Chapitre 1 : INTRODUCTION

UNIVERSITE LIBRE DE BRUXELLES
Faculté des Sciences Appliquées
Service de Chimie Organique
Etude par microcalorimétrie des effets de
protonation associés aux interactions
enzyme-inhibiteur
Promoteur : Dr. Kristin Bartik
Année académique 2003-2004
Mémoire de fin d’études
présenté en vue de
l’obtention du grade
d’Ingénieur Civil Chimiste
Wylock Christophe

Remerciements
Je tiens tout d’abord à remercier le professeur Kristin Bartik de m’avoir accueilli dans
son service, de m’avoir apporté le soutien nécessaire à la réalisation de ce travail et
d’avoir su me pousser quand il le fallait. Merci pour votre patience, votre pédagogie
et votre enthousiasme au travail.
Je tiens aussi à remercier tout spécialement Gilles Bruylants de m’avoir appris les
bases du laboratoire ainsi que de m’avoir fait partager son savoir. Il m’a
accompagné, tel un grand frère dévoué, tout au long de cette passionnante aventure
et a toujours été là pour répondre à mes interrogations.
Egalement un grand merci à Juliana pour ses coups de main au laboratoire ainsi
qu’à Nicole qui permet à la planète P2 de tourner en rond et pour la bonne humeur
qu’elle a su me transmettre.
Je tiens aussi à remercier tous ceux qui ont assisté à mes répétitions et qui m’ont
permis d’avancer vers le bon chemin.
Enfin, merci à tous mes collègues de bureau Gilles, Sophie, Marina et Gaëlle, pour
l’ambiance chaleureuse que j’ai ressenti parmi eux durant toute cette année.

Table des matières
Résumé
Chapitre 1 : Introduction ........................................................................................... 1
1.1) Cadre général ................................................................................................... 1
1.2) Les interactions non-covalentes ....................................................................... 1
1.3) La reconnaissance moléculaire ........................................................................ 3
1.4) Interaction récepteur ligand .............................................................................. 3
1.5) Enzyme et inhibiteur ......................................................................................... 5
1.6) Effet de protonation lors de l’interaction enzyme-inhibiteur réversible .............. 9
1.7) But du travail .................................................................................................. 10
Chapitre 2 : Calorimétrie à titrage isotherme (ITC) ............................................... 11
2.1) Généralités ..................................................................................................... 11
2.2) Description ..................................................................................................... 12
2.3) Détermination des paramètres thermodynamiques ........................................ 15
Chapitre 3 : Interaction trypsine – benzamidine ................................................... 17
3.1) Présentation ................................................................................................... 17
3.2) Détermination par ITC de la constante d’affinité et de l’enthalpie d’interaction
trypsine-benzamidine ....................................................................................... 19
3.4) Conclusion ..................................................................................................... 21
Chapitre 4 : Interaction chymotrypsine – proflavine ............................................ 22
4.1) Présentation ................................................................................................... 22
4.2) Détermination des constantes d’affinité par spectroscopie UV-Visible ........... 26
a) Principe ...................................................................................................... 26
b) Méthode choisie ......................................................................................... 27
c) Détermination des constantes d’affinité ..................................................... 29
d) Résultats .................................................................................................... 30
e) Discussion ................................................................................................. 32

4.3) Détermination par ITC de l’enthalpie d’interaction .......................................... 37
a) Méthode choisie ......................................................................................... 37
b) Résultats .................................................................................................... 39
c) Discussion .................................................................................................. 39
4.5) Conclusion ..................................................................................................... 47
Chapitre 5 : Conclusion .......................................................................................... 49
Chapitre 6 : Matériaux et méthodes ....................................................................... 52
Chapitre 7 : Bibliographie ....................................................................................... 55

Résumé
Ce travail a été réalisé dans le cadre de l’étude des interactions non-covalentes
entre petites molécules et protéines qui conduisent à la formation d’un complexe
réversible. Nous nous sommes intéressés au cas particulier de l’interaction entre une
molécule chargée et une protéine possédant des résidus pouvant être chargés dans
le site de complexation de la petite molécule. Nous avons étudié l’effet de l’état de
protonation de ces résidus chargés dans le site de complexation de la protéine sur
les grandeurs thermodynamiques caractérisant l’interaction.
Nous avons utilisé deux systèmes modèles de type enzyme-inhibiteur :
trypsine-benzamidine,
chymotrypsine-proflavine.
La trypsine et la chymotrypsine sont deux enzymes possédant au niveau du site de
complexation une histidine. L'état de protonation de cette histidine peut varier dans
une gamme de pH autour du pH physiologique. La benzamidine et la proflavine sont
des petites molécules qui sont protonées dans cette gamme de pH.
L’étude par calorimétrie à titrage isotherme (ITC) du système trypsine-
benzamidine n’a malheureusement pas pu nous donner de résultats exploitables.
Nous avons conclu que les problèmes rencontrés étaient dus à l’autolyse de la
trypsine, malgré toutes les précautions prises pour tenter de l'inhiber.
Le système chymotrypsine-proflavine ne présente pas de problème d'autolyse
mais ces molécules ont tendance à s'agréger. Ce problème est évité en travaillant à
des concentrations faibles. A cause de cette contrainte, nous n’avons pu déterminer
que l’enthalpie d’interaction par ITC, pas la constante d’affinité. Celle-ci a été
déterminée par spectroscopie UV-Visible.
Les résultats indiquent que l’interaction est beaucoup plus favorable avec la
chymotrypsine lorsque le site de complexation est déprotoné. Cela a pour
conséquence que l'équilibre de protonation de ce site est déplacé par l'interaction
avec l'inhibiteur, ce qui conduit à un échange de protons avec le tampon. Le choix du