Chapitre3 Clonage et expression hétérologue

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Chapitre3
Clonage et expression hétérologue
Vecteurs et cellules hôtes
-
Eléments dans la construction d’un ADN recombinant
ADN à cloner = « insert »
N’importe quel fragment d’ADN db peut être cloné et amplifié dans un système
bactérien : ADNc, fragment ADN génomique, produits de PCR, fragment de restriction…
En fonction de la taille du fragment, la technique de clonage choisie et du but
recherchée on définira le vecteur et la cellule hôte.
•
Vecteurs
Il existe plusieurs méthodes pour faire entrer un fragment d’ADN dans une cellule :
entré par l’intermédiaire d’un plasmide, d’un phage ou d’un virus, entrée d’ADN nu.
Quel est le devenir de cet ADN ?
Il peut être reconnu par la machinerie cellulaire s’il porte des signaux de
reconnaissances.
Si signaux réplications -- réplication
Si signaux transcription/ traduction -> traduction transcription
1 les cellules hôtes utilisées en génie génétique
-
procaryote : E coli (DHSα, BL21,…)
eucaryote : levure : Saccharomyces, pichia pastoris
cellule d’insecte sf9
cellule CHO : chinese hamster ovarian cells
HEK 293 : human embryonic kidney cells
Œuf fécondé
Cellule souche embryonnaire ES
Pour le clonage : E Coli
Pour l’expression : l’un ou l’autre des types cellulaires en fonction de la protéine et de
l’utilisation de la protéine.
Remarque : certaines protéines sont produites à partir d’animaux transgéniques : lait de vache,
chèvre
Avantage et inconvénient des différents types cellulaire : Cf chap V
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2 Vecteurs
2.1 Rôles
→Permettent
de flanquer l’ADN de séquence de signalisation qui seront reconnue par les
facteurs cellulaires.
Si l’on souhaite recopier (multiplier) l’ADN→ vecteur de clonage
Si l’on souhaite produire une protéine→ vecteur d’expression
Si les signaux sont reconnus par la machinerie procaryote → vecteur procaryote
Si les signaux sont reconnus par la machinerie eucaryote → vecteur eucaryote
2.2 Les vecteurs procaryotes
2.2.1 Généralités et quelques exemples de vecteurs
Les premiers vecteurs utilisés étaient des phages puis des plasmides
Vecteurs couramment utilisés : plasmide, phage, cosmide (hybride phage/plasmide), BACS
(bacterial artificial chromosomes)
-
2.2.2 Caractéristiques essentielles pour le clonage et l’expression
origine de réplication
site de coupure par les enzymes de restriction
repérage facile des bactéries transformées
 Souvent présence de marqueurs conférant un phénotype nouveau à la bactérie
3 Plasmides
3.1 Généralités
Plasmide : ADN circulaire extra chromosomique.
-
plasmide conjugatif permettant l’échange d’information entre bactérie : facteurs F (94Kb)
résistance aux antibio : facteur R
résistance aux métaux lourds : facteur R
Il existe des bases de données des plasmides présents à l’état naturel dans différentes
bactéries.
Les caractéristiques pour qu’un plasmide constitue un bon vecteur de clonage : taille, site de
restriction (varié mais unique), le nombre de copie / cellule, présence de marqueur génétique.
Les plasmides utilisé comme vecteur en génie génétique sont des hybrides.
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3.2 Exemple de plasmide
3.2.1 Plasmide de clonage
3.2.1.1 Plasmide pBR 322
Boliver et rodriguez, 1979
4361 pb
tetR
AmpR
pMB9
colE1
Amp : inhibe la synthèse de la paroi bactérienne
Amp R : synthèse d’une enzyme hydrolysant le cycle bêta lactame qui dégrade amp
Tet : liaison a la sous unités 30s
Tet R : empêche entrée de l’antibiotique
Carte restriction :
- site unique : ECO RI et BAM H1
- origine pMB9 : présence de rop
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Contrôle de la réplication à partir des origines Col E1 / pMB9 :
•
•
Réplication unidirectionelle à partir de Ori V
Synthèse RNA II ( qui peut servir d’amorce) et RNA I ( qui régule la structure de
RNA II)
Le complexe d’ARN II / ARN I est défavorable à l’initiation de la réplication.
L’interaction entre ARN II et ARN I stabilise par protéine rop donc défavorable à la
réplication
La mutation de rop baisse la stabilité, et donc il y aura une augmentation du nombre de copie
Groupe d’incompatibilité : 2 plasmides ayant la même origine de réplication
appartiennent aux même groupes d’incompatibilité et ne peuvent pas co-exister
simultanément dans la même cellule hôte. Ex : pMB8 et col E1
Utilisation de pBR 322 pour le clonage :
DNA insert
Eco Ri
tet
Amp
tet
BamH1
+
PBR 322
Cells will survive
in ampicillin
and tetracyclin
3.2.1.2
Cells will survive
in ampicillin but
not tetracyc lin
PBR 322 hybrid
Cells will not
survive in
am picillin
or tetracyclin
Vecteur puc
Il contient tous les éléments pour l’expression d’une protéine mais ce n’est pas un vecteur
d’expression typique.
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•
Propriété de la β galactosidase
β galactosidase
active
N-term β -gal
C-term β gal
inactive
inactive
Codé par les lac Z
(plasmide puc)
Codé par lac Z
(génome cellule hôte
N-term
C-term
active
On appelle cela : α-complémentation
•
Mise en évidence de l’activité béta galactosidase
Substrat chromogène γ gal (incolore) : 5 bromo 5 chloro 3 indonyl αβ galactosidase.
Réaction : γ gal en présence de β gal donne un produit bleu, donc on peut conclure à la
présence d’activité β gal.
-
site de clonage multiple ds PUC : polylinker, polycloning site.
Plasmide puc :
- marqueur de selection : amp R
- origine de réplication modifiée
- nombreux sites unique de restriction
On réalise une sélection bleu
blanc pour les recombinants
L’utilisation de PUC : vecteur de clonage facilitant grandement la sélection des vrais
recombinants.
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3.2.2 Vecteurs d’expressions
Possédant les caractéristiques vue pour les vecteurs de clonage, plus :
- un promoteur (régulé)
- un site de terminaison de la transcription (préférable)
- un site de liaison pour le ribosome (RBS)
- un codon stop (présent sur le vecteur ou l’insert)
3.2.2.1 Composants pour un vecteur d’expression procaryote typique
promoteur
-35
répresseur
RBS
-10
Structural gene
start
stop
T
Antibio resistance gène
OrI
3.2.2.2
-
Plasmide pKK 223-3
pBR 322 majoritairement
promoteur hybride ptac
séquence de Shine Delgarno, utilisable si clonage dans E. coli
site de polyclonage multiple (MCS)
terminateurs forts (SS et rrnB → ARN ribosomiques terminateurs)
bactérie recommandée : DH5 α. Production d'une protéine non fusionnée.
Production d’une protéine non fusionné
Utilisation : clonage non directionel (Cf TD)
3.2.2.3 Vecteur d’expression avec promoteurs phagiques
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3.2.2.3.1 Vecteur
pET Novagen
Structure générale :
E. coli BL21 : bactéries hôtes pour les plasmides présentant un promoteur T7
3.2.2.4 Vecteurs pour la production de protéines recombinantes avec des
étiquettes = « tag »
L’étiquette confère à la protéine une particularité par rapport aux autres protéines de la
cellule. Elle peut être clivable ou non.
Protéine
Etiquette
Protéine de fusion
Si on choisit une étiquette clivable, on met séquence pour site de coupure par protéase
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3.2.2.4.1 Principales étiquettes utilisées pour produire des protéines de
fusion
•
•
•
Histidine : ajout de 6 à 8 résidus histidine à l’extrémité C ou N terminale. Etiquette la plus
courante.
GST : Glutathion S transférase (20 kD) rajouté à l’extrémité C ou N de la protéine
Etiquette codant pour une partie de la protéine A de Staphilococus aureus  Interaction
avec les immunoglobulines
Utilisation :
• Pour la détection des protéines par anti-corps dirigés contre l’étiquette
• Pour la purification : extraction des protéines d’un mélange
La purification se fait par chromatographie d’affinité, l’élution des protéines fixées sur
la résine étant facilitée.
• Sur IMAC (chromato d’affinité sur métal immobilisé) pour l’étiquette histidine
• Résine glutathion pour l’étiquette GST
• Résine avec immunoglobuline pour l’étiquette avec la protéine A.
D’autres étiquettes peuvent être utilisées, comme pour favoriser le repliement des
protéines en absence de protéines chaperonnes par exemple (GST ou NuSA).
3.2.2.4.2 Clivage des étiquettes
Insertion entre la protéine et l’étiquette d’un site de reconnaissance reconnus par les
protéases.
Sites les plus usuels :
• Site entérokinase :
Asp Asp Asp Asp Lys
Coupe du côté C-ter de la lysine
•
Site thrombine :
Leu Val Pro Arg
•
Site reconnu par le facteur Xa :
Ile Glu Gly Arg
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3.2.2.4.3 Exemples de plasmides d’expression avec étiquette
Etiquette clivable : plasmide pTrcHis de Invitrogen ( -4,4 kD)
Ek site : Site de reconnaissance de
l’entérokinase
P link : multiple site de
reconnaissance de l’enzyme de
restriction
(His) 6 : Etiquette
LacO : opérateur
Terminateur de transcription
Promoteur hybride Trp/lac : promoteur fort
LacIq : répresseur de l’opéron lactose. q =
« up regulation »  Prot en quantité
importante
AmpR
OriColE1 : entre 10 et 30 copies du plasmide
Ici, l'étiquette est du côté N terminale
Quand on utilise une expression régulée (présence de l’opéron lactose), on trouve
généralement un gène codant répresseur (ici, le répresseur de l’opéron lactose).
Protéine de fusion clivable produite à partir de ce plasmide :
NH2 ter His His His His His His Asp Asp Asp Asp Lys XXXXXXX
Etiquette
Site de entérokinase
Protéine
Clivage par
NH2 ter XXXXXXX
: Séquence de la protéine clivée
ajout entérokinase
3.2.2.4.4 Purification de protéine avec étiquettes (chromato d’affinité)
Ex : Résine avec groupement glutathion  Retient protéine avec étiquette GST
Interaction est très élevée, constante d’affinité forte  Bonne sélectivité
Ex : IMAC, avec ici Ni2+ (retenue sur résine par acide nitrilotricaétique)
Voir schéma poly de TP
Formation de liaison de coordination (pour le Ni2+) avec His. Elution soit par compétition
avec ajout imidazole soit par modification du pH.
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3.2.2.4.5 Vecteurs permettant l’adressage des protéines
Souvent les protéines produites dans le système sont mal repliées car pas
d’environnement dans la cellule pour le faire  Possible sécrétion protéine à l’extérieur du
cytoplasme de la bactérie pour faire le repliement.
Technique :
a) Fusion du côté Nter d’un signal de sécrétion provoquant l’envoi des ribosomes du
côté de la membrane plasmique  sécrétion de la protéine dans l’espace périplasmique de
E.Coli (Gram -).
b) Le peptide signal est clivé sélectivement par la signal peptidase
Cette stratégie de production de sécrétion de protéine est indispensable pour les
protéines ayant des ponts disulufures car l’intérieur de la cellule est réducteur (si protéine se
forme à l’intérieur, on a corps d’inclusion, c’est-à-dire agrégat de protéines purifiables mais
qui ne sont pas dans la conformation active)
c) Purification simplifiée par destruction de la membrane externe  relarguage de la
membrane externe puis élimination des sphéroblastes.
3.2.3 Plasmides permettant des stratégies de clonage n’utilisant pas d’enzyme
de restriction.
Utilisé pour HTC (clonage à grande échelle). Vecteur tout prêt à être inséré, sans
passer par l’étape de coupure par les enzymes de restriction.
3.2.3.1 Plasmide pET-30 LIC
Stratégie LIC : « clonage indépendant de la ligase »  Pas besoin de la ligase pour
refermer.
Cf. : TP de biotechnologie
Peut servir à la production de protéines de fusion avec plusieurs étiquettes.
3.2.3.2 Système de GATEWAY
Utilisation de recombinase.
Recombinaison du phage λ dans E. Coli
Phage λ
aτP
aεB
E. Coli
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Intégration de l’ADN phagique dans le génome de E. coli
Voir cours 2A
ADN λ
A
Cl
F
P
P
gal
Excision
att L x att R
B
B
gal
B
P
F
A
Cl
P
att P x att B
Intégration
bio
ADN E.coli
Cycle lysogénique : att B x att P  att L x att R
Cycle lytique :
att L x att R  att B x att P
recombinase : BP clonase Int, IHF
recombinase : LR clonase Xis, IHF
Réaction BP utilisée pour faire entrer le produit de PCR dans un vecteur
att B1
att B2
att P1
att P2
gène
ccdB
Vecteur donneur
BP clonase
att R1
att R2
ccdB
Produit non intéressant
att P1 ne se recombine qu’avec att P1
La sélection du clone se fait par destruction du vecteur
ayant ccdB
att L1
att L2
gène
Clone d’expression
B bio
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Réaction LR pour faire passer un insert sur un autre vecteur
att L1
att R1
att L2
att R2
gène
ccdB
Clone d’entrée
Vecteur de destination
LR clonase
att B1
att B2
att P1
att P2
gène
ccdB
Clone d’expression
Produit
A partir du moment où le clone d’entrée est crée, on peut faire entrer le gène souhaité
dans beaucoup d’autres vecteurs. Notamment utilisable pour la mise en place d’une étiquette.
Résumé :
Vecteur clonage
Vecteur d’expression
Ori
Promoteur fort
MCS : site de clonage
multiple
AntibioB
Terminateur
3.3 Transfert de plasmides de E.coli = transformation de E.coli
E.coli n’est pas naturellement transformable, c'est-à-dire prêt à capter de l’ADN
transgénique au moment de son cycle. Il faut perturber la membrane pour permettre la capture
d’un ADN étranger  On rend la bactérie compétente (= capacité d’intégrer un ADN).
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Technique de transformation :
• Agent chimique : CaCl2 à froid ; PEG (polyéthylène glycol) en présence de DMSO
(diméthylsulfoxyde) ; agents chaotropes. Avec choc thermique (chauffage lent à 40°C puis
passage dans glace)
• Electroporation : bactéries sont exposées à champ électrique intense  Bonne efficacité,
utilisée pour bactérie difficilement transformable.
La transformation de E.coli est peu efficace : sur l’ensemble des bactéries d’un milieu,
seule une petite proportion de cellules deviennent compétente, et sur les cellules compétentes,
toutes ne captent pas de molécules d’ADN (1/10 000 si ADN circulaire, 1/100 000 si linéaire,
plasmide > 10 kb entrent difficilement dans la cellule)
4 Vecteurs phagiques
vecteurs dérivés du bactériophage λ
Phage λ a un génome de 48kb (48 502 paries de base).
Sur les 50 gènes de λ, beaucoup sont impliqués dans des recombinaisons et la
lysogénie et ne sont pas essentiels ni à la multiplication du phage ni au cycle lytique, or c’est
ce qui nous intéresse. Les gènes non essentiels peuvent être éliminés et remplacés.
Les génomes phagiques peuvent être manipulés pour pouvoir insérer de l’ADN
étranger. Les vecteurs dérivés utilisés pour le clonage ont des sites de restriction de part et
d’autre de la partie qu’on veut éliminer.
Vecteurs dérivés du phage λ
cos : séquence de 12 nucléotides, simple brin, débordante  indispensable à l’empaquetage
d’ADN dans l’ADN du phage.
ADN de λ
cos L
cos R
Elimination de la partie centrale par
digestion au moyen d’une enzyme de
restriction
Partie centrale
cos R
cos L
cos L
Epissage de l’ADN étranger
Empaquetage in vitro de la molécule
recombinante
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(Ici insert de 16-26kb)
Taille doit être équivalente à 48kb
Mutant du phage peut être utilisé comme vecteur de clonage.
Procédé d’empaquetage tel que seules les molécules contenant l’insert d’ADN sont
sélectionnées (partie gauche, droite ou centrale étant trop petites). Seul le recombiné peut y
entrer.
Stratégies d’utilisation du vecteur λ :
• Stratégie de délétion / remplacement : cf. précédemment avec insert d’environ
16-26kb
cos
20kb
ecoRI
•
cos
ecoRI
Stratégie par insertion : insert d’environ 0-12kb. Efficace mais techniquement
difficile à gérer
cos
cos
ecoRI
Avantages vecteur λ : permet clonage de grand fragment et une sélection naturelle de
ces grands fragments pendant l’empaquetage.
Inconvénients : plus difficile à manipuler.
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5 Les vecteurs eucaryotes
Présence sur le vecteur de séquences reconnues par la machinerie eucaryote (ori,
promoteur, intron, …). Dans les cellules de mammifères, on peut utiliser des vecteurs
navettes.
Procaryote ↔ eucaryote
Dans cellule procaryote ↔ amplification
Dans cellule eucaryote ↔ expression
5.1 Principe général du vecteur « mammifère »
Procaryote : Origine de réplication ; marqueur de sélection (résistance à un antibio +
promoteur)
Côté eucaryote :
• Promoteur : peut être différent du gène intéressé
• Gène d’intérêt
• Site d’épissage et de maturation de l’ARN  facilite transcription et traduction.
• Parfois présence d’une Ori eucaryote
• Plus parfois un gène de résistance pour la sélection de la bactérie eucaryote. Le plus
courant est le gène de la résistance à la néomycine NéoR.
PROCARYOTE
EUCARYOTE
Promoteur et activateur
eucaryote
ATG : initiateur
Gène d’intérêt
TAA : stop
Site d’épissage et de maturation de l’ARN
Ori eucaryote
5.2 Expression stable ou transitoire
Expression est stable quand le plasmide est maintenu dans la cellule hôte eucaryote.
2 possibilités :
Soit le plasmide a une origine R reconnue par la cellule hôte et le plasmide est recopié de
manière épisomique (indépendamment du génome de la cellule hôte)
Soit il n’a pas d’origine R propre mais on le force à s’intégrer à l’ADN de la cellule hôte et le
transgène est répliqué en même temps que l’ADN génomique
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5.3 Exemples
5.3.1 Plasmide prDNA3 (invitrogen)
MCS : lieu insertion gène
PMCV :
eucaryote
promoteur
Site de terminaison
SV40 : ori virale
NéoR
Site de polyadénylisation
puC ori : fonctionne dans E.coli  réplication
relâchée = nombreuses copies
Nécessité d’avoir une protéine virale : AgT, protéine de la machinerie cellulaire qui reconnaît
l’ori du plasmide.
Si cellule hôte produit AgT, on a réplication épisomique du plasmide et expression du
transgène.
Si cellule ne produit pas AgT, on sélectionne par ajout de néomycine donnant la possibilité
que le gène s’intègre au hasard. Expression du transgène stable
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5.3.2 Vecteur pIRES (Clonentec)
Pour cellule de mammifère. Pas d’origine de réplication  vecteur intégratif, c’est-àdire qu’il ne fonctionne que s’il s’intègre dans le génome.
Vecteur pIRES : vecteur intégratif
Après transfection :
En absence d’antibiotique, expression transitoire (forte souvent) du transgène
Expression
Temps (h)
24 48 72
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En présence d'antibiotique, intégration dans le génome (1/100000)
→ Intégration au hasard dans le génome :
Si intégration dans une zone silencieuse, expression faible.
Si intégration dans une zone très active, forte expression.
En général, on ne copie qu’un gène par génome.
L’expression est stable.
5.3.3 Vecteurs viraux :
Baculovirus : pour expression dans les cellules d’insectes.
Virus de cellules mammifères :
− adénovirus
− rétrovirus :
− virus de la leucémie murine de Moloney (nécessite une division cellulaire
pour intégrer le gène)
−
lentivirus (pas besoin de division cellulaire)
5.3.4 Vecteurs pour le clonage de grands fragments d’ADN :
•
YAC : Yeast Artificial Chromosome
large insert
ARS
URA 3
télomère
centromère
Origine de
réplication
HIS 3
markers
télomère
Insertion de 20 à 2000 kb dans la levure
•
MAC : Mammalian Artificial Chromosome
Insertion jusque 500 Mb dans les cellules de mammifères.
5.4 Transfection des cellules eucaryotes
−
−
−
−
−
−
Méthode au phosphate de calcium (molécule insoluble. avec l’ADN→forme des aggrégats
captés par les cellules par pinocytose…). Cette méthode ne marche pas pour toutes les
cellules.
Lipofection (ADN dans bicouche lipidique, avec des lipides chargés)
Electroporation (Quasiment le seul moyen utilisable dans le cas de certaines cellules)
Vecteurs viraux
Vecteurs non viraux : PEI, lipofectamine
Microinjections
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