Le sujet proposé a un caractère pluridisciplinaire

BTS BIOANALYSES ET CONTROLES
TECHNIQUES DE MICROBIOLOGIE
2e année - TP n°2
AFBB
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BREVET DE TECHNICIEN SUPERIEUR
BIOANALYSES ET CONTROLES
Epreuve E5 – Unité U52
Techniques de microbiologie
Au cours de l’épreuve, le jury appréciera les qualités d’organisation, le respect des règles d’hygiène
et de sécurité en laboratoire.
Pour une bonne réalisation de l’épreuve, une gestion optimale du temps imparti est nécessaire en
fonction des temps d’incubation. Le candidat prendra soin de bien lire l’ensemble du sujet avant de
commencer les manipulations.
Documents interdits – Calculatrice autorisée
1er JOUR – DUREE DE L’EPREUVE : 3h30
Microbiologie des eaux
La qualité microbiologique des eaux destinées à la consommation humaine à l'exclusion des eaux minérales naturelles est
définie par le décret no 89-3 du 3 janvier 1989 :
1.
L'eau ne doit pas contenir d'organismes pathogènes, en particulier de salmonelles dans 5 litres d'eau prélevée, de
staphylocoques pathogènes dans 100 ml d'eau prélevée, de bactériophages fécaux dans 50 ml d'eau prélevée et
d'entérovirus dans un volume ramené à 10 litres d'eau prélevée.
2.
95 % au moins des échantillons prélevés ne doivent pas contenir de coliformes dans 100 millilitres d'eau.
3.
L'eau ne doit pas contenir de coliformes thermotolérants et de streptocoques fécaux, dans 100 ml d'eau prélevée.
4.
L'eau ne doit pas contenir plus d'une spore de bactéries anaérobies sulfito-réductrices par 20 ml d'eau prélevée.
5.
Lorsque les eaux sont livrées sous forme conditionnée, le dénombrement des bactéries aérobies revivifiables, à 37°C
et après vingt-quatre heures, doit être inférieur ou égal à 20 par millilitre d'eau prélevée ; à 22 °C et après soixantedouze heures, il doit être inférieur ou égal à 100 par millilitre d'eau prélevée. L'analyse est commencée dans les douze
heures suivant le conditionnement.
6.
Lorsque les eaux sont livrées sous forme conditionnée, l'eau ne doit pas contenir de Pseudomonas aeruginosa dans
100 ml.
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1. Recherche et dénombrement des Escherichia coli par la technique de filtration
La norme ISO 9308-1 décrit une méthode rapide de recherche des E. coli.
Une adaptation de cette méthode est proposée.
1.1.Matériel

un flacon contenant 100 mL de l’échantillon d’eau noté « E »

un appareil à filtration stérile

une membrane stérile de porosité 0,45 µm

un tube d’eau distillée stérile

une gélose TBA coulée en petite boite de pétri

un tube contenant 3 mL de milieu TSA en surfusion
1.2.Mode opératoire
30 à 60 minutes avant d’effectuer la filtration, préparer le milieu en double-couche TBA + TSA.
Filtrer 100 mL de l’échantillon d’eau « E ».
Effectuer la filtration devant un examinateur.
Placer la membrane sur le milieu en double couche TBA + TSA (composition fournie en ci-dessous).
Incuber à 37°C pendant 4 heures puis à 44 °C pendant 20 heures.
1.3.Compte-rendu
Justifier les températures successives d’incubation et le choix du milieu TBA + TSA.
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2. Mise en évidence d’Escherichia coli dans une eau suspecte
2.1.Test de Mackenzie
Une colonie de coliforme obtenue après dénombrement par filtration a été réisolée sur gélose nutritive
inclinée. On se propose de réaliser un test de Mackenzie.
2.1.1. Matériel

Souche isolée sur gélose nutritive inclinée notée « X »

Tube de BLBVB + cloche de Durham

Tube d’eau peptonée

Tube d’eau physiologique stérile (5 mL)

Gélose nutritive en boite de Pétri
2.1.2. Mode opératoire
Ensemencer les milieux fournis.
2.1.3. Compte-rendu
Expliquer les recherches effectuées. Justifier la température d’incubation.
2.2.Mise en évidence et dénombrement des phages spécifiques d’E. coli
2.2.1. Matériel et réactifs

eau à analyser filtrée (en tube à hémolyse) notée « EF »

culture en bouillon d’Escherichia coli sensible notée « ECS »

un flacon contenant 100 mL de milieu TS en surfusion

5 tubes à hémolyse stériles

1 pipette de 1 mL stérile

8 mL de solution de CaCl2 stérile à 11,4 g.L-1

4 boites de Pétri vides et stériles

P200 et cônes stériles

1 tube contenant 4 mL de gélose molle en surfusion
2.2.2. Mode opératoire
Préparer 6 boites de Pétri contenant environ 15 mL de milieu TS. Laisser solidifier.
Effectuer une série de 4 dilutions décimales de l’eau « EF » en solution de CaCl2.
Dans chaque tube de gélose molle en surfusion, introduire :
-
0,1 mL de culture d’ E. coli sensible,
-
0,1 mL des dilutions de l’eau « EF » (100 à 10-4).
Verser rapidement le mélange sur une gélose coulée en boîte de Pétri. Laisser solidifier.
Incuber les boîtes 24h à 37°C.
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2.2.3. Compte-rendu
Pourquoi l’eau à analyser a-t-elle été filtrée ?
Expliquer la réalisation des dilutions de l’eau filtrée « EF ».
3. Etude des bactéries dénitrifiantes d’un biofilm
Les bactéries dénitrifiantes sont des bactéries hétérotrophes qui, grâce à une nitrate réductase, utilisent les
nitrates comme accepteurs terminaux d’une chaîne respiratoire en anaérobiose.
Certaines usines de traitements des eaux utilisent ces bactéries fixées sur des billes alvéolées pour former
un filtre biologique de dépollution.
3.1.Matériel

culture bactérienne de 24 heures sur gélose nutritive inclinée notée « D »

culture bactérienne de 24 heures en bouillon nitraté noté « Dbn »

un tube d’eau physiologique stérile (5 mL)

trois tubes de milieu viande-foie régénérés en surfusion

1 pipette de 1 mL stérile

un tube à hémolyse contenant 2 mL de solution de nitrate de sodium (100 g.L-1)

un tube contenant une solution de chlorate de potassium

un tube à hémolyse vide

réactifs de recherche de la nitrate réductase

lames et réactifs pour coloration de Gram

peroxyde d’hydrogène
3.2.Mode opératoire et compte-rendu
3.2.1. Mise en évidence des propriétés de dénitrification de la souche « D »
Vérifier que la souche possède une nitrate réductase.
Exposer la démarche et le résultat obtenu sur le compte-rendu.
Dans deux milieux viande-foie en surfusion, introduire 0,75 mL de solution de nitrate de sodium.
Dans l’un des deux viande-foie nitratés, introduire 5 gouttes de solution de chlorate de potassium.
Ensemencer les trois milieux viande-foie (VF « normal », VF nitraté, VF nitraté + chlorate).
Incuber à 30°C pendant 24 heures.
Calculer la concentration en nitrate de sodium dans le milieu VF, dont le volume est de 7,5 mL.
3.2.2. Identification de la souche « D »
Effectuer les observations microscopiques nécessaires puis un test enzymatique approprié.
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Appeler un examinateur pour les observations microscopiques.
Indiquer les résultats des examens microscopiques et du test enzymatique sur le compte-rendu.
Proposer sur le compte rendu une liste de milieux à ensemencer pour la vérification des caractères de
la souche test (la galerie choisie devra être en microméthode).
Cette partie du compte-rendu devra être rendue 60 minutes avant la fin de l'épreuve.
Ensemencer les milieux fournis.
Incuber les milieux
Préciser la température d’incubation souhaitée sur le compte-rendu.
4. Dénombrement des Pseudomonas aeruginosa dans une eau de lavage des
biofilms
Les filtres font plusieurs mètres d’épaisseur et sont source potentielle de contamination. Ils doivent être
lavés à l’eau toutes les 24 heures afin d’éliminer les impuretés (biomasse bactérienne). Les eaux de lavage
sont traitées en station d’épuration. On se propose d’évaluer la contamination par P. aeruginosa.
4.1.Matériel

un tube contenant 10 mL d’eau de lavage noté « L »

3 tubes contenant 9 mL d’eau stérile

3 pipettes de 1 mL stériles

pipette automatique P200 et cônes stériles

un flacon contenant 120 mL de milieu cétrimide en surfusion

6 boites de Pétri vides et stériles

billes de verre stériles pour étalement
4.2.Mode opératoire
Préparer 6 boites de Pétri contenant environ 15 mL de milieu cétrimide. Laisser solidifier.
Réaliser 3 dilutions décimales successives de l’eau « L ».
Dénombrer les trois dilutions par la technique d’ensemencement en surface.
Incuber à 30°C pendant 24 heures.
4.3.Compte-rendu
Justifier le choix du milieu de dénombrement.