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UNIVERSITE DES SCIENCE TECHNOLOGIQUE HOUWARI BOUMEDIENE
Méthode physico-chimique
Tp3 :Electrophorèse SDS-page
Realisé par:
 BOUREMANA meriem
 SALAH MANSOUR Houda
Group: G1
Année universitaire : 2019 / 2020
Plan :
I.
II.
III.
IV.
V.
VI.
VII.
VIII.
Introduction
But
Principe
Matériel
Méthode
Résultat
Interprétation
Conclusion
I.
Introduction :
Les protéines on été définies comme étant des macromolécules
biologiques présentes dans toutes les cellules vivantes, elles sont formées
d’une ou plusieurs chaines polypeptidiques. Chacune de ces chaines est
constituée de l’enchainement de résidus d’acides aminés liés entre eux par
des liaisons peptidiques.
Elles sont sous forme de réserve dans les graines (les protéagineux) comme
la fève et les petits pois.
II.
But :
Séparation de protéines des feuilles et des graines pour déterminer le poids
moléculaire.
III.
Principe :
Séparation des macromolécules chargées a travers un gel sous l’effet d’un
champ électrique.
IV.
Matériel :








V.
Mortier
Graines et feuilles de blé
Tampon (tris-HCl, glycérol, béta-mercaptoéthanol)
Centrifugeuse
Electrophorèse
Bleu de bromophénol
Tube à essai
Méthode :
Extraction :
Dans deux mortier on fait l’extraction des graines et feuilles de
séparément a sec puis on continue de broyer avec un tampon (tris-HCl,
glycérol) car les protéines sont solubles dans un milieu basique et on ajoute
le béta mercaptoéthanol pour détruire les Pons disulfures et on centrifuge
pendant 5 min (15000 tr/min). Le surnageons est récupéré et les protéines
sont dosées selon la méthode de Bradford a 595 nm en utilisant une
gamme étalon de BSA.
Préparation des 2 gels :
Gel de migration 15% il permet la séparation des molécules :
- acrylamide + Bis acrylamide
- Tris-HCl 1,5 M pH 8,8
- eau distillée
Au dernier moment ajouter
-PSA : un indicateur de polymérisation
-Du TEMED N, N, N’, N’- tétraméthylénediamin : accélérateur de
polymérisation (il est en solution)
D’abord, on met un peigne dans l’electrohorèse pour tracer la limite du gel
de migration puis verser une gélose pour éviter les fuites du gel et verser le
gel de migration immédiatement avant qu’il se gélifier. Entre temps on
prépare le gel de concentration 5% :
-acrylamide + Bis acrylamide
-Tris-HCl 0,5 M pH 6,8
-Eau distillée
-TEMED
-PSA (persulfate d’ammonium) a 10%
Apres la polymérisation du gel de migration verser le gel de concentration
sur le premier et placer le peigne profondément laissé polymériser 15 a 20
min.
Dosage :
1 ml de l’extrait de feuilles + 3 ml de Bradford dans 2 tubes.
20 µl de l’extrait de graines + 3 ml de Bradford + dilution 1/5 80 µl de l’eau
dans deux tubes. Après agiter les dans un agitateur.
Enlever le peigne, retourner l’appareil puis a l’aide d’une seringue déposer
les échantillons après avoir calculé la quantité a déposer.
VI.
Résultat :
Feuilles
Graines
1
0,71
0,51
2
0,84
0,69
Moyenne
0,77
0,6
concentration
1,52
6
DO = 0,506 [C]
[C] =
[C] =
0,77
0,506
0,6
0,506
= 1,52 mg / ml
= 1,18 * 5 = 6
-Graine :
6 mg →1 ml
6 µg → 1µl
50 µg → 8 µl d’extrait
80 µg → 13 µl
35 µg →5 µl
Vol
extrait
Graine 35 5
µg
Graine 50 8
µg
Graine 80 13
µg
eau
Dénaturant
10
15 µl
*4
7
15 µl
*4
2
15 µl
*4
20
/
10
*4
15
/
15
*4
-Feuille :
1,5 mg → 1 ml
1,5 µg → 1 µl
50 µg→ 33 µl
30 µg→ 20 µl
20 µg→ 13 µl
Feuille 30
µg
Feuille 23
µg
Distance parcourue
4mm
8mm
12mm
18mm
23mm
37mm
44mm
Tache1
Tache 2
Tache3
Tache4
Tache5
Tache6
Tache7
Log de poids
2.25
2.06
1.95
1.76
1.68
1.55
1.41
Log de poids
2,5
2
y = -62.4ln(x) + 108.1
1,5
Log de poids
1
Логарифмическая
(Log de poids)
0,5
0
0
2
4
6
8
y= -62.4ln(x) + 108.1
1 : y= -62.4 ln (1.2) + 108.1= 96.72 kDa
2 : y= -62.4 ln (2.5) + 108.1 = 50.92kDa
3 : y= -62.4ln (3) + 108.1 = 39.54 kDa
4 : y= -62.4ln (4.1) + 108.1 = 20.05kDa
VII.
interprétation :
D’après les résultats d’électrophorèse on a obtenus des bandes représentes
les protéines présentent dans les feuilles et graines.
D’après le nombre de bande obtenu la quantité des protéines présentes
dans les feuilles est supérieur a celle présente dans les graines cela est
expliqué par la quantité d’enzyme et d’hormone de nature protéique
nécessaire pour les différentes activités métabolique pour la feuille.
VIII.
Conclusion :
L’électrophorèse est une méthode d’analyse fondée sur la migration des
espèces chargées sous l’effet d’un champ électrique, elle s’applique dans
divers domaines tels que l’industrie, biologie et médecine…
Cette technique permet de :
 Déterminer le nombre de sous unités d’une protéine et de
déterminer leur masse molaire respective.
 D’évaluer le degré de purification d’une protéine.
 De séparer des protéines pour les révéler par la technique du
Western blot (réaction avec un ou des anticorps.
 De séparer les protéines sur des gels bidimensionnels.
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