Rappel : parameters cinétiques

Rappel : paramètres cinétiques
Les réactions enzymatiques obéissent à l’équation de Michaelis-Menten
k1
k2
E + S ⇌ ES Æ E + P
k-1
v0 =
V max = k cat [ E ]
kcat :
-
KM :
-
-
cat
=k
2
[S ]
max
K + [S ]
M
K
M
=
(k −1 + k 2 )
k
1
vitesse de renouvellement (« turnover number »)
le nombre de molécules de substrat transformées en produit par unité de temps et par
site actif, lorsque l’enzyme est saturé par le substrat
constante de Michaelis-Menten
concentration en substrat où v0 = ½ Vmax
caractérise l’interaction de l’enzyme avec un substrat donné
KM = constante de dissociation du complexe ES lorsque l’équilibre entre (E + S) et
ES est rapide (k-1 >> k2)
kcat/KM :
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k
V
constante de spécificité
Indicateur de l’efficacité catalytique de l’enzyme envers un substrat donné
Cinétique et mécanisme des protéases
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Application => mécanisme à 3 étapes
Pour expliquer la cinétique « bi phasique » observée lors de l’hydrolyse du p-nitrophényl acétate
par la chymotrypsine, il faut faire intervenir un intermédiaire supplémentaire où le substrat forme
un lien covalent avec l’enzyme durant la réaction.
k2 = constante de vitesse d’acylation
k3 = constante de vitesse de déacylation
Équation complète décrivant la libération du p-nitrophénolate lors de l’hydrolyse du PNPA :
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A. Implication de Ser195
L’enzyme acétylée (Enz-CO-CH3) est stable à faible pH et a pu être isolée. Une analyse d’acides
aminés a permis de découvrir que le groupement acétyl était lié à la sérine 195.
Utilisation du diisopropylfluorophosphate (DFP)
La chymotrypsine contient 27 résidus sérine mais un seul, le résidu 195, réagit avec le DFP. De
même, le DFP inactive les autres protéines à sérine en faisant également une liaison covalente
avec la sérine active (attaque nucléophile).
Le fluorure de phénylméthanesulfonyl (PMSF) peut aussi être utilisé à cette fin.
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B. Implication de His57
Utilisation du N-tosyl-L-phénylalanylchlorométhylcétone (TPCK)
Les marqueurs d’affinité ont des structures semblables à celles des substrats naturels, mais
réagissent d’une manière irréversible avec l’enzyme.
La chymotrypsine est inactivée par le N-tosyl-L-phénylalanylchlorométhylcétone (TPCK). Ce
réactif est pourvu d’un groupe aromatique qui peut s’ajuster au site de spécificité de l’enzyme.
Un groupement nucléophile du site actif (His57) peut alors attaquer le groupement
chlorométhylcétone du TPCK. Il s’agit d’une inhibition irréversible compétitive, car l’addition
de substrat protège l’enzyme contre l’inhibition et le marquage. Le mécanisme détaillé implique
possiblement une réaction avec Ser195 pour former un intermédiaire réactionnel.
N-Tosyl L- phenylalanyl
chloromethyl ketone
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Alkylated derivative of
hystidine 57 at active site of chymotrypsin
(inactive)
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C. Existence d’une triade catalytique
C’est la résolution cristallographique de la structure tertiaire de la chymotrypsine par diffraction
aux rayons X qui a permis de situer le noyau imidazole de l’His57 à environ 3.8 Ǻ de la Ser195.
À proximité de l’His57 on trouve également le groupe carboxylate de l’Asp 102 situé à 2.8 Ǻ du
groupe imidazole. La conformation de ces trois résidus est stabilisée par une série de liaisons
hydrogène.
Ce réseau de liaisons hydrogène augmente le caractère nucléophile de la Ser195 dont dépend
l’activité de l’enzyme.
Le rôle de l’Asp102 a été vérifié par mutagénèse dirigée. On a remplacé l’Asp102 par un résidu
isostérique non chargé : l’Asn. Le mutant Asp102Asn a des propriétés cinétiques qui diffèrent
largement de celles de l’enzyme sauvage. Son KM n’est pas très différent mais le paramètre kcat
se trouve diminué d’un facteur de 5000. Il est donc clair que le résidu Asp102 est important pour
la catalyse enzymatique, mais pas absolument nécessaire.
Dans le cas du mutant Asp102Asn, le pKa de l’His57 est abaissé de 1.5 unités de pH. Ceci
souligne l’importance du microenvironnement d’un résidu ionisant quant à la valeur de son pKa.
Le mutant Asp102Asn réagit 10000 fois moins vite avec le DFP que l’enzyme sauvage, et 10
fois moins vite avec le RLCK. La nucléophilicité de la Ser195 est donc nettement diminuée, par
contre, la réactivité de l’His57 semble moins affectée pour la réaction avec le TLCK. L’effet
principal de la mutation de l’Asp102 se situe au niveau de la réactivité de la Ser195 qui confère à
la Ser195 son caractère nucléophile élevé.
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Les étapes de la réaction catalysée par la chymotrypsine
Mechanism of chymotrypsin cleavage of a peptide bond between phenylalanine and glycine. In Step 1, the
enzyme-substrate complex forms. In Step 2, the serine hydroxyl oxygen attacks the carbonyl carbon of the
peptide bond of the substrate to give a tetrahedral intermediate. In Step 3, the negatively charged oxygen is
stabilized in the oxyanion pocket, and the substrate peptide bond breaks, leaving an acyl-enzyme intermediate. In
Step 4, a water molecule attacks the acyl-enzyme intermediate to give a second tetrahedral intermediate. In Step
5, the tetrahedral intermediate collapses, regenerating active chymotrypsin.
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1. Formation du complexe ES
Le substrat se positionne dans une orientation favorable à la réaction. La chaîne latérale de la
phénylalanine du substrat se place dans une cavité hydrophobique qui constitue le principal site
de spécificité de cette enzyme.
Acylation
2. Attaque nucléophile de la Ser195 sur le carbonyle du substrat
On a production d’un intermédiaire tétraédrique avec développement d’une charge négative sur
l’atome d’oxygène du carbonyle. Cet intermédiaire est stabilisé par des ponts hydrogène dans la
cavité oxyanionique, mais il ne s’accumule pas durant la réaction.
3. Le lien peptidique du substrat est brisé avec libération d’une amine
L’expulsion de l’amine est assistée par un transfert de proton de l’His57 (catalyse acide). On
obtient un nouvel intermédiaire : l’acyl-enzyme. Cet intermédiaire peut s’accumuler durant la
réaction.
Déacylation
4. Attaque de l’acyl-enzyme par une molécule d’eau
Une molécule d’eau réagit avec le carbonyle de l’acyl-enzyme pour former un nouvel
intermédiaire tétraédrique. Cette attaque est facilitée par une catalyse basique par l’His57.
5. Conversion en produit et régénération de l’enzyme
L’intermédiaire tétraédrique est converti en produit, avec régénération de l’enzyme libre.
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Comparaison des structures primaires de la chymotrypsine, de la trypsine et de l’élastase.
Schematic diagram of the amino acid sequence of chymotrypsin, typsin, and elastase. Each
circle represents one amino acid. Amino acid positions that are identical in all three proteins are
in solid color. Long connections between nonadjacent amino acids represent disulfide bonds.
Locations of the three catalytically important amino acid side chains (histidine, aspartate, and
serine) are marked. Location of sites that are cleaved to cleaved to transform the preenzyme to
the active enzyme are indicated by parentheses, either double ( ) or single ).
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Structure 3-D de la chymotrypsine
Schematic diagram of the structure of chymotrypsin, which is folded into two domains of
the antiparallel β type. The six β strands of each domain are red, the side chains of the catalytic
triad are blue, and the S-S bridges that join the three polypeptide chains are marked in purple.
Chain A (green, residues 1-13) is linked to chain B (blue, residues 16-146) by an S-S bridge
between Cys 1 and Cys 122. Chain B is in turn linked to chain C (yellow, residues 149-245) by
an S-S bridge between Cys 136 and Cys 201. Dotted lines indicate residues 14-15 and 147-148
in the inactive precursor, chymotrypsinogen. These residues are excised during the conversion
of chymotrypsinogen to the active enzyme chymotrypsin.
Les structures tertiaires de la trypsine et de l’élastase sont très similaires à celle de la
chymotrypsine même si leurs séquences ont moins de 50% de résidus en commun. Les
différences majeures entre les structures 3-D se situent dans les régions exposées et sur les
boucles externes des enzymes.
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Interactions d’un inhibiteur placé au site actif de la chymotrypsine
Inhibiteur : Ac-Pro-Ala-Pro-Tyr-COOH
A diagram of the active site of chymotrypsin with a bound inhibitor, Ac-Pro-Ala-Pro-TyrCOOH. The diagram illustrates how this inhibitor binds in relation to the catalytic triad, the
substrate specificity pocket, the oxyanion hole and the nonspecific substrate binding region. The
inhibitor is red. Hydrogen bonds between inhibitor and enzyme are striped. (Adapted from
M.N.G. James et al., J. Mol. Biol. 144 : 43-88, 1980.)
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Conservation de la triade catalytique dans la famille des subtilisines
La séquence d’acides aminés ainsi que la structure 3-D de la subtilisine ressemblent bien peu à
celles de la chymotrypsine. Cependant, le site catalytique de la subtilisine possède une triade de
résidus semblable à celui des autres protéases à sérine et le mécanisme catalytique est le même
pour les deux familles d’enzymes. La subtilisine offre donc un exemple d’évolution
convergente, phénomène par lequel des protéines non apparentées ont développé, en vue d’un
processus déterminé, un mécanisme identique. Des organismes non apparentés ont donc trouvés
la voie d’énergie minimale pour effectuer cette réaction.
Par compassion, la grande homologie de séquence et de structure tertiaire entre la
chymotrypsine, la trypsine et l’élastase, semble dériver par évolution divergente d’un protéine
ancestrale dont le mécanisme s’est conservé.
Subtilisine
Chymotrypsine
Chymotrypsine
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Asp32 …… His64 …… Ser221
His57 …… Asp102 …… Ser195
Subtilisine
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