Équilibre acide-base

CHMI 2227F
Biochimie I
Rappel:
-Équilibre
acide-base
-Spectrophotométrie
CHMI 2227 - E.R. Gauthier, Ph.D.
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Équilibre acide-base
- Acides forts
HCl  H+ + ClpH = - log [H+]
Où [H+] est en unités de concentration molaires (M).

Les acides forts se dissocient complètement
dans l’eau.
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Équilibre acide-base
- Acides faibles
HA
Ka = [H+] x [A-]
[HA]
H+
+
A-
pKa = -log Ka
Ka =
Où:
-HA est l’acide non-dissocié.
-A- est la base conjuguée de
l’acide HA.
1
10pKa

Les acides faibles ne se dissocient pas
complètement dans l’eau.;

Le degré de dissociation de l’acide faible
dépends de sa constante de dissociation (Ka).
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Équilibre acide-base
- Acides faibles

Le pH se solutions d’acides faibles peut être
déterminé en calculant d’abords la [H+], en
tenant compte du Ka de l’acide;
Ka = [H+] x [A-]
[HA]

pH = - log [H+]
Alternativement, on peut aussi utiliser l’équation
d’Henderson-Hasselbach:
pH = pKa +log [A-]
[HA]
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Équilibre acide-base
- Acides faibles


L’ajout d’une base forte
à une solution d’acide
faible mènera à la
conversion progressive
de HA en A-.
pH
Notons que le pH de la pKa
solution ne change pas
beaucoup près de la
valeur du pKa: la
solution est alors
tamponnée.
HA
H+ + A-
Point de miéquivalence:
- 50% HA
- 50% A-
100% A-
pH au point de miéquivalence = pKa
100% HA
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0.5
NaOH
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Équilibre acide-base
- Acides faibles

Exemple 1: Quel est le pH d’une solution de 0.1M
d’acide acétique (Ka = 1.76 x 10-5M).
CH3-COOH
CH3-COO- + H+
Ka = 1.76 x 10-5 M = [H+] x [A-] = [H+]2
[HA]
[HA]
[H+]2 = 1.76 x 10-5 M x [HA] = 1.76 x 10-5 M x 0.1M
[H+] = 1.33 x 10-3 M
Finalement: pH = -log [H+] = 2.88
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Équilibre acide-base
- Acides faibles

Exemple 2: Quel sera le pH d’une solution composée de
0.3 M d’acide acétique et de 0.1 M d’acétate (pKa = 4.8).
CH3-COOH
CH3-COO- + H+
pH = pKa + log [A-]
[HA]
pH = 4.8 + log 0.1M
0.3M
pH = 4.8 + (-0.477)
pH = 4.3
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Spectrophotométrie
Source lumineuse
Lumière
incidente
Cuvette
Détecteur
Lumière
transmise
L’intensité de la
lumière transmise
est égale à celle de
la lumière
incidente.
L’intensité de la
lumière transmise
est inférieure à
celle de la lumière
incidente.
Lumière
incidente
Lumière
transmise
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En d’autres mots, la solution
bleu a absorbé une partie de
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la lumière incidente.
Spectrophotométrie

Différentes sources de lumière
peuvent être utilisées.

En biochimie, les deux principales
sources lumineuses utilisées sont:

Lumière visible (solutions
colorées);
 Lumière ultraviolette ( composés
incolores mais ayant des liaisons
doubles conjuguées ou des
noyaux aromatiques).

Pour cette raison, on appelle cette
méthode la spectrophotométrie
UV-Vis.
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
La longueur d’onde à utiliser
dépends du type de composé
auquel tu t’intéresses.

Généralement, des
expériences préliminaires sont
effectuées afin de déterminer
la longueur d’onde à laquelle
la molécule d’intérêt absorbe
davantage

Augmente la sensibilité de la
détection.
Intensité d’absorbance
Spectrophotométrie
400
450
500
550
600
Longueur d’onde (nm)
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Spectrophotométrie


La puissance de la
spectrophotométrie est qu’elle
permet d’utiliser la quantité de
lumière absorbée afin de
mesurer quelque chose.
On utilise l’absorbance au lieu
de l’intensité de lumière
transmise simplement parce
qu’il est plus facile de voir des
différences entre échantillons.

Par exemple:


Solution A:

1M: 65% transmission et 0.25
absorbance

2M: 70% transmission et 0.5
absorbance
La relation entre l’intensité de
lumière transmise et
l’absorbance est donnée par
l’équation de Beer-Lambert.
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Spectrophotométrie
- équation de Beer-Lambert
-logT = log (1/T) = ecl =A
Where: T = intensité de transmission
A = absorbance
l = trajet optique (épaisseur de la
cuvette)(cm)
c= concentration (M)
e = coefficient d’absorption (M-1cm-1)

Généralement, l = 1 cm.

e est une propriété de la molécule d’intérêt, obtenu dans des conditions standards, et
est retrouvée dans des manuels.

Donc: si tu connais A, l et e, tu peux facilement déterminer c.

Cependant, e n’est pas souvent connu, ou sa valeur n’est pas applicable sous les
conditions prévalant dans le labo.

Que faire, que faire, que faire??????????????
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Courbe standard

Très utilisées en biochimie
Absorbance
de l’inconnu
Principe très simple:

L’absorbance d’une série de
solutions du composé d’intérêt, de
concentration connue, et d’abord
déterminée.

Une graphique de l’absorbance en
fonction de la concentration est alors
préparé. CECI EST TA COURBE
STANDARD.

L’absorbance du même composé,
mais de concentration inconnue, est
alors déterminée.

En autant que la valeur
d’absorbance de l’inconnu est située
dans la partie linéaire de la courbe
standard, tu peux facilement
déterminer la concentration de ton
échantillon.
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ATTENTION!!!
Intensité d’absorbance

Partie nonlinéaire
de la courbe
Concentration de l’inconnu
3
6
9
12
Concentration(unités)
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Spectrophotométrie


La spectrophotométrie est utilisée tout le temps en
biochimie, et pas seulement pour mesurer la
concentration de molécules:
Réactions enzymatiques:

La formation/l’utilisation par une
enzyme d’une molécule absorbant la
lumière peut être déterminée en
fonction du temps par
spectrophotométrie.

Ceci permet de suivre le progrès de
réactions enzymatiques.

Détection de substances:



Les protéines absorbent à 280 nm;
La spectro UV-Vis est souvent
utilisée afin de suivre le progrès de
la purification d’une protéine
(mesure de l’absorbance à 280 nm).
Pureté d’un échantillon:

Les solutions pures d’ADN
absorbent à 260 nm et 280 nm
d’une telle manière que le rapport
A260/A280 est d’environ 2.

Un rapport A260/A280 inférieur à 2
nous indique que la solution d’ADN
est probablement contaminée par
des protéines.
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