La Génomique

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Clonage Moléculaire
Définitions
Clonage :
Obtenir un morceau d’ADN à partir de la source originale
(Génome) et l’introduire dans un vecteur d’ADN
Sous-clonage:
Transfère d’une insertion d’ADN cloné ou une partie de
ce dernier d’un vecteur à un autre vecteur
Plasmide recombinant:
Vecteur dans lequel un ADN étranger a été introduit
Organisme recombinant
Organisme dans lequel un vecteur recombinant a été
introduit
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Pourquoi cloner?
Séparer, identifier, manipuler ou
exprimer un fragment spécifique d’ADN

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Étape 1- Séparer
Deux approches:
Fragmenter/digérer l’ADN génomique
Génère un très grand nombre de fragments
Peut-être difficile de retrouver le fragment
d’intérêt
Amplification par PCR
Beaucoup moins de fragments
Beaucoup plus facile de retrouver la séquence
d’intérêt
1 plasmide/1 cellule
Enzyme de
restriction
Enzyme de
restriction
Transformation
Cellules Hôte
Fragment
d’intérêt
Vecteur
approprié
Générer des extrémités
compatibles
Ligature
d’ADN
Ligature Intermoléculaire
Recombinant
Ligature Intramoléculaire
Non-Recombinant
Cloner
Cellule Recombinante Cellule Non-Recombinante
1 colonie= 1 clone avec 1 plasmide + 1 insert
Duplication
de plasmide
Croissance bactérienne
Amplification des Plasmides Recombinants

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Criblage et Identification de Clones
Recombinants Plasmidiques
Cartographie de restriction
Hybridation
PCR
Expression
Pourquoi?
Produire la protéine dans un système
hétérologue
Produire la protéine en grande quantité
Purifier la protéine
Étudier l’activité de la protéine
Amplification, Mutagenèse, Clonage &
Expression de LacZ– Projet II
Partie I
Amplification & mutagenèse par PCR du gène
LacZ
Partie II
Clonage de LacZ dans pUC19
Partie III
Esai enzymatique des protéines
recombinantes

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Purification & Digestion de l’ Amplicon Mel 1
Purification par QiaQuick
Permet de retirer le tampon, sels, etc.
Permet de retirer les amorces
Permet de retirer l’enzyme
Digestion
Sites de restriction BamHI et EcoRI ont été
ajoutés à la séquence de l’amplicon
Absent dans la séquence de Mel 1
Présent dans le site de clonage multiple du
vecteur d’expression (pRS424)
Permet le clonage dirigé