mécanismes enzymatiques - les protéases à sérine

MÉCANISMES ENZYMATIQUES
LES PROTÉASES À SÉRINE - CHYMOTRYPSINE
Plusieurs enzymes protéolytiques sont appelées protéases à sérine, car le
mécanisme de catalyse fait appel à une sérine qui est particulièrement réactive. La
chymotrypsine catalyse l'hydrolyse du lien peptidique d'une protéine, coupant sur le
côté C-terminal des acides aminés à longues chaînes latérales aromatiques ou
hydrophobes (Phe, Trp et Tyr).
La cinétique enzymatique de la chymotrypsine, montrée ci-bas, révèle deux
phases d'activité: une première phase rapide suivie d'une deuxième phase plus lente
et constante.
Cinétique de l’hydrolyse du p-nitrophénylacétate catalysée par la chymotrypsine
à deux concentrations différentes. L’extrapolation à temps zéro des courbes de
l’état stationnaire donne la concentration de l’enzyme active.
Ceci est dû au fait que l'enzyme forme un intermédiaire covalent avec le
substrat. La première phase de la réaction se produit avec l'enzyme libre, ce qui
libère rapidement un produit de la catalyse, alors qu'un deuxième produit forme un
intermédiaire covalent avec l'enzyme (la figure sur la page suivante). Cet
intermédiaire est hydrolysé et libéré plus lentement pour régénérer l'enzyme. Par
conséquent, la vitesse de formation du premier produit est d’abord rapide (la
première phase) mais se ralentit tandis que le complexe acyl-enzyme s’accumule
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jusqu’à ce que la vitesse de formation du premier produit approche celle de la
libération du deuxième produit correspondant à l’état stationnaire.
Mécanisme catalytique est de type ping
pong bi bi. L’enzyme se lie rapidement au
substrat et libère le premier produit, l’ion
p-nitrophenolate (chromatophore jaune
intense), mais le deuxième produit, l’ion
acétate, est libéré plus lentement.
Site Actif
Le groupe réactif au site actif est constitué d'une triade catalytique; la sérine
195 est l'acide aminé qui réagit avec le substrat, alors que l'histidine 57 et l'acide
aspartique 102 contribuent à rendre la sérine particulièrement réactive.
Ion alcoolate
- voir site actif de la chymotrypsine notant la direction de liaison et la
disposition d`His 57 et d’Asp 102 par rapport de la sérine réactive. Le site actif se
situe dans la fente entre les deux domaines structuraux qui composent la protéase.
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Chymotrypsine - Site actif
Liaison du
substrat
Dans la figure de la page suivante, le cycle catalytique des protéases à sérine
(chymotrypsine) se décompose en quatre étapes majeures.
Réaction 1 : La sérine 195 attaque de façon nucléophile l’atome de carbone
du carbonyle de la liaison pour former un intermédiaire tétraédrique (covalent).
Réaction 2a : Le tétraèdre se décompose dû à l’instabilité de la charge
négative sur l’oxygène du carbonyle alors lorsqu'il capte un proton de l’His 57.
L’intermédiaire acyle-enzyme se forme par catalyse générale acide grâce à His 57
polarisé par Asp 102 du site actif.
Réaction 2b : Ceci est suivi par la libération du produit amine et son
remplacement par une molécule d’eau.
Réaction 3 : Un deuxième intermédiaire tétraédrique se produit.
Réaction 4 : La décomposition de l’intermédiaire tétraédrique en sens inverse
de la réaction 1 donne le produit carboxylique et l’enzyme active.
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Mécanisme catalytique des protéases à sérine
1
2a
H2 O
2b
R’NH2
3
4
La meilleure évidence pour l'existence d'un intermédiaire tétraédrique
provient des études cristallographiques entre la trypsine, une protéase à sérine très
similaire (homologue) à la chymotrypsine, et son inhibiteur (bovine pancréatique
trypsine inhibiteur BPTI). Le BPTI est une petite protéine qui a comme rôle
d'inactiver toute trypsine qui aurait été activée de façon prématurée dans le pancréas
afin d'empêcher la digestion de l'organe. Sa constante d'affinité pour la trypsine est
extrêmement forte, de l'ordre de 1013 M.
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La partie de BPTI en contact avec le site actif ressemble au substrat lié en
occupant la poche de spécificité et forme presque un intermédiaire covalent
tétraédrique entre le Ser 195 et le carbone du carbonyle de Lys 15 de BPTI. La
réaction cependant ne peut pas procéder dû à la rigidité du site actif et par le fait que
l'eau ne peut pas s'insérer due à des contacts 'étanches' entre l’enzyme et l’inhibiteur.
Par conséquent la deuxième partie de la réaction, l’hydrolyse de l'intermédiaire
acyle ne peut pas se faire.
BPTI
Trypsine
L'augmentation du taux de catalyse par la chymotrypsine est due au fait que le
substrat se fixe dans sa forme d'état de transition. Les évidences sont les suivantes:
1) distorsion conformationelle avec formation de
l'intermédiaire tétraédrique favorisent la pénétration de
l'oxygène du carbonyle de la liaison à couper dans un nouvel
endroit plus profondément dans le site actif - > ' trou pour
l'oxyanion '
2) formation de deux nouveaux ponts hydrogènes avec
'oxyanion' qui ne peuvent pas se former si le carbonyle reste dans
sa géométrie trigonale et planaire.
3) la distorsion tétraédrique résultante permet au groupe NH de la liaison
peptidique qui précède la liaison scissile de former un pont hydrogène, qui n’aurait
pu se former autrement, avec le carbonyle du squelette protéique de Gly 193.
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De plus, la triade catalytique sert de donneur/accepteur de protons.
La spécificité de la réaction pour différentes protéases, proviens de la forme
de la poche hydrophobe qui permet de positionner certains substrats et d'en exclure
d'autres.
Par exemple, la trypsine préfère les acides aminés basiques (Arg et Lys: +)
parce qu'un acide aspartique (-) est situé au fond de la poche. De même, l'élastase
préfère les acides aminés à courte chaîne latérale parce que deux résidus glycines
dans la poche de la chymotrypsine sont remplacés par une valine et une thréonine, ce
qui bloque l'entrée de la poche.
Quand la chaîne latérale s’installe dans cette poche sur l'enzyme, il positionne
la liaison peptidique pour l'attaque.
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Régulation de l’activité protéolytique
La régulation de l'activité de l'enzyme se fait par activation protéolytique.
Ces enzymes sont synthétisées sous forme de précurseur non actif (zymogène) et
sont ensuite activées par un clivage protéolytique. Le manque de régulation
provoque une autolyse ou une digestion prématurée des tissus qui ont synthétisé des
protéases - pancréatite aiguë.
Trypsinogène
Autolyse: la
trypsine catalyse sa
propre activation
Entéropeptidase
Trypsine
Activation de
chymotrypsinogène
Activation de
pro-élastase
Activation de
pro-carboxypeptidase
La trypsine est activée par une entéropeptidase et par autoactivation
subséquente. La trypsine peut ensuite activer d'autres zymogènes, comme la
chymotrypsine en la clivant entre les acides aminés 15 et 16. La chymotrypsine
s'autolyse ensuite pour exciser deux dipeptides: Ser14-Arg15 et Thr147-Asn148.
Ile16
Asp194
Asp
Ser
His
1MTN
Chymotrypsinogène
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2CGA
Chymotrypsine
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L'activation se fait lorsque l'extrémité N-terminale Ile16 nouvellement formée
migre vers l'intérieur de la molécule et forme une paire ionique avec Asp194. Ceci a
pour conséquence de reformer le site actif de manière productive notamment la
poche qui contrôle la spécificité de liaison et le "trou pour l'oxyanion" et ainsi
permettre de fixer le substrat adéquatement.
Par exemple, les résidus de la séquence précédente, suivante et incluant Ser
189, qui formant une partie du mur de la poche de spécificité de la chymotrypsine,
sont organisés de façon spatiale différente empêchant la liaison du substrat de façon
efficace. De plus, le NH amide de Gly 193 pointes dans la mauvaise direction pour
former une liaison hydrogène avec l’intermédiaire tétraédrique. Ainsi, la très faible
activité enzymatique des zymogènes vient de leur capacité restreinte à se lier au
substrat et de stabiliser l’intermédiaire tétraédrique – voir figure ci-bas.
Analogue de l’état
de transition
Trou de l’oxyanion
Gly 193
His 57
Asp 194
Ile 16
Gly 193
Ser 195
Asp 102
Asp 194
Figure montrant la superposition de la structure du chymotrypsinogène (PDB#
2CGA), en vert, avec celle de la chymotrypsine en complexe avec un analogue de
l’état de transition (PDB# 1VGC). À noter que chez le chymotrypsinogène,
l’oxygène du carbonyle de Gly 193 est orienté de façon opposée à celle de la
chymotrypsine ainsi empêchant la formation du trou de l’oxyanion dans
l’intermédiaire tétraédrique.
Rappel : Les zymogènes ont des sites actifs déformés. Des comparaisons poussées
entre zymogènes et enzymes correspondantes ont permis de comprendre la faible
activité des zymogènes. Même si leurs triades catalytiques se ressemblent
fortement, les poches de spécificité et leurs trous de l’oxyanion ne sont pas formés
correctement.
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Récapitulation : Stabilisation de l’état de transition des protéases
à sérine
Poche de
spécificité
a) Dans le complexe michaelien de la chymotrypsine, la liaison du substrat
compresse le pont d’hydrogène entre Asp102 avec l’atome Nδ1 du His57 qui
provoque un déplacement en densité d'électrons vers l'autre azote N2 du His57 (non
impliqué dans ce pont d`hydrogène). Ceci devient une base très forte qui permet à
His57 à déprotoner Ser195 et la transformer en nucléophile fort qui attaque le
carbone électrophilique du substrat. L’oxygène du carbonyle développe ainsi une
charge partielle négative.
b) Dans l’intermédiaire tétraédrique, le trou de l'oxyanion stabilise cet oxygène avec
la charge négative par des liaisons hydrogène avec les amides NH du squelette
protéique de Gly193 et Ser195. La réaction avance dû à l’instabilité de la charge
négative sur cet oxygène du substrat et qui conduit à la perte de l'intermédiaire
tétraédrique et la reformation d'une double liaison avec le carbone qui ensuite clive la
liaison peptidique. La protonation par His57 du N-terminus naissent facilite son
déplacement.
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