La Génomique

Clonage Moléculaire
Définitions
 Clonage

:
Obtenir un morceau d’ADN à partir de la source originale
(Génome) et l’introduire dans un vecteur d’ADN
 Sous-clonage:

Transfère d’une insertion d’ADN cloné ou une partie de
ce dernier d’un vecteur à un autre vecteur
 Plasmide

recombinant:
Vecteur dans lequel un ADN étranger a été introduit
 Organisme

recombinant
Organisme dans lequel un vecteur recombinant a été
introduit
Pourquoi cloner?
 Séparer,
identifier, manipuler ou
exprimer un fragment spécifique d’ADN
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1
Étape 1- Séparer
 Deux
approches:
 Fragmenter/digérer
l’ADN génomique
 Génère
un très grand nombre de fragments
 Peut-être difficile de retrouver le fragment
d’intérêt
 Amplification
par PCR
 Beaucoup
moins de fragments
 Beaucoup plus facile de retrouver la séquence
d’intérêt
Cloner
Enzyme de
restriction
Enzyme de
restriction
Générer des extrémités
compatibles
Fragment
d’intérêt
Ligature
d’ADN
Vecteur
approprié
Ligature Intramoléculaire
Non-Recombinant
Ligature Intermoléculaire
Recombinant
Cellules Hôte
Transformation
Cellule Recombinante Cellule Non-Recombinante
1 plasmide/1 cellule
Amplification des Plasmides Recombinants
1 colonie= 1 clone avec 1 plasmide + 1 insert
Duplication
de plasmide
Croissance bactérienne
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Criblage et Identification de Clones
Recombinants Plasmidiques
 Cartographie
de restriction
 Hybridation
 PCR
Expression
 Pourquoi?
 Produire
la protéine dans un système
hétérologue
 Produire la protéine en grande quantité
 Purifier la protéine
 Étudier l’activité de la protéine
Amplification, Mutagenèse, Clonage &
Expression de LacZ– Projet II
 Partie
I
 Amplification
& mutagenèse par PCR du gène
LacZ
 Partie
II
 Clonage
 Partie
de LacZ dans pUC19
III
 Esai
enzymatique des protéines
recombinantes
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Purification & Digestion de l’ Amplicon Mel 1
 Purification
 Permet
par QiaQuick
de retirer le tampon, sels, etc.
 Permet de retirer les amorces
 Permet de retirer l’enzyme
 Digestion
de restriction BamHI et EcoRI ont été
ajoutés à la séquence de l’amplicon
 Sites
 Absent
dans la séquence de Mel 1
dans le site de clonage multiple du
vecteur d’expression (pRS424)
 Permet le clonage dirigé
 Présent
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