BIO241_ET1_corrigé_Mai12
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BIO241 Examen terminal 1ère session (21 mai 2012) Documents et calculatrices non autorisés ATTENTION : Les parties A, B et C doivent être traitées sur des copies séparées 9 pages Notation sur 80 Partie A : C. Breton (25 points) Question 1 – Protéines (6 points) a) Soient 3 protéines membranaires A, B et C. En fonction des indications données ci‐dessous pour ces 3 protéines, illustrer à l’aide d’un schéma la façon dont ces protéines sont associées à la membrane : A est une protéine polytopique B et C sont des protéines monotopiques. A et C sont des protéines intrinsèques B est une protéine extrinsèque Schéma à faire (vu en cours) b) La protéine P est modifiée par N‐acétylation au niveau d’un résidu Lysine. Donner la réaction et l’incidence de cette modification sur la fonction de la protéine. Ajout d’un groupement CO-CH3 sur la fonction -amine ‐(CH2)4‐NH3+ → ‐(CH2)4‐NH‐CO‐CH3 Cette MPT neutralise la charge + et introduit un groupement hydrophobe. En modifiant la charge et la taille de la chaîne latérale des résidus lysine cela modifie son microenvironnement protéique, éventuellement sa conformation) et le mode d’interaction avec ses molécules cibles (ex : histones/ADN) C’est une modification réversible Question 2 – Métabolisme (19 points) Le graphe ci‐dessus donne le profil d’énergie de la glycolyse. a) Donner les noms des huit métabolites intermédiaires de la glycolyse (a, b, c, ….i) et des enzymes (1, 2, 3) qui catalysent les réactions indiquées par des flèches. Quelle est l’importance de ces enzymes dans la glycolyse ? a‐ Glc‐6P f‐ 1,3‐BPG b‐ Fru‐6P g‐ 3‐PG c‐ Fru‐1,6‐bisP h‐ 2‐PG d‐ DHAP i‐ PEP e‐ GAP 1‐ HK, 2‐ PFK, 3‐ PK Ces 3 enzymes sont les points clé de régulation de la glycolyse b) Pourquoi appelle t’on la première partie de la glycolyse, phase d’investissement en énergie ? Parce que cette première phase (réactions 1‐5) ne permet pas de produire de l’ATP. Au contraire, les réactions 1 et 3 consomment un ATP c) D’une façon générale, quels sont les moyens utilisés par la cellule pour réguler l’activité des enzymes clé des voies métaboliques ? - régulation génétique (influe sur le nombre de molécules de E produites) - régulation allostérique (activateur/inhibiteur qui influe sur la vitesse de la réaction) - modification covalente (passage d’une forme d’enzyme on / off) ex : phosphorylation Autres réponses acceptées -disponibilité des S et co-enzymes -retro-inhibition d) La Glycéraldéhyde‐3P‐deshydrogénase (G3PDH) peut‐être inhibée par l’iodoacétate. ‐ Rappeler la réaction précise catalysée par cette enzyme (donner juste les noms pas les formules). GAP + Pi + NAD+ → 1,3‐BPG + NADH,H+ ‐ En vous aidant du graphe ci‐dessus, à votre avis, quel métabolite intermédiaire va s’accumuler le plus rapidement, en cas d’inhibition de la G3PDH ? Justifier votre réponse. Réponse : Fru1,6-bis-P Car si la première conséquence sera l’accumulation des triose-P, très vite l’équilibre (déjà peu favorable) sera déplacé dans le sens de la formation du Fru1,6bisP e) D’après les concentrations cellulaires des métabolites, mesurées dans le muscle au repos, données ci‐après : [Fructose‐6‐P] = 1 mM, [Fructose‐1,6‐bisP] = 10 mM, [ATP] = 5 mM, [ADP] = 0,5 mM, [AMP] = 0,1 mM et [Pi] = 10 mM Indiquer si la réaction catalysée par la phosphofructokinase dans le muscle sera plus ou moins exergonique que la même réaction réalisée en conditions standard. Réponse : G’=G°’ + RT Ln [F26BP]x[ADP]/[F6P]x[ATP] G’=G°’ + RT Ln [10]x[0,5]/[1]x[5] G’=G°’ Donc la réaction n’est pas plus ni moins exergonique f) le glucose‐6‐phosphate est un carrefour métabolique important. Il a plusieurs destins possibles. Indiquer 3 de ces destins : glycolyse, néoglucogenèse, synthèse de glycogène, ... g) Quelle est la fonction du glucagon ? Quand cette molécule est produite, quel est son impact sur le métabolisme du glycogène, la glycolyse et la néoglucogenèse au niveau des cellules hépatiques ? Il s’agit d’une hormone hyperglycémiante produite par le pancréas et dont l’action est d’augmenter la conc de glucose dans le sang Elle augmente la glycogénolyse, elle active la néoglucogenèse et inhibe la glycolyse. h) Un individu qui souffre d’une déficience en Glucose‐6‐phosphatase souffre d’hypoglycémie chronique. Expliquer pourquoi. C’est en effet l’enzyme de la voie néoglucogenèse permettant de reformer du glucose à partir de Glc‐ 6‐P dans le foie. Le Glc est ensuite excrété dans la circulation. PARTIE B Bioénergétique et Enzymologie : cours de Mme F. Cornillon Question 1 Les protéases sont des enzymes peu spécifiques qui catalysent l'hydrolyse des liaisons peptidiques au sein de protéines très diverses. On peut néanmoins noter que selon les protéases les liaisons peptidiques hydrolysées ne sont pas les mêmes, on parle alors de spécificité de coupure selon les protéases. Quelle est la spécificité de coupure de la chymotrypsine, protéase pancréatique largement étudiée depuis 1950 ? dans le sens N-›C, après les aa aromatiques, Tyr, Trp ou Phe. Qu'est-ce qui garantit, au niveau du site actif de la chymotrypsine, cette spécificité de coupure ? C'est une poche profonde et hydrophobe appelée S1 pocket Ecrire, en formules semi-developpées, la réaction catalysée par la chymotrypsine en prenant un exemple de votre choix mettant en évidence cette spécificité de coupure. Rnterm-PheCH-CO-NH-CH-RCterm+H2O RNterm-PheCH-CO-OH +N+H3-CH-RCterm Question 2 L'étude enzymatique de la chymotrypsine s'effectue pour plus de commodité sur un substrat artificiel, le para-nitrophénylacétate (pNPA) car le produit d'hydrolyse, le paranitrophénol (pNP), absorbe à 410 nm. pNP + acétate Les études cinétiques de la réaction pNPA + H2O catalysée par la chymotrypsine, ont donné les résultats suivants. Ces résultats ont permis de mettre en évidence que la réaction se faisait en deux temps, une étape rapide et une étape limitante. Quels sont les produits libérés au cours de chacune de ces deux étapes ? Justifier à l'aide de la courbe. Pente élevée en 1ere partie : vitesse de libération de pNP rapide pente plus faible en 2nd partie : vitesse de libétation de pNp plus lente limitée par la libération de l'acétate. Donc P1 = pNP et P2 = acétate L'étape limitante s'explique par la formation d'un intermédiaire covalent entre un acide aminé clé de la chymotrypsine et la partie du substrat qui correspond au second produit, libéré dans un deuxième temps. Quel est cet acide aminé clé du site catalytique de la chymotrypsine ? Donner son nom et sa position dans le cas de la chymotrypsine. SER 195 Détailler la structure de l'intermédiaire réactionnel covalent entre cet acide aminé clé et la partie du substrat correspondante. SER 195- CH2 – O – CO – CH3 (acétate) D'autres études ont permis de mettre en évidence l'existence de 2 autres acides aminés catalytiques dans le site actif de la chymotrypsine. Quels sont ces deux autres acides aminés du site catalytique de chymotrypsine ? Donner leur nom et leur position dans le cas de chymotrypsine. la la HIS 57 et ASP 102 Ecrire, en les positionnant correctement les uns par rapport aux autres, les chaînes latérales des 3 acides aminés de la triade catalytique de la chymotrypsine. Question 3 Une étude cinétique de la chymotrypsine sur le paranitrophényl acétate est menée avec 50 µL d'une solution d'enzyme purifiée, diluée au 1/200e dans un volume final de 2 mL, à pH 7,4 et température de 37°C. Cette étude conduit aux résultats de la figure 1. Les données brutes correspondant aux points A et B de la figure 1, ont été malencontreusement mélangées par l'expérimentateur. Elles sont présentées dans les figures 2 et 3 ci-dessous. Commenter l'allure de la courbe obtenue dans la figure 3 et ses différentes parties. Hyperbole avec partie linéaire correspondant aux conditions de vitesse initiale, et plateau équilibre atteint ou épuisement du substrat. Que pouvez-vous dire de la figure 2 ? c'est juste le début de l'hyperbole qui est présenté. Préciser les conditions de mesure fixées dans chacune des figures 2 et 3. 50 µL d'une solution d'enzyme purifiée, diluée au 1/200e à pH 7,4 et température de 37°C pour une concentration en substrat pNPA initiale de 2,7 mM dans la figure 2 et de 0,2 mM dans la figure 3. Quelles sont les données obtenues dans les figures 2 et 3 ? Donner leur valeurs numériques. Justifier. Nous obtenons 2 V0 (pente à l'origine) dans 2 conditions de [S]0 différentes. dans la figure 2, pente = 0,21/0,5 = 0,42 mM.min-1 dans la figure 3, pente = 0,21/1 = 0,21 mM.min-1 Retrouver la correspondance entre les points A et B et les figures 2 et 3. Justifier. Figure 2 = point B (coordonnées 2,7 mM ; 0,42 mM.min-1 ) figure 3 = point A (coordonnées 0,2 mM ; 0,21 mM.min-1 ) La figure 1 est reproduite ci-dessous. Donner un titre complet à la figure 1. Détermination de Vm et Km de la chymotrypsine sur le pNPA pour 50 µL d'une solution d'enzyme purifiée, diluée au 1/200e , à pH 7,4 et température de 37°C Cinétique michaëlienne. Exploiter les résultats obtenus directement sur la figure 1. Km légendé Vm légendé Donner leurs valeurs numériques. Vm = 0,42 mM.min-1 Km = 0,2 mM Donner la définition de l'activité enzymatique. Dans quelles conditions se place-ton pour la mesurer ? Les rappeler. L'activité enzymatique correspond au nombre de nmol de substrat transformées par seconde, elle est mesurée pour 1 mL de solution enzymatique (en nkat.mL-1) dans les conditions optimales de mesure (T° opt et pH opt) et à concentration en substrat saturante. Calculer l'activité enzymatique de 1 mL de la solution de chymotrypsine purifiée. AE (50µL à 1/200) = dn subtrat transtformées/dt = Vm x vréactionnel = (0,42.10-3/60 ) x 2.10-3 = 14 nkat AE (1mL concentrée) = 14 x 20 x 200 = 56 000 nkat.mL-1 Question 4 Cette solution de chymotrypsine purifiée a été obtenue suite à une purification en deux étapes, une précipitation au sulfate d'ammonium et une filtration sur gel. Quels sont les critères de séparation de chacune de ces deux techniques ? Solubilité en présence de sels masse molaire apparente Le tableau 1 en annexe présente les résultats de cette purification. L'activité enzymatique a été mesurée avec 50 µL de solution enzymatique diluée au 1/400 dans un volume réactionnel de 2 mL, à 37°C et à pH 7,4. Donner la définition de l'activité spécifique. L'activité spécifique correspond à l'activité de 1 mL de solution d'enzyme ramenée en nkat.mg-1 de protéines contenues dans 1mL de solution enzymatique. Donner la définition de l'activité totale. L'activité totale, en nkat, correspond à l'activité de 1 mL de solution enzymatique multiplié par le volume de solution enzymatique disponible. Donner la définition du rendement. Rdt % = (ATEP / ATEB )x100 Donner la définition du facteur de purification. FP = ASEP / ASEB Remplir le tableau de purification en donnant un exemple de calcul pour chaque colonne. Volum e total (mL) Conc. en protéines (mg.mL-1) AE* (nkatal) AS (nkatal.mg1) AT (nkat) Rdt (%) FP 100 20 0,5 200 4.105 - - Précipitation au sulfate d’ammonium 2 200 20 800 32.104 80 4 Filtration sur gel 5 24 6 2000 24.104 60 10 Extrait brut * L'activité enzymatique est mesurée avec 50 µL de solution enzymatique diluée au 1/400e dans un volume réactionnel de 2 mL. AE = 0,5x20x400 = 4000 nKat.mL-1 AS = AE (1mL)/conc en prot = 0,5 x 20 x 400/ 20 = 200 nkat.mg-1 AT = AE (1mL)x vol total = 0,5 x20 x 400 x 100 = 400000 nkat Rdt =32.104 /4.105 = 80% FP = 800 / 200 = 4 Partie C : Métabolisme bactérien Mr Y. Markowicz La bactérie acétogène Acetobacterium woodii est capable de d’oxyder une grande variété de substrats carbonés, tels que fructose ou méthanol. Dans les deux cas, A. woodii produit de l’acétyl-coenzyme A, qu’elle est ensuite capable de convertir en acétate grâce à l’action successive d’une phosphotransacétylase (1) et de l’acétate kinase (2) : (1) acétyl-CoA + Pi CoA + acétylphosphate (2) acétylphosphate + ADP acétate + ATP 1) Comment appelle-t-on le mode de production de l’ATP correspondant à la réaction catalysée par l’acétate kinase ? Connaissez-vous un autre exemple d’une telle production ?(1 point) 2) Quel autre moyen de produire de l’ATP ont les bactéries ? (0,5 point) 3) Selon vous, quelles seront les conséquences, au niveau du métabolisme global, de l’utilisation de chacune des deux sources de carbone mentionnées ? (2 points) Le milieu de culture utilisé pour cultiver A. woodii contient systématiquement KH2PO4 (1.76 g.l-1) et K2HPO4 (8.44 g.l-1), NH4Cl (1 g.l-1), Cystéine (0,5 g.l-1), MgSO4 (0,33 g.l-1), NaCl (2,9 g.l-1), extrait de levure (2 g.l-1), KHCO3 (6 g.l-1), solution d’oligoéléments (solution SL 9, 1 ml.l-1), solution de sélénite-tungstate (1 ml.l-1), et solution de vitamines (2 ml.l-1). Le pH est ajusté à 7,1/7,2. Les cultures sont incubées à 30 °C sous une atmosphère N2-CO2 (80:20 vol/vol), afin de maintenir des conditions anaérobie, et avec agitation constante. Une culture a été réalisée dans ce milieu, auquel ont été ajoutés du fructose 20 mM et du caféate 2 mM. On sait que la bactérie est capable de catalyser la réaction suivante : (HO)2C6H3CH=CHCOOH + 2 [H] (HO)2C6H3CH2–CH2COOH caféate (acide caféique) Des prélèvements ont été faits à différents temps, pour doser les concentrations en caféate (■), fructose (●) et acétate (▲). Les résultats sont présentés dans la figure ci-contre : 4) Au vu de ces résultats, des informations qui vous ont été données quant au devenir de l’acétyl-coA et du caféate et de vos connaissances sur le métabolisme bactérien, quel rôle pouvez-vous proposer pour le caféate dans le catabolisme du fructose chez A. woodii (notez bien que la concentration en caféate reste stable pendant plus de 50 minutes, contrairement aux concentrations en fructose et acétate) ? (2 points) La même expérience a été faite avec des cultures bactériennes dans lesquelles on avait ajouté, en lieu et place du fructose : du CO2 ; un mélange CO2/H2. Avec le seul dioxyde de carbone, on n’observe aucune production d’acétate, et la concentration en caféate reste stable. Avec la combinaison CO2/H2, on note par contre une production non négligeable d’acétate, ainsi qu’une diminution de la concentration en caféate. 5) En quoi le fait d’ajouter de l’hydrogène dans le milieu de culture permet-il aux bactéries de croître dans un milieu contenant du CO2 comme seule source de carbone ? (2 points) 6) Au vu de toutes les données évoquées dans ce travail, pouvez-vous dire (justifiez vos réponses en quelques mots) si A. woodii est : a. prototrophe ou auxotrophe ? (1 point) b. autotrophe ? (0,5 point) c. hétérotrophe ? (0,5 point) d. organotrophe ? (0,5 point) e. lithotrophe ? (0,5 point) 7) Au vu des expériences évoquées, pouvez-vous dire si A. woodii est anaérobie stricte, anaérobie aérotolérante ou anaérobie facultative ? (2 points) 8) Quelle expérience complémentaire pourriez-vous suggérer qui vous permettrait de préciser ou de confirmer votre réponse à la question précédente (explicitez le dispositif expérimental en quelques mots, et indiquez les résultats attendus et leur interprétation) ? (2,5 points) Réponses : 1) Phosphorylation au niveau du substrat (0,5 point) Ex : PEP + ADP (0,5 point) pyruvate + ATP 2) (0,5 point) Etablissement d’un gradient de protons transmembranaire : retour des protons dans la cellule et synthèse d’ATP par l’ATPase membranaire 3) Fructose : les carbones sont injectés « en haut », comme avec le glucose (1 point) Méthanol : production d’acétyl-coA, qui va entrer dans le cycle de Krebs (production de coenzymes réduits pour synthétiser de l’ATP via la respiration) et remonter la glycolyse et la voie des pentoses phosphate pour synthétiser les 8 métabolites précurseurs manquants (1 point) 4) Le catabolisme du fructose génère des coenzymes réduits, qui vont devoir être réoxydés (1 point) Le caféate peut être réduit : il va servir d’accepteur d’électrons terminal dans la chaîne respiratoire (1 point) 5) L’hydrogène permet aux bactéries de produire des électrons et des protons (1 point) Ceux-ci vont servir à réduire le CO2 et produire du formate, puis de l’acétyl-coA (et de l’acétate) (1 point) 6) a. prototrophe ou auxotrophe ? (1 point) auxotrophe : dans le milieu de culture, on a rajouté des vitamines et de la cystéine b. autotrophe ? (0,5 point) oui : A. woodii peut utiliser le CO2 comme seule source de carbone c. hétérotrophe ? (0,5 point) non : si A. woodii est autotrophe, elle n’est donc pas hétérotrophe d. organotrophe ? (0,5 point) oui : A. woodii peut utiliser le fructose comme source d’électrons e. lithotrophe ? (0,5 point) oui : A. woodii peut utiliser H2 comme source d’électrons 7) (2 points) Non : on sait qu’elle respire caféate ou CO2 en absence d’oxygène, mais on ne sait pas comment elle se comporte en présence d’oxygène 8) Cultiver A. woodii dans un tube contenant le même milieu, en présence d’oxygène, de fructose et de caféate : (1 point) si les bactéries poussent partout, et mieux en haut qu’en bas, c’est qu’elles respirent l’oxygène en haut et le caféate en bas, elles sont donc anaérobie facultatives (0,5 point) si les bactéries poussent partout, de façon homogène, c’est qu’elles ne respirent pas l’oxygène mais respirent le caféate, et que l’oxygène n’est pas toxique pour elles, elles sont donc anaérobie aérotolérantes (0,5 point) si les bactéries ne poussent pas en haut mais poussent en bas, c’est qu’elles respirent le caféate mais que l’oxygène les tue, elles sont donc anaérobie strictes (0,5 point)
