,2, G. TREMOLET1, Y. LANDKOCZ1, F. LEDOUX1, F. CAZIER3, D. COURCOT1, P.J.
MARTIN1
[email protected]
1 EA4492, Unité de Chimie Environnementale et Interactions sur le Vivant, ULCO, Dunkerque
2 Agence de l’Environnement et de la Maitrise de l’Energie (ADEME), 20 rue du Grésillé, BP 90406, 49004 Angers Cedex 1
3 Centre Commun de Mesures, ULCO, Dunkerque
Contexte :
Le cancer du poumon est la principale cause de décès par cancer dans le monde. Des études épidémiologiques
suggèrent que la pollution de l'air, notamment l'exposition aux particules fines (PM 2,5), est associée à un risque accru
de mortalité par cette maladie. En 2013, le Centre International de recherche sur le Cancer (CIRC) a d’ailleurs classé
la pollution de l'air extérieur et les particules fines comme cancérogène de classe I pour l'homme. Par conséquent, il
est important de développer la connaissance, la surveillance et la prévention des cancers liés à l'exposition aux PM.
Cet objectif est un point majeur du Plan Cancer 2014-2019 et du Plan National Santé Environnement 3 (PNSE3) (20152019).
Les particules fines de diamètre inférieur à 2.5 µm (PM2,5) peuvent pénétrer profondément dans les voies respiratoires
et entrainer une forte réaction inflammatoire dans le poumon en stimulant la libération de différents types de médiateurs
par les cellules immunitaires résidentes ou infiltrantes. Ces cellules, et en particulier les monocytes / macrophages,
peuvent produire et sécréter plusieurs facteurs, parmi lesquels des molécules solubles circulantes et des Vésicules
Extracellulaires (EV) qui peuvent favoriser un processus cancérogène. Ces vésicules, de taille nanométrique (30 à 1000
nm), représentent en effet d’importants messagers biologiques impliqués dans des processus pathologiques tels que
la tumorigénèse. Elles sont générées par tout type de cellules et sécrétées dans l'espace extracellulaire où elles
échangent avec leurs cellules cibles des protéines, des lipides et des acides nucléiques (ARNm, miARN et lncRNAs),
modifiant ainsi leur phénotype.
Problématique et objectifs :
Dans ce contexte, le but de ce projet est de proposer une nouvelle piste d’identification de biomarqueurs précoces de
cancer du poumon suite à une exposition à la pollution atmosphérique, et en particulier aux particules fines PM 2,5, par
l’utilisation des EV. Pour cela, des PM2.5 ont été prélevées sur un site de typologie urbaine et ont fait l'objet d'une
caractérisation physico-chimique approfondie, de manière à connaitre leur composition et leurs sources.
En parallèle, des monocytes de type THP-1 ont été exposés à ces PM2,5. Leur réponse cellulaire a été mesurée et les
EV produites en réponse à cette exposition isolées, afin de caractériser leur taille et leur contenu en petits ARN et
protéines dans le but d’identifier des biomarqueurs d’exposition.
Méthodologie :
Les PM2,5 ont été prélevées sur une période d’un an par impaction en cascade, entre le 19 mars 2014 et le 18 mars
2015, dans une zone urbaine sous influence industrielle située à Dunkerque. Ces particules ont fait l'objet d'une
caractérisation physico-chimique approfondie, de manière à connaitre leur composition et leurs sources.
Des THP-1 ont été exposés à plusieurs concentrations de ces PM2,5 pendant 6h, 24h et 48h et leur réponse cellulaire a
été mesurée :
- L’expression de miARN, de longs ARN non codant (lncARN), de gènes cibles des miARN modifiés ou encore de gènes
de l’inflammation, de gènes impliqués dans la cancérogénèse et de gènes codant pour des enzymes de métabolisation
des xénobiotiques a été mesurée par RT-qPCR,
- Des marqueurs protéiques comme des cytokines inflammatoires, des marqueurs de cancers ou les protéines dont
l’expression peut être modifiée par les miARN ont été quantifiés par ELISA et western blot.
Les EV libérées suite à l’exposition des THP-1 aux PM2,5 ont été caractérisées par microscopie électronique, western
blot et RT-qPCR afin d’établir leur profil, notamment en miARN, après exposition aux PM 2,5.
Résultats :
Nous observons dans les THP-1 exposés à différentes doses de PM2,5 et à différents temps d’exposition une altération
de l’expression de plusieurs miARN, notamment ceux de la famille des let-7 et miR-21.
Journées interdisciplinaires de la Qualité de l'air 2017 – 2 & 3 février 2017
Nous avons ensuite effectué un test ELISA afin de doser l’IL-8, une interleukine pro-inflammatoire. Nous avons observé
une sécrétion croissante de l’IL-8 avec l’augmentation de la concentration de PM2,5 et la durée d’exposition.
A partir de ces mesures, nous avons choisi des doses et des temps d’exposition des THP-1 aux PM2,5 entrainant
potentiellement une bonne libération d’EV avec une concentration minimale de PM 2,5. Notre choix s’est arrêté sur deux
concentrations de PM2,5 (12.5µg/ml et 50µg/ml) et trois temps d’exposition (6h, 24h et 48h).
Les EV libérées par les THP-1 exposées aux PM2,5 ont ensuite été isolées et caractérisées. Leur observation par
microscopie électronique n’a pas révélé de différence significative entre les conditions d’exposition. Les études
effectuées par RT-qPCR ont mis en évidence qu’une exposition aux PM 2,5 entraine une modification de leur profil en
miARN.
L’ensemble de ces résultats a permis de mettre en évidence que l’exposition de THP-1 aux PM2,5 entrainait une
altération du profil des EV produites en réponse, suggérant leur utilisation comme nouvelle piste d’identification de
biomarqueurs d’exposition.
Journées interdisciplinaires de la Qualité de l'air 2017 – 2 & 3 février 2017