mécanismes enzymatiques - les protéases à sérine

BCM 1502 Mécanismes catalytiques – Chymotrypsine Page 1/9
MÉCANISMES ENZYMATIQUES
LES PROTÉASES À SÉRINE - CHYMOTRYPSINE
Plusieurs enzymes protéolytiques sont appelées protéases à sérine, car le
mécanisme de catalyse fait appel à une sérine qui est particulièrement réactive. La
chymotrypsine catalyse l'hydrolyse du lien peptidique d'une protéine, coupant sur le
côté C-terminal des acides aminés à longues chaînes latérales aromatiques ou
hydrophobes (Phe, Trp et Tyr).
La cinétique enzymatique de la chymotrypsine, montrée ci-bas, révèle deux
phases d'activité: une première phase rapide suivie d'une deuxième phase plus lente
et constante.
Ceci est dû au fait que l'enzyme forme un intermédiaire covalent avec le
substrat. La première phase de la réaction se produit avec l'enzyme libre, ce qui
libère rapidement un produit de la catalyse, alors qu'un deuxième produit forme un
intermédiaire covalent avec l'enzyme (la figure sur la page suivante). Cet
intermédiaire est hydrolysé et libéré plus lentement pour régénérer l'enzyme. Par
conséquent, la vitesse de formation du premier produit est d’abord rapide (la
première phase) mais se ralentit tandis que le complexe acyl-enzyme s’accumule
Cinétique de l’hydrolyse du p-nitrophénylacétate catalysée par la chymotrypsine
à deux concentrations différentes. L’extrapolation à temps zéro des courbes de
l’état stationnaire donne la concentration de l’enzyme active.

BCM 1502 Mécanismes catalytiques – Chymotrypsine Page 2/9
jusqu’à ce que la vitesse de formation du premier produit approche celle de la
libération du deuxième produit correspondant à l’état stationnaire.
Site Actif
Le groupe réactif au site actif est constitué d'une triade catalytique; la sérine
195 est l'acide aminé qui réagit avec le substrat, alors que l'histidine 57 et l'acide
aspartique 102 contribuent à rendre la sérine particulièrement réactive.
- voir site actif de la chymotrypsine notant la direction de liaison et la
disposition d`His 57 et d’Asp 102 par rapport de la sérine réactive. Le site actif se
situe dans la fente entre les deux domaines structuraux qui composent la protéase.
Mécanisme catalytique est de type ping
pong bi bi. L’enzyme se lie rapidement au
substrat et libère le premier produit, l’ion
p-nitrophenolate (chromatophore jaune
intense), mais le deuxième produit, l’ion
acétate, est libéré plus lentement.
Ion alcoolate

BCM 1502 Mécanismes catalytiques – Chymotrypsine Page 3/9
Dans la figure de la page suivante, le cycle catalytique des protéases à sérine
(chymotrypsine) se décompose en quatre étapes majeures.
Réaction 1 : La sérine 195 attaque de façon nucléophile l’atome de carbone
du carbonyle de la liaison pour former un intermédiaire tétraédrique (covalent).
Réaction 2a : Le tétraèdre se décompose dû à l’instabilité de la charge
négative sur l’oxygène du carbonyle alors lorsqu'il capte un proton de l’His 57.
L’intermédiaire acyle-enzyme se forme par catalyse générale acide grâce à His 57
polarisé par Asp 102 du site actif.
Réaction 2b : Ceci est suivi par la libération du produit amine et son
remplacement par une molécule d’eau.
Réaction 3 : Un deuxième intermédiaire tétraédrique se produit.
Réaction 4 : La décomposition de l’intermédiaire tétraédrique en sens inverse
de la réaction 1 donne le produit carboxylique et l’enzyme active.
Chymotrypsine - Site actif
Liaison du
substrat

BCM 1502 Mécanismes catalytiques – Chymotrypsine Page 4/9
La meilleure évidence pour l'existence d'un intermédiaire tétraédrique
provient des études cristallographiques entre la trypsine, une protéase à sérine très
similaire (homologue) à la chymotrypsine, et son inhibiteur (bovine pancréatique
trypsine inhibiteur BPTI). Le BPTI est une petite protéine qui a comme rôle
d'inactiver toute trypsine qui aurait été activée de façon prématurée dans le pancréas
afin d'empêcher la digestion de l'organe. Sa constante d'affinité pour la trypsine est
extrêmement forte, de l'ordre de 1013 M.
1
2a
3
4
H2O
R’NH2
2b
Mécanisme catalytique des protéases à sérine

BCM 1502 Mécanismes catalytiques – Chymotrypsine Page 5/9
La partie de BPTI en contact avec le site actif ressemble au substrat lié en
occupant la poche de spécificité et forme presque un intermédiaire covalent
tétraédrique entre le Ser 195 et le carbone du carbonyle de Lys 15 de BPTI. La
réaction cependant ne peut pas procéder dû à la rigidité du site actif et par le fait que
l'eau ne peut pas s'insérer due à des contacts 'étanches' entre l’enzyme et l’inhibiteur.
Par conséquent la deuxième partie de la réaction, l’hydrolyse de l'intermédiaire
acyle ne peut pas se faire.
L'augmentation du taux de catalyse par la chymotrypsine est due au fait que le
substrat se fixe dans sa forme d'état de transition. Les évidences sont les suivantes:
1) distorsion conformationelle avec formation de
l'intermédiaire tétraédrique favorisent la pénétration de
l'oxygène du carbonyle de la liaison à couper dans un nouvel
endroit plus profondément dans le site actif - > ' trou pour
l'oxyanion '
2) formation de deux nouveaux ponts hydrogènes avec
'oxyanion' qui ne peuvent pas se former si le carbonyle reste dans
sa géométrie trigonale et planaire.
3) la distorsion tétraédrique résultante permet au groupe NH de la liaison
peptidique qui précède la liaison scissile de former un pont hydrogène, qui n’aurait
pu se former autrement, avec le carbonyle du squelette protéique de Gly 193.
BPTI
Trypsine