références et bibliographie

S. I. I.T.U. B.
Electrophorèse
Electrophorèse des protéines en gel d’acrylamide
Comme toutes molécules chargées, les protéines peuvent se mouvoir dans un champ
électrique. Cette charge provient des groupements ionisables des chaines latérales de
certains acides aminés composant la protéine. On peut donc se servir de
l'électrophorèse pour les séparer. Les méthodes les plus performantes pour séparer les
protéines sont faites en gel de polyacylamide (EGPA. "polyacrylamide tel
electrophoresis", PAGE). L'électrophorèse en général est expliquée dans la section
"électrophorèse" du SIITUB.
PRINCIPES DE BASE
Caractéristiques des protéines affectant la séparation
Charge
La charge nette d'une protéine est évidemment le principal facteur qui détermine la
direction (d'après sa polarité vers l'anode ou la cathode) et la vitesse (donc la distance)
de migration (proportionnelle à la densité de la charge) d'une protéine. La charge nette
d'une protéine dépend du pI de la protéine et du pH du milieu ambiant. (Réviser au
besoin ces concepts de pI vs pH vs charge nette d'une protéine ou d'un acide aminé)
Si on veut être rigoureux, il faudrait aussi tenir compte des contre-ions de petites
tailles (K+, Na+, Cl-, etc.) qui s'associent aux groupements ionisables de charge
opposée. Ces ions migrent en sens opposés aux protéines et, ce faisant, entraînent des
molécules d'eau, c'est que qu'on appelle l'endo-osmose. Ce déplacement des
molécules d'eau ralentit la migration des protéines. En pratique cependant, ces
considérations complexes sont plutôt académiques et ont un impact faible en EGPA.
Souvent, on ajoute aux protéines un agent (généralement un détergent) qui se
complexe à elles. Dans ce cas, la charge de cet agent peut déterminer la charge nette
de la protéine, en fait du complexe protéine-détergent. Cela permet d'égaliser
artificiellement la densité de charge de toutes les protéines de l'échantillon et de les
séparer seulement sur la base de leur masse moléculaire.
Pour deux protéines ayant des charges nettes égales, il faut tenir compte de la densité
de la charge (nombre de charge/unité de masse moléculaire). Ainsi, les autres facteurs
étant égaux, une protéine ayant 80 charges négatives (nettes) ayant une masse relative
50 kDa migrera plus vite qu'une protéine de 100 kDa ayant aussi 80 charges négatives
nettes.
Taille
La taille est un autre facteur qui détermine la vitesse de migration des protéines dans
une EGPA. Plus la protéine est grosse plus elle sera retardée par les mailles du gel,
donc plus elle migrera lentement. Il peut arriver qu'une protéine soit tellement grosse

qu'elle ne puisse même pas se mouvoir ni même entrer dans le gel. Inversement il
peut arriver qu'elle soit tellement petite qu'elle ne soit pas retardée du tout par les
pores du gel.
Comme la taille d'une protéine est dépendante de sa masse moléculaire, on a souvent
tendance à dire que la masse moléculaire est, en soi, le facteur qui détermine la
séparation des protéines sur EGPA. Mais en général il s'agit d'une approximation
(quelquefois trompeuse) puisque c'est bel et bien la taille qui est le facteur
fondamental, mais ce fateur est intimement lié à la masse moléculaire.
La forme d'une protéine est importante. À masse moléculaire égale, une protéine
globulaire (qui est plus ou moins sphérique) aura tendance à se déplacer un peu plus
rapidement qu'une protéine fibrillaire (plus ou moins en forme de bâtonnet) parce
qu'elle "se faufile" mieux dans les mailles du gel, sans avoir besoin de se réorienter
constamment.
On peut contrôler la forme et la densité de charge des protéines pour les uniformiser
afin de pouvoir les séparer sur la base de la masse moléculaire. Pour cela, on utilise
des détergents anioniques, comme le dodecylsulfate de sodium (SDS), ou cationiques,
comme le bromure de cétyltriammonium (CTAB).
Hétéroprotéines
Beaucoup de protéines ne sont pas constituées uniquement d'acides aminés. Certaines
d'entre elles contiennent divers types de groupements: polysaccharides
(glycoprotéines), des acides gras (lipoprotéines), etc. D'autres peuvent avoir été
modifées par phosphorylation (phosphoprotéines), méthylation, acétylation, etc. Ce
sont des hétéroprotéines. Ces modifications covalentes peuvent affecter la migration.
Ainsi l'addition de molécules chargées (e.g. le phosphate d'une phosphoprotéine) va
augmenter ou diminuer la charge nette d'une protéine, avec les conséquences sur la
vitesse de migration.
La présence d'oligosaccharides (glycoprotéine) aura aussi un effet. Évidemment cela
va augmenter la masse moléculaire de la protéine. Mais comme ces groupements sont
beaucoup moins compacts que les acides aminés et ont peu d'affinité pour les
détergents, la géométrie (forme de la protéine) et la densité de charge sont affectées.
Ce phénomène explique pourquoi la migration de protéines fortement glycosylées est
anormalement lente par rapport à des protéines non glycosylées de masse moléculaire
identique.
Facteurs physico-chimiques affectant la migration
Les conditions physico-chimiques dans lesquelles on fait l'électrophorèse vont
influencer sur la migration. Par exemple, il peut arriver que certaines des protéines à
séparer puissent avoir une affinité non covente (lien hydrogène, interaction van der
Vall, hydrophobe, etc.) pour la matrice dans laquelle la migration se fait. Cette affinité
va évidemment retarder la migration des molécules. C'est une des raisons pourquoi
l'acrylamide est une matrice très utile: elle n'est pas chargée et n'a pas d'affinité

particulière pour les chaînes latérales des acides aminés apolaires.
Le pH peut évidemment avoir un role capital dans les élecrophorèses. C'est lui
déterminera la charge des acides aminés des protéines, donc une composante
importance du processus électrophorétique. De plus, il faut ternir compte que les
protéines ne sont pas solubles ou stables dans toute la gamme des pH. Ainsi, des pH
acides (< 5 pour la majorité des protéines) font précipiter les protéines en aggrégats
plus ou moins massifs qui ne peuvent se déplacer dans le gel. D'un autre coté des
conditions trop alcalines conduisent à l'hydrolyse de certains acides aminés ou du lien
peptidique. En général, on maintient des conditions entre pH 6 et 10. Les histones,
protéines très basiques, supportent bien des conditions acides et requierrent des
conditions spéciales d'électrophorèse: milieu acide, urée concentrée.
Polymérisation de l'acrylamide
Il s'agit d'une réaction de polymérisation de monomères d'acrylamide. L'acrylamide
(monomérique) a la formule chimique suivante:
CH2=CH-CO-NH2.
Notez la présence du double lien C-C à l'extrémité de la molécule.
Quand un des carbones impliqués dans le double lien prend, sous l'influence d'un
initiateur, une forme radicalaire (radical libre), il peut attaquer le double lien C=C
d'une autre molécule. La réaction peut se résumer de la façon suivante où "M" est un
monomère, "I" l'initiateur, le symbole "*" indique un radical et "- "indique un lien
covalent.
La chaîne réactionnelle commence par la formation spontanée ou induite d'un radical
au niveau l'initiateur:
I -> I*
La propagation de ce radical enclenche alors la polymérisation:
M + I* -> M*
M* + M ->M-M*
M-M* + M -> M-M-M*
(répétition n autres fois de la réaction en chaîne)
M-M-M* + n M -> M-M-M-(M)n-M*
Ainsi les monomères d'acrylamide entrent ainsi une réaction en chaîne ou de longs
polymères linéaires sont formés par la propagation de ces radicaux libres. En plus de
l'acrylamide en tant que tel, la réaction de polymérisation doit se faire en présence
d'agents réticulants et de catalyseurs de la réaction.
Réticulation

Une solution de polyacrylamide polymérisé seulement avec de l'acrylamide est
cependant liquide, quoique très visqueuse, donc impossible à manipuler. En effet,
l'acrylamide ne possède qu'un seul site de formation de radical par molécule et ne peut
donc donner que des chaînes linéaires plus ou moins longues sans lien entre elles.
Gel d’acrylamide non réticulé (sans agent réticulant)
Il y a formation de longues chaines linéaires sans liens entre elles
Au contraire, la présence d'agents réticulants permettra la formation de "ponts" entre
les chaînes d'acrylamide. La solution formera donc un gel solide et manipulable,
quoique flexible et plus ou moins fragile. Un agent réticulant ("cross-linker") peut
s'incorporer dans les longues chaînes de polyacrylamide pour les relier entre elles et
former un "filet" tridimensionnel qui sera solide et non pas liquide. Un agent
réticulant est une molécule qui a deux doubles liens C-C, généralement un à chaque
extrémité de la molécule. Chacun d'entre eux pourra dont s'intégrer dans le processus
de polymérisation de deux chaînes voisines de polyacrylamide, les liant entre elles.
Les gels obtenus sont solides, quoique plus ou moins fragiles selon les quantités
d'acrylamide et d'agent réticulant.
Acrylamide
(monomère)
Agent réticulant
Illustration schématique de l'acrylamide et d'un agent réticulant
Remarquez que cette représentation ne respecte pas les angles interatomiques et n'est faite que pour faciliter les
explications en illustrant de façon schématique les structures impliquées.
Les agents réticulants ("cross-linkers") sont des molécules qui peuvent entrer dans le
processus de polymérisation parce qu'elles possèdent, comme l'acrylamide, une
structure chimique leur permettant de former et de propager des radicaux libres entre
autres des doubles liens C=C. Mais ils possèdent cette structure en double, en général
à chaque extrémité de la molécule.
Ils peuvent donc participer à la formation de deux chaînes linéaires d'acrylamide, ce

qui permet la formation de "ponts" entre chacune de ces chaînes. Il en résulte donc un
réseau complexe faisant songer à un filet tridimensionnel dont les "mailles, plus ou
moins grosses, laisseront passer les protéines plus ou moins facilement selon leur
taille. Puisque le processus de polymérisation se produit de façon aléatoire, il y aura
plusieurs grosseurs de maille dans un même gel.
Gel d'acrylamide polymérisé avec agent réticulant.
Il y a formation de longues chaines linéaires liées entre elles par l'agent réticulant
La proportion acrylamide/réticulant et la nature de ce dernier détermineront les
capacités de séparation du gel en modifiant la porosité de ce "filet tridimentsionel".
Ainsi, plus la proportion de réticulant est grande, plus les mailles seront petites. Cette
grosseur aura une importance capitale dans la séparation des protéines. En effet, plus
les mailles du gel sont petites plus il y aura un effet de "tamisage moléculaire"
ralentissant les protéines qui auront à passer au travers.
Catalyseurs de la polymérisation
La polymérisation est donc initiée par la formation de quelques radicaux libres sur des
doubles liens C-C de l'acrylamide ou de l'agent réticulant. Ces radicaux libres ne se
forment pas spontanément sur l'acrylamide. Il faut mettre dans la solution des
catalyseurs (ou initiateurs de la formation de radicaux libres).
Il faut donc ajouter à la solution un (ou des) catalyseurs capables, 1) d'initier la
formation de radicaux libres qui pourront alors démarrer la réaction en chaîne de la
polymérisation, ce sont des initiateurs, et 2) de stimuler la réaction de propagation des
radicaux libres pour l'accélérer et l'empêcher de "s'étouffer", ce sont des accélérateurs.
La formation de radicaux libres par ces composés peut être, soit, immédiate après leur
mise en solution, soit, déclenchée par un phénomène physico-chimique. Généralement
deux types de catalyseurs doivent être combinés: un initiateur de radicaux libres et un
accélérateur.