des bactéries lactiques isolées à partir d`un produit lai

UNIVERSITE KASDI MERBAH OUARGLA
Faculté des Sciences de la Nature et de la Vie
Département des Sciences Biologique
Mémoire En vue de l’obtention du diplôme de
MASTER ACADEMIQUE
Domaine : Science de la Nature et de la Vie
Filière
: Biologie
Spécialité : Microbiologie Appliquée
Présente par : OUCHERIF Khadidja
SELLEMA Madjda
Thème
Etude des substances antimicrobiennes (type bactériocine)
des bactéries lactiques isolées à partir d’un produit laitier
fermenté traditionnel (J’ben)
Soutenu publiquement
Le : 11/06/2015
Devant le jury :
Mme OULED EL HADJ –KHLIL A.
Professeur
Président
UKM Ouargla
Mr BOURICHA M’hamed
M.A. A
Encadreur
UKM Ouargla
Melle DJELLOUL DAOUADJI S.
M.A.A
Examinateur UKM Ouargla
Année universitaire : 2014/2015
REMERCIMENTS
♠ Nous tenons tout d’abord à remercier le bon Dieu tout puisant de nous avoir aidées à
réaliser ce modeste travail.
♠ Ce travail a été effectué sous la direction de Monsieur Bouricha M’hamed M.A.A.
Qu’il nous soit permis de lui exprimer notre vifs sentiments de gratitude, pour avoir dirigé ce
travail, pour l’aide, le suivi et l’attention constante qu’il a apporté à notre égard, lors de
l’élaboration de ce projet. Malgré l’emploi du temps chargé, vous avez su vous montrer
disponible.
♠ Nous nous adressons toute notre reconnaissance à Monsieur Bensassi Bachagha.
Responsable à la spécialité de microbiologie Master LMD. Grâce à ses précieux conseils
nous avons pu équilibrer entre la préparation de ce modeste travail. Nous avons eu la chance
de bénéficier de conseils très utiles.
♠ Nous souhaitons remercier tous les enseignants et enseignantes qui nous ont fait
former durant ces 5 années, en nous préparant pour cette dernière année de Master . La
clarté de votre enseignement nous a profondément marqué. Vive reconnaissance et sentiment
respectueux.
♠ Nous tenons à exprimer nos respectueux et sincères remerciements aux personnels de
la bibliothèque et de laboratoire de l’ITAS, de nous avoir accueilli en mettant à notre
disposition tous ce qu’on avait besoin
♠ Nous désirons aussi remercier notre présidente madame Ouled El Hadj Khlil Aminata,
professeur à l’université d’Ouargla et notre examinatrice Melle Douadji S. maitre de assistant
classe A à l’université d’Ouargla département de science de la nature et de la vie d’avoir
bien voulu nous faire l’honneur de participer au jury et de contribuer à l’examinassions de
ce travail . C’est avec plaisir est spontanéité que vous avez accepté de noter notre thème.
C’est également un grand honneur pour nous d’être jugé par vous «Soyez profondément
remercié».
♠ Nous tenons plus largement à exprimer notre reconnaissance à toutes celles et à tous
ceux qui ont contribué directement ou indirectement au bon déroulement de ce travail.
♠ Nous saisissons cette occasion pour exprimer notre profond respect et reconnaissance
aussi à Monsieur Boutarfaia A. Professeur et Directeur de l’Université d’Ouargla pour
nous avoir facilité notre formation dans cette merveilleuse Université en fournissant tout ces
efforts pour mettre à notre disposition tous ce dont on avait besoin durant ces années.
Dédicace
je dédie ce mémoire
ᴥ A la mémoire de mes grands parents qui ont souhaité vivre pour longtemps juste pour me
voir ce que je vais devenir.
ᴥ A la très chère, qui remplit mon cœur de clarté, à l’idole immortelle, à ma mère. Ce travail est
le fruit de tes nombreux sacrifices et encouragements. Qu'elle trouve ici le témoignage de mon
affection et de ma profonde reconnaissance.
ᴥ A mon père, les mots ne suffisent guère pour exprimer l’attachement, l’amour et l’affection
que je porte pour toi.
ᴥA mes très chers frères Mehdi et Amir,. Je vous dédie ce travail avec tous mes vœux de
bonheur, de santé et de réussite.
ᴥ A tous les membres de ma famille paternelle et maternelle, veuillez trouver dans ce modeste
travail l’expression de mon affection.
ᴥA mes chères ami(e)s, Madjda, Djamila ,Fatma , aicha ,Hayet, abir et zineb
A mes chèr(e)s collègues surtout : Mohamed Amine, khadra, Sabrina, Sara, Imen, Zohra, Rachida,
Hadjer, Hanna, ,Linda et Farah,
Je ne peux trouver les mots justes et sincères pour vous exprimer mes pensées, vous êtes
pour moi des frères, sœurs et des amis sur qui je peux compter.
En témoignage de l’amitié qui nous uni et des souvenirs de tous les moments que nous
avons passé ensemble, je vous dédie ce travail et je vous souhaite une vie pleine de santé et de
bonheur.
Oucherif Khadidja
Liste des tableaux
Page
Tableau 1
: Composition chimique moyenne du lait de vache et de chèvre
05
(g/L) (Alves de Oliveira, 2007) et * (http://www.fao.org (2002)
Tableau 2
La composition physico-chimique de J’ben . (Thomas et Dubeuf,
09
1995)
Tableau 3
Leurs caractéristiques physicochimiques (Hancock et Gilmore ,
11
2000)
Tableau 4
Bactériocines de classe III produites par des bactéries lactiques.
21
(Nilsen et al., 2003 ; Papagianni, 2003 ; Nigutova et al., 2007).
Tableau 5
Les principales bactériocines produites par certaines espèces 2 6
de
bactéries lactiques (Dortu et Thonart, 2009).
Tableau 6
Spectre d‘action des bactériocines des bactéries lactiques
27
Tableau 7
Bactéries pathogènes utilisées dans le test.
35
Tableau8
Résultats de coloration de Gram et aspects microscopiques des
42
souches
isolées ainsi que le mode de regroupement
Tableau 9
Résultats des tests physiologique
45
Tableau10
Caractère fermentaire et fermentation de sucres
49
Tableau11
Les caractéristiques biochimiques des souches lactiques isolées
55
Tableau 12
Identification des souches
56
Tableau13
Diamètre des zones d‘inhibition (mm) des bactéries lactiques à
58
activité antimicrobienne
Tableau 14
Résultat de l‘activité antibactérienne des bactéries lactiques vis-à-
61
vis Staphylococcus aureus
Tableau 15
La variation de pH et de degré Dornic en fonction du temps chez 63
les souches S89 et S87
LISTE DES FIGURES
Page
Figure 1
Différents produits du lait fermenté (université de Batna,
10
Depat : Agro)
Figure 2
Séquence et structure de lantibiotiques de type A (Nisine), B 19
(Mersacidine) et d‘un lantibiotique « two-peptides » (Lacticine
3147 A1 et A2) — Sequence and structure of a type A lantibiotic
(Nisin), a type B lantibiotic (Mersacidin) and a « two-peptides »
lantibiotic (Lacticin 3147 A1 and A2) (Nigutova et al., 2007).
Figure 3
Structures tridimensionnelles de quelques bactériocines de classe 20
IIa.
Figure 4
Schéma de la biosynthèse, la régulation de la biosynthèse et
23
l‘immunité desbactériocines de classe IIa.( Fregeau et al., 1997)
Figure 5
Formation de pores membranaires par le complexe nisine-lipide II 25
(Chatterjee et al., 2005).
Figure 6
Mode d‘action utilisé par les bactériocines de classe IIa et par les 25
lactococcine A et B (classe IId) d’après (Diep et al., 2007).
Figure5
Méthode des spots (Fleming et al., 1975)
36
Figure 6
Méthode des puits (Barefoot et Klaenhammer, 1983)
38
Figure 7
Méthode de mesure de l‘acidité Dornic
39
Figure8
Obtention des colonies pures après plusieurs repiquages sur le 45
milieu MRS
Figure 9
(solide et liquide) Colonie provient de milieu M17
Observation microscopiques de la souche M17 S83 (A) Gr x 100 46
et MRS S79(B) Gr x 40 Coloration de Gram
Figure 10
Type fermentaire sur milieu MRS liquide glucosé contenant la 47
cloche du Durham
Figure 11
Voies fermentaires de la dégradation du glucose (Atlan et al., 48
2008).
Figure 12
Profil fermentaire (utilisation des sucres) souche S85 isolée de 50
MRS.
Figure 13
Test de bleu de Sherman à 1% et 3%
51
Figure14
Test de l‘hydrolyse de l‘arginine
52
Figure 15
Test de citrate sue le milieu KMK
52
Figure 16
Métabolisme du citrate par les souches citrate-positive chez les 53
lactocoques et les entérocoques (Mc Sweeney et Fox, 2004).
Figure 17
Test de production des exopolysaccharides ( dextrane)
54
Figure 18
Test de l‘activité antimicrobienne des bactéries lactiques
57
Méthode de spot ((Fleming et al., 1975)
Figure 19
Activité antibactérienne de
Lactobacillus brevis
vis-à-vis
59
Staphylococcus aureus Par méthode de diffusion (puits)
(Barefoot et Kaenhammer, 1983)
Figure 20
Activité antibactérienne de Leuconostoc cremoris vis-à-vis
60
Staphylococcus aureus Par méthode de diffusion (puits)
Figure 21
Activité antibactérienne de Lactococcus diacetilactis vis-à-vis
60
Staphylococcus aureus . Par méthode de diffusion (puits)
Figure 22
Activité antibactérienne d‘ Enterococcus durans
vis-à-vis
60
Staphylococcus aureus Par méthode de diffusion (puits)
Test de recherche des bactériophage ( absence de plage de lyse)
62
Coagulation du lait ensemencé par les bactéries lactiques ( après
63
Figure23
Figure 24
18h)
Figure 25
Dosage d‘acidité
63
Figure 26
Variation de pH en fonction du temps chez les souches S78 et S89
64
Figure27
Variation de l‘acidité exprimée en degrés Dornic en fonction du 64
temps chez les souches S78 et S89
:
Liste des abréviations
Ac : acide
ADH : Arginine dihydrolase
ARG : arginine
ATCC : American Type of culture collection
BL/LAB : Bactéries Lactiques/Lactic Acid Bacteria
°C: Degré Celsius
CO2: dioxyde de carbone
°D: Degré dornic
FAO/OMS: Food and Agriculture Organization /Organisation Mondiale de la Santé
GN : gélose nutritive
g : gramme
GRAS : Generally recognized as safe
h: heure
KDa : kilo dalton
Lact : Lactococcus
Leuc : Leuconostoc
MG : matière grasse
ml : millilitre
NaC1: chlorure de sodium
NAD : nicotinamide-adénine-dinucléotide
NaOH : hydroxyde de sodium
pH: potentiel Hydrogène
Ppm : parties par million
S. thermophilus :Streptococcus thermophilus
ssp/ subsp : sous-espèce
T°: Température
UFC/ml : Unité formant colonie par millilitre
Zi : Zone d‘inhibition
Sommaire
Remerciements
Dédicace
Liste des figures
Liste des tableaux
Liste des abréviations
Résumé
Abstract
‫ملخص‬
Introduction
1
Synthèse bibliographique
Chapitre I : Le Lait et les produits laitiers fermentés traditionnels
I.1. Définition de lait
3
I. 2 . Définition du lait fermenté
3
I.3. Composition du lait
4
I.3.1 Caractère physicochimique du lait
4
I.4. Microflore du lait et du produit laitier fermenté traditionnel (J‘ben)
5
I.4.1. Microflore du lait
5
I.4.2. Microflore du fromage frais (J‘ben)
6
I.5. Produits laitiers traditionnels
6
I.5.1. Rayeb / Raïb / lait caillé
6
I.5.2. L‘ben traditionnel / Lait fermenté écrémé
7
I.5. 3. Zebda/ Beurre frais traditionnel
7
I.5.4. Bouhezza
8
I.5.5. Klila
8
I.5. 6. . Aoules
8
I.5.7 Lebaa
8
I.5.8. Méchouna
8
I.5.9. Madghissa
8
I.5.10. J‘ben / fromage blanc/ fromage frais
8
I.5.11. Autres types des produits laitiers fermentés
9
Chapitre II : Bactéries lactiques du lait
I1. Les bactéries lactiques
10
II.1. Caractéristiques générales
10
II.1.1. Bacillus Bifidus ou Bifidobacterium
10
II.1.2. Enterococcus
11
II.1.3 Lactobacillus
11
II.1.4. Lactococcus
11
II.1.5. Leuconostoc, Oenococcus et Weissella
12
II.1.6.Pediococcus et Tetragenococcus
12
II.1.7.Streptococcus
12
II.1.8. Aerococcus
13
II.1.9. Alloiococcus
13
II.1.10. Carnobacterium
13
Chapitre III : Les substances antimicrobiennes
III. Composés antibactériens produits par les bactéries lactiques
14
III.1. Acides organiques
14
III.2 .Peroxyde d‘hydrogène
15
III.3. Acides gras
15
III.4. Dioxyde de carbone (CO2)
15
III.5. Acétaldéhyde
15
III.6. Di acétyle (2,3- butanédione)
16
III. 7.Reutérine
16
III. 8. Reutéricycline
16
III. 9. 2-pyrrolidone-5-carboxylic Acide
16
III.10. Bactériocine
17
III. 10. 1. Définition des bactériocines
17
III. 10. 2. Bactériocines des bactéries lactiques
17
III.10.3. Découverte de la bactériocine
18
III.10.4. Classification des bactériocines des bactéries lactiques
18
III.10.4.1. Classe I Lantibiotiques
19
III.10.4.2.Classe II Peptides non modifiés.
20
III.10.4.3.Classe III
III.10.4.4.Classe IV
III.10.5. Biosynthèse des bactériocines et sa régulation
20
21
21
III.10.6. Mode d‘action des bactériocines des bactéries lactiques
23
111.10.7. Application biotechnologique des bactériocines des bactéries lactiques
27
Partie expérimentale
Matériel et méthodes
I. 1. Matériels
29
I.2.Matériel Biologique
30
II. Echantillonnage
30
III. Mesure du pH
30
IV. Préparation des dilutions décimales
30
IV.1. Préparation de la dilution mère
30
IV.2. Préparation des dilutions décimales
31
V. Isolement, Purification et Conservation des souches
31
VI. Pré-identification des souches
32
VI. 1. Identification phénotypique
32
VI. 1. 1. Caractères morphologiques
32
VI. 1. 1. 1. L‘aspect macroscopique
32
VI. 1. 1.2 L‘aspect microscopique
32
VI. 1. 1.3. Etat frais
32
VI.2. Tests d‘identification
32
VI. 2.1 Identification physiologique et biochimique
32
VI.2.1.1. Test catalase
32
VI.2.1.2. Croissance à différentes températures, pH et à différentes concentration de NaCl 33
VI.2.1.3 Thermoresistance
33
VI. 2.1.4 Type fermentaire
33
VI.2.1.5. Test de bleu de Sherman (1937)
33
VI.2.1.6. Hydrolyse de l‘arginine
34
VI.2.1.7. Utilisation du citrate
34
VI.2.1.8 Profil fermentaire (Utilisation des sucres)
34
VI.2.1.9. Production des exo-polysaccharides (dextrane)
35
VII .Test technologique
35
VII. 1 Etude des activités antimicrobiennes des souches isolées
35
VII.1.1 Souches bactériennes pathogène et leurs origines
35
VII.1.2. criblage des souches à activité antimicrobienne
36
VII.1.3. Méthode de détection directe / Méthode des spots (Fleming et al., 1975)
36
VII.1.4. Méthode de détection indirecte / Méthode des puits (Barefoot et Klaenhammer,
1983)
37
VII.2. Recherche des bactériophages
38
VIII. Cinétique d'acidité et l‘acidité Dornic
38
Résultats et discussion
I. Mesure du pH
40
II. Isolement, purification et conservation des souches
40
III. Pré-identification des souches
41
III. 1. Identification phénotypique
41
III. 1. 1. Caractères morphologiques
41
III. 1. 1. 1. Aspect macroscopique
41
III. 1.1.2 Aspect microscopique
41
III. 1.1.3. Etat frais
42
IV. Tests d‘identification
43
IV.1. Identification physiologique et biochimique
43
IV. 1.1 Test catalase
43
IV.1.2. Croissance à différentes températures, pH et à différentes concentration de
NaCl et thermorésistante
43
IV.1.3 Type fermentaire
47
IV. 1.4 .Profil fermentaire (Utilisation des sucres)
49
IV.1.5 Test de bleu de Sherman (1937)
50
IV.1.6 Hydrolyse de l‘arginine
51
IV.1.7 Utilisation du citrate
52
IV.1.8 Production des exo-polysaccharides (dextrane)
54
V .Test technologique
56
V. 1 Etude des activités antimicrobiennes des souches isolées
56
V.1.1 criblage des souches à activité antimicrobienne
56
V.1.2. Méthode de détection directe / Méthode des spots (Fleming et al., 1975)
57
V.1.2.1.Mesure de spectre d‘inhibition
58
V.1.3. Méthode de détection indirecte / Méthode des puits (Barefoot et Klaenhammer,
1983)
59
V.2. Recherche des bactériophages
62
VI. Cinétique d'acidité et l‘acidité Dornic
62
Conclusion et perspective
66
Références bibliographiques
Annexes
Introduction
Introduction
Introduction
Le lait est un produit difficile à conserver et facile altérer, surtout dans les endroits
à climat très chaud ; et pour cette raison il a été toujours traité et transformé
afin
d‘augmenter sa durée de vie, sa valeur nutritionnelle qui lui confère une saveur et une
texture différentes et de
permettre de prolonger le temps de la commercialisation
( Lahsaouis,2009).
La transformation du lait en Djben, Raib , Lben ou autres produits fermentés
traditionnel se fait le plus souvent par fermentation spntanée. Et sur ce principe, il parait que
les produits fermenté et notament le lait fermenté soit utilisé depuis des millénaires (Tahiri,
2007) vu leur intérêt sur la santé humaine car ces produits sont souvent prescrits à des fin
thérapeutiques, par exemple une personne qui ne supporte pas le lait entier frais et encore ils
empêchent des épidémies de maladies couramment transmises par le lait non traité
(FAO,1960).
Le lait est souvent source de nombreux germes pathogènes causant des problèmes
et des inféctions chez l‘Homme et il est difficile de contenir entièrement tous ses agents
pathogènes (Dortu, 2008), des industries agroalimentaires ont choisi un moyen de lutte
traditionnelles tels que le sel ( Huss et al., 2000) . Cependant on a constaté un
rétrécissement pour les additifs chimiques et le sel. Elles se sont basées sur les produits bios
tels que les produits de métabolisme des bactéries lactiques possédant une activité
antimicrobienne (Naghmouchi, 2007).
Les bactéries lactiques sont généralement connues étant saines, de statut "GRAS"
(Generally Recognized As Safe) et ont un rôle dans la fermentation et la conservation des
aliments (Naghmouchi, 2007). On l‘emploie surtout dans de nombreux aliments fermentés
(yaourts, laits fermentés, fromages, etc.) dont le principal but d‘améliorer la qualité
téchnologique, la qualité organoleptique (saveur et texture) et l‘inhibition de la flore
d'altération et les germes pathogènes (O'Sullivan et al.,2002).
Ce processus de conservation et le résultat de l‘activité des bactéries lactiques qui
entrent en compétition pour les nutriments, les changements physico-chimiques du milieu
comme l‘acidification et la synthèse des métabolites antimicrobiens tel que : les acides
1
Introduction
organiques (acide lactique), du peroxydes d‘hydrogènes, du CO2, de l‘acétyle, de
l‘acétaldéhyde et des bactériocines (Ring et Gatesoupe, 1998; O'Sullivan et al., 2002).
En reprenant l‘idée : les bactéries lactiques secrètent des bactériocines, les
chercheurs et les médecins d‘aujourd‘hui ont remarqué la grande différence entre celle-ci et
les antibiotiques (Vescovo et al., 2006).
Jusqu'à maintenant nous avons utilisé les antibiotiques pour nous défendre contre les
maladies d‘origine bactérienne. Cependant une bactéries résistante à un antibiotique d‘une
familles rend généralement les autres antibiotiques inefficaces (Vescovo et al., 2006). Par
observation, on a pu constaté que les bactéries lactiques quand elles se trouvent face à une
autre souche dans un même environnement, elles doivent se battre et résister. Pour cela,
elles secrètent différents peptides antimicrobiens (bactériocines) qui sont employé comme
bio-préservatif (Rodgers, 2001).
Les bactériocines sont reconnues par la FDA (Food and Drug Administration) étant
une substance inodore, sans gout et non toxiques (Rodgers, 2001).
La plupart d‘entre elles sont caractérisées d‘être spécifiques envers les espèces
bactériennes. Et contrairement aux antibiotiques, elles ciblent seulement les bactéries
pathogènes sans toucher celles qui sont bénéfiques pour notre corps ( Naghmouchi, 2007).
Ce travail de recherche se déroule au laboratoire de Microbiologie Appliquée de
l‘Université de Kasdi Merbah – Ouargla- consiste à chercher les substances
antimicrobiennes type bactériocine produites par les bactéries lactiques isolées à partir de
J‘ben préparé à base du lait de chèvre de la région d‘Ouargla .
Dans le présent manuscrit, nous nous sommes basé sur l‘identification des souches
lactiques et la recherche de leur activité antimicrobienne (bactériocine). C‘est la raison pour
laquelle nous avons consacré la majeur partie de la synthèse bibliographique pour la
présentation de cette substance inhibitrice.
Notre démarche pratique est orienté vers l‘utilisation de protocoles simples et
réalisables afin de pouvoir obtenir des résultats nécessaires à l‘identification des bactéries
lactiques ainsi que caractériser la substance inhibitrice sécrété.
2
Chapitre I –
Le Lait et les produits
laitiers fermentés
traditionnels
Synthèse bibliographiques
Le Lait et les produits laitières fermentés traditionnels
Chapitre I : Le Lait et les produits laitiers fermentés traditionnels
I.1. Définition de lait
D‘après (Roudaut et al., 2005) ; le lait est un liquide physiologique sécrété par
femelles des mammifères, véhiculées par le sang et dans le but d‘assurer la croissance
normale des petits
Selon le décret de 25 mars1924 : Article 1 : La dénomination «lait» sans indication
de l‘espèce animale de provenance est réservée au lait de vache. Tout lait provenant d‘une
femelle laitière autre que la vache doit être désigner par la dénomination «lait» (Fanica,
2008).
Enfin, Brule (2003) a indiqué dans son rapport que le lait est un aliment destiné aux
nouveaux- né et aux jeunes mammifères, il leurs couvre les besoin nutritionnels,
énergétiques et physiologique. En renforçant aussi leur système de défense. Et au tant
qu‘une matière première, le lait possède un intérêt technologique et biologique.
I. 2 . Définition du lait fermenté
On désigne par ce terme «lait fermenté » tout produit issus par une fermentation du
lait par le biais des bactéries lactiques, et d‘autres micro-organismes aptes de fermenter le
lait tels que les levures et ils sont différents de fromage par l‘absence de l‘égouttage
(F.A.O., 1996).
Selon (Poillot, 2010), la fermentation du lait provoque de modification au niveau
des composants et encore au niveau de leur qualité organoleptique. Mais aussi elle a affirmé
ce que publiait «Food and agriculture organization» que se ne sont pas de fromage car les
laits fermentés contiennent de l‘eau dans leurs constituants.
D‘après ce qu‘on a indiqué si dessus sur la modification du lait au cours de la
fermentation (Alais , 1984) a bien expliqué le phénomène :
La fermentation est un
processus au cours duquel le lactose est transformé en acide lactique, sous l‘action des
microorganismes indigènes du lait ou ajoutés sous forme de ferment lactique ou levain.
3
Synthèse bibliographiques
Le Lait et les produits laitières fermentés traditionnels
La diversité des laits fermentés nous permette d‘avoir différents types des produits
fermentés et cela se base sur des critères tel que : (FAO., 1995)
 Leur état final : coagulum plus ou moins ferme ; crème plus ou moins visqueuse,
liquide comme ils peuvent avoir un aspect mousseux
 L‘origine du lait ;
 La composition du lait en matière grasse et en matière sèche : écrémé ou enrichi en
matière grasse ;
 Les caractères de la flore lactique.
La valeur du lait fermenté dépend du type de lait adopté dans la fermentation, le
prétraitement, les conditions de fermentation et le traitement ultérieur. La fermentation du
lait implique principalement les bactéries lactiques (LAB) (Zamfir et al., 2006).
Autrefois, l‘idée de transformer les produits laitiers frai en produits fermentés été
dans le seul but de prolonger la durée de conservation du lait. (Cogan, 1996 ; Oberman,
1998). La consommation des produits laitiers est liée aux biens-faits sur la santé et la
nutrition (Takahiro et al., 2007; Shan-na et al., 2011).
I.3. Composition du lait :
I.3.1 Caractère physicochimique du lait
La qualité nutritionnelle du lait sécrété par les mammifère présentent des
caractéristiques communes de point de vue composition : eau, protéines, lactose, matières
grasses (lipides) et minérales en quantité bien évidemment différente
4
Synthèse bibliographiques
Le Lait et les produits laitières fermentés traditionnels
Tableau 1 : Composition chimique moyenne du lait de vache et de chèvre (g/L)
Lactose
Cendres
(MM)
Phosphore
(P)
Caséine
pH*
Acidité*
tétrable
38
50
7,2
1,25
0,95
26
6,68
1,5-1,7
115
34
35
45
8
1,35
1
24
6.70
1,4-1,8
Calcium
(Ca)
Lipides
(MG)
35
Matière
sèche
Vache
132
Chèvre
Matière protéique
(Alves de Oliveira, 2007) et * (http://www.fao.org (2002)
I.4. Microflore du lait et du produit laitier fermenté traditionnel (J’ben)
I.4.1. Microflore du lait
En raison du sa composition physicochimique, le lait est considéré comme un
écosystème idéal pour la prolifération de différents types de microorganismes (Belarbi,
2011).
Une fois traité le lait ne sera pas stérile à cause d‘une contamination par une flore
exogène provient de différentes sources : de la traite, la litière, la qualité de l‘air, comme
elle peut provenir du personnel (Ménard et al., 2004). Au cours de transport du lait et son
stockage, il peut être colonisé par des germes pathogène ou non (Larpent , 1997).
Certains germes peuvent servir à la transformation du lait cru aux différents produits
laitiers (bactéries lactiques, les levures, microcoque et les propioniques) (Branger et al.,
2007).
D‘après Chye et al. (2004) certaines souches représentes la flore indigène du lait cru ;
les genres sont : Lactococcus, Lactobacillus, Streptococcus, et Micrococcus spp.
Richter et al. (1992) ont mentionné que la charge microbienne normale d‘un lait cru
de vache doit normalement être faible (moins de 1000 ml-1), mais cette valeur disent- ils :
(peut augmenter jusqu'à 100 fois ou plus quand le lait est abandonné à température
ambiante). Cependant et pour cette raison Bonfoh et al. (2003) ont décrit dans leur travail
5
Synthèse bibliographiques
Le Lait et les produits laitières fermentés traditionnels
que la conservation immédiat du lait frais au réfrigérateur maintien la charge microbienne
initiale et diminue leurs prolifération.
I.4.2. Microflore du fromage frais (J’ben) :
On détermine la qualité microbiologique du fromage selon la qualité du lait avant la
traite, la méthode suivie pour la fabrication et suivant l‗âge du fromage (Ercolini et al.,
2009).
Les espèces dominantes du J‘ben appartiennent généralement aux bactéries lactiques
qui sont ; L. lactis subsp. lactis, Leuc. mesenteroides subsp. lactis et Lact. casei subsp. casei
(Hamama, 1997).
Hors, d‘après (Benkerroum et Tamime 2004) il existe d‘autres flores en plus des
bactéries lactiques peuvent être présentes selon des charges différentes tel que ; les
dénombrements des levures et moisissures peuvent dépasser 106 UFC.g-1, cette charge élevé
est en relation avec l‘aspect du fromage : l'aspect visqueux, la décoloration et la forte odeur
d'alcool. Par contre elles peuvent être responsables à la saveur du produit.
On y trouve aussi les coliformes et les entérocoques à des nombres dépassant 105
UFC.g-1.
Résumant leurs travaux (Randazzo et ses collaborateurs, 2009), le J‘ben est
dominé par les bactéries lactiques en l‗occurrence les Lactococcus et les Enterococcus qui
influencent les caractéristiques sensorielles du produit fini.
I.5. Produits laitiers traditionnels
Les produits laitiers traditionnels Raib ,L‘ben et J‘ben, provenant du lait de chèvre
sont issues d‘une fermentation spontanée sans addition des substances ou d‘une flore
spécifique (Badis et al., 2004).
I.5.1. Rayeb / Raïb / lait caillé
Le Raïb ou le lait caillé provient du lait cru de vache ou de chèvre. Par des techniques
traditionnelles, l‘obtention de Raïb par une fermentation du lait se fait d‘une façon
spontanée , incontrôlée, à température ambiante , et
à l‘aide des bactéries lactiques
autochtones du lait (Mechai et Kirane, 2008 ; Guizani et al. 2001).
6
Synthèse bibliographiques
Le Lait et les produits laitières fermentés traditionnels
Ils ont ajouté que contrairement au L’ben, le Raïb ne subit pas une opération de
barattage et d‘écrémage, il s‘agit d‘un lait fermenté entier.
La fermentation est réalisée principalement par des bactéries lactiques mésophiles
naturellement présentes dans le lait cru appartenant aux leuconostocs et aux lactocoques.
Maintenant la fermentation est devenue plus rapide en remplaçant ces bactéries mésophiles
par celles qui sont thermophiles -levains- (Guizani et al., 2001 et Benkerroum, 2004)
I.5.2. L’ben traditionnel / Lait fermenté écrémé
Le processus de la préparation de L‘ben qui débute de l‘acidification du lait jusqu‘à sa
coagulation grâce à l‘activité des bactéries lactiques autochtones , en choisissant la voie de
la fermentation lactique elles produisent de l‘acide lactique ce dernier provoque une
coagulation lorsqu‘il est en excès de la caséine du lait. Ensuite le caillé subit une opération
de barattage puis on se débarrasse de la crème formée c‘est la phase de l‘écrémage du
Rayeb (El Baradei et al., 2008 ; Hallel, 2001 ;Tantaoui El Araki et El Marrakchi,
1987 ; Bendanou, 1981).
(Benkerroum et Tamime, 2004). Ont appuyé sur le procédure de la préparation du
L’ben : « le lait subit une pasteurisation à 84°C pendant 30 secondes, puis refroidi à 22°C
et ensemencé de levain lactique (Streptococcus cremoris ; Streptococcus lactis et
Streptococcus diacetylactis ; Leuconostoc dextranicum, Ln. citrovorum et Ln.
mesenteroides)».
I.5. 3. Zebda/ Beurre frais traditionnel
D‘après les normes du Codex Alimentarius, la dénomination de terme –beurre- est
appliqué pour «un produit gras dérivé exclusivement du lait et/ou de produits obtenus à
partir du lait, principalement sous forme d‘une émulsion du type eau dans huile» ( Luquet
et Corrieu, 2005). Il est obtenu à partir de barattage de la crème du lait (Rayeb).
Zebda contient la quasi-totalité des lipides du lait et 2.7 g de protéines pour 100 g
(Vilain, 2010).
Pour avoir le Smen à partir du beurre, on le modifie en beurre rancie. Par le lavage
de beurre frais à l‘eau tiède, saumurage, puis salage à sec (Benkerroum et Tamine, 2004).
7
Synthèse bibliographiques
Le Lait et les produits laitières fermentés traditionnels
I.5.4. Bouhezza
Un autre fromage traditionnel très connu dans les régions de Chaouia à l‘Aurès
(Aissaoui et al., 2012). Produit à base du lait de chèvre, de vache ou de brebis baratté et
écrémé (l‘ben) (Touati, 1990 et Hallal, 2001). C‘est un fromage à pâte épicée, non moulée
( Zaidi et al., 2000).
Il retrouve sa place parmi les fromages à pate molle selon la classification du Codex
alimentarius (Norme FAO/OMS n° A-6 A-6 de 1978).
I.5.5. Klila
La klila est préparée à partir du lben chauffé sur feu doux pendant 12 minutes environ
pour favoriser la séparation du caillé et du lactosérum. Le lait caillé est égoutté dans un tissu
fin (Touati, 1990).
I.5. 6. . Aoules
Il est fabriqué à partir du lait de chèvre qui est extrêmement aigre. Après une
coagulation intense, le fromage obtenu a une pâte dure
L'égouttage se fait dans une paille
ensuite, il est reformé sous forme des boules plates séchées au soleil.(Abdelaziz et Ait kaci,
1992).
I.5.7 Lebaa
La matière première est le colostrum, parfois il est mélangé avec des œufs, il est salé
puis bouillit pendant 15 mn environ. (Lemouchi, 2008).
I.5.8. Méchouna
Il est fabriqué à partir du lait cru qui est chauffé jusqu'à ébullition. Ensuite, on
ajoute de lait fermenté <<lben>> ou <<rayeb>> et du sel. En utilisant une gaze, le mélange
est laissé égoutter.(Lemouchi, 2008).
I.5.9. Madghissa
Le fromage est connu dans la zone du chaouia coté Est du pays. Il est préparé avec la
klila fraîche après salage et incorporation du lait frais. L'ensemble est porté à ébullition sur
feu doux jusqu'à séparation du caillé et de lactosérum. Après refroidissement du mélange, la
marmite est basculée pour éliminer le lactosérum. Le fromage ainsi préparé est une pâte
jaune salée (Aissaoui, 2003)
I.5.10. J’ben / fromage blanc/ fromage frais
La norme FAO/OMS (n°A-6 ,1978 modifiée en 1990) à proposé une définition sur le
fromage et elle les a classifié dans des catégories selon leur consistance : « le fromage est le
8
Synthèse bibliographiques
Le Lait et les produits laitières fermentés traditionnels
produit frais ou affiné, solide ou semi-solide ». Selon cette classification le J‘ben appartient
au fromage à pâte molle, mi- gras et frais.
Le J‘ben est un fromage frais traditionnel obtenu par coagulation enzymatique
(présure) (Abdelaziz et Ait Kaci, 1992).
Benkerroum et Tamine (2004), ont affirmé qu‘on peut fabriquer le J‘ben sans
enzymes coagulantes en pratiquant la fermentation spontanée puis le caillé est égoutté
pendant 2 à 3 jours pour obtenir la consistance désirée.
Tableau 2 : La composition physico-chimique de J’ben . (Thomas et Dubeuf, 1995)
pH
4,2.
acidité titrable
1.04 %,
MG
16,5 %,
Protéines
15,8 %
I.5.11. Autres types des produits laitiers fermentés
(Chapman et Hall, 1997) on additionné d‘autres principales catégories des produits
laitiers fermentés comme : babeurre fermenté, Zabadi, labneh, Kefir et koumiss.
9
Synthèse bibliographiques
Le Lait et les produits laitières fermentés traditionnels
Figure 1 : différents produits du lait fermenté (université de Batna, Depat : Agro.)
10
Chapitre II –
Bactéries lactiques du lait
Synthèse bibliographiques
Bactéries lactiques du lait
Chapitre II : Bactéries lactiques du lait
I1. Les bactéries lactiques
II.1. Caractéristiques générales
Les bactéries lactiques sont des micro-organismes , procaryotes, gram-positives,
catalase négative, oxydase négative, anaérobies facultatives, micro aérophiles, hétérotrophes
et chimio-organotrophes. Elles sont le plus souvent immobiles, jamais sporulées, (Tailliez,
2001). Elles ont la capacité de fermenter les glucides en l‘acide lactique (D(-), L(+) ou
(DL) en choisissant voies cataboliques d‘Embden Meyerhof Parnas (EMP) et d‘Entner
Doudoroff.
Les groupes des bactéries lactiques renferment un ensemble d‘espèces hétérogènes
dont la fonction commune est la production d‘acide lactique. On trouve les Bifidobacterium,
Enterococcus, Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc, Pediococcus, Streptococcus,
Aerococcus, Alloiococcus, Vagococcus, Tetragenococcus et Carnobacterium.
II.1.1. Bacillus Bifidus ou Bifidobacterium
C‘est le genre le plus connu et le mieux étudié dans l‘ordre des bifidobacteriales.
Les Bifidobacterium se sont des bâtonnets, Gram positives, asporulées, immobiles, ont des
formes variées( incurvées, rarement ramifiées) celles de formes bâtonnets peuvent
généralement être isolées ou en amas et en paires ou en forme de V (Lansing et al.,2003).
Les Bifidobacterium sont anaérobies (Lansing et al.
2003), saccharolytiques
(Scardovi, V., 1986) ,fermentent les glucides en donnant de l‘acide acétique et l‘acide
lactique sans production de dioxyde de carbone ( Lansing et al. 2003). Pas de production
d'ammoniaque ou de H2S à partir des acides aminés et elles ne réduisent pas les nitrites
nitrates.
Le métabolisme des hydrates de carbone par des bifidobactéries est différente de bactéries
homofermentaires et hétérofermentaires. En effet, le fructose-6-phosphocétolase, une
enzyme typique du genre Bifidobacterium, est responsable de la dégradation du glucose. La
détermination de cette enzyme est un test crucial pour l'identification de ces microorganismes (Shah , 2000).
10
Synthèse bibliographiques
Bactéries lactiques du lait
II.1.2. Enterococcus
Les entérocoques sont des bactéries anaérobies à gram positif qui se présentent sous
forme de coques en courtes chaînes mentionnent (Hancock et Gilmore, 2000).
Tableau 3 : décris leurs caractéristiques physicochimiques (Hancock et Gilmore , 2000).
T°C de croissance
pH
NaCl
10 °et 45°C
9,6
6,5 %
Tolérance au bile
40 %
Hydrolyse
Esculine
Elles se différencient des autres cocci à Gram positif par la composition de leur paroi,
caractères morphologiques, leurs bagages enzymatiques, antigéniques et leur capacité de se
développer dans des milieux extrêmes.
Hors selon Giraffa, (2003) les entérocoques ont été considérées comme un indicateur de
mauvaises conditions sanitaires lors de la production et la transformation du lait.
Par contre d‘autre chercheurs suggèrent ce genre de bactérie peuvent avoir des bénéfices
dans certains fromages, grâce à leurs activités protéolytiques et lipolytiques. En plus de la
production des substances inhibitrices anti- Listeria (enterocins) (Ennahar et Deschamps,
2000).
II.1.3 Lactobacillus
C‘est le genre le plus étudié dans les bactéries lactiques. Comme indique leur noms
les lactobacilles sont des bâtonnets ou des coccobacilles, asporulés, sont des bactéries
anaérobies facultatives ou parfois microaérophiles, elles fermentent le sucre donnant de
l‘acide lactique comme seul produit de fermentation. Les Lactobacillus sont très exigeantes
en matière nutritive (Euze'by, 1997).
II.1.4. Lactococcus
De forme de coque, se présentent en chainette, thermosensibles, homofermentaires
produisant que de l‘acide lacique L(+) (Dellaglio et al, 1994).
Elles se caractérisent par la production de diacétyle à partir du citrate (citrate+),
certaines espèces utilisent l‘arginine ( ARG+) (Guiraud, 2003)
.Selon Teuber et al,( 1992) trois espèces importantes utilisées pour la production de
fromage et/ ou les produits laitiers fermentés : Lactococcus lactis ssp. Lactis, Lactococcus
lactis ssp. cremoris et Lactococcus lactis ssp .lactis biovar diacetylactis
11
Synthèse bibliographiques
Bactéries lactiques du lait
II.1.5. Leuconostoc, Oenococcus et Weissella
Appartient à la famille des leuconostocaceae, Gram positif, ont une forme cocci mais
elles peuvent être allongés, associé en paire ou en chaines , non sporulées (Bergey et al.,
2009) Catalase négatif, anaérobie facultatives , réalisent la fermentation hétérolactique en
produisant à partir du glucose de l‘acide lactique et éthanol ou en acide acétique par la voie
de la transcétolase. elles tolèrent des concentrations élevées de sucre. (Bergey et al.,2009).
Les Leuconostoc sont des bactéries lactiques mésophiles ( Savadogo et al., 2011),
ils ont mentionné aussi que présence de Leuconostoc stimule également la croissance des
Lactococcus.
Les espèces du genre Weissella sont constituées de courts bacilles ou de
coccobacilles ou des coques ovoïdes, à Gram positif, catalase négative se présentant de
manière isolée ou groupés par deux ou en courtes chaînes, non sporulés et immobiles
(Walter et al., 2001).
II.1.6.Pediococcus et Tetragenococcus
Des bactéries lactiques, de forme de coque, catalase négatif, aérobie facultative.
Fermentent le glucose en acide lactique sans production de gaz. Elles croissent dans un pH
5 (Bergey et al., 2009).
II.1.7.Streptococcus
Sont des Gram positif, cocci non mobiles, appartenant à la famille des
Streptococcaceae, anaérobies ou aérotolérantes sporulées, quelques espèces sont capsulées.
Streptococcus thermophilus étant connue comme une espèce type, une bactérie
alimentaire (Delorme et al., 2010). Les Streptococcus thermophilus sont des bactéries
lactiques à grande importance dans les industries laitières précisément dans la fabrication de
yaourt et du fromage en collaboration avec d‘autres espèces des bactéries lactiques :
Lactococcus lactis, Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus (Hols et al., 2005).
Elles sont chimio-organotrophes à métabolisme fermentatif produisant de lactate
mais sans gaz, catalase négative, et la température de leur croissance se situe entre 25-45ºC
avec une température optimale de 37ºC (Bergey et al, 2009).
12
Synthèse bibliographiques
Bactéries lactiques du lait
II.1.8. Aerococcus
Des bactéries à Gram positif, des coques isolées ou en paires ou arrangées en amas,
microaérophile mais généralement anaérobies facultatives, catalase négative, asporulées
(Ruoff, 2007). pH de croissance 9 , la tolérance en NaCl 18%
II.1.9. Alloiococcus
Des cellules ovoïdes, Gram positif, non-mobiles, asporulées, vivent en paire ou en
tétrade. Se croissent en ralentis à un NaCl 6,5% mais pas 10%. Et ne préfèrent pas la T10°
C ni 45°C. sont aérobies, catalase - /+, oxydase négative, ne produisent de gaz, l‘acide n‘est
pas produit à partir de la fermentation de glucose (Collins et al. ,1987).
II.1.10. Carnobacterium
Des cellules en forme de courts bâtonnets, isolés ou en paire, parfois en courtes
chaînes, mobiles ou non. Ces bactéries sont catalase, oxydase et nitrate réductase négatives.
La température optimale de croissance des Carnobacterium varie de 23 à 30°C, elles
peuvent se multiplier à des températures proches de 0°C et sont inhibées à partir de 45°C.
Ce sont donc des bactéries psychrotrophes. Leur pH optimum de croissance varie selon les
espèces de 6,0 à 7,4 (Collins et al., 1987).
Elles sont anaérobie aéro-tolérant. La plupart des espèces sont inhibées à partir de 7%
de NaCl. En présence de sucre, leur métabolisme n‘est que très faiblement
hétérofermentaire, avec une large production d‘acide lactique L(+) . Contrairement aux
Lactobacillus, les Carnobacterium sont peu acidifiants (Collins et al., 1987).
13
Chapitre IIILes substances
antimicrobiennes
Synthèse bibliographiques
Les substances antimicrobiennes
Chapitre III : Les substances antimicrobiennes
III. Composés antibactériens produits par les bactéries lactiques
Les bactéries lactiques produisent des métabolites aux propriétés antimicrobiennes
comme les acides organiques, le peroxyde d‘hydrogène, le dioxyde de carbone, la reutérine,
le diacétyl , les bactériocines et certainement d‘autre substances (Dortu et Thonart, 2009).
Les composés antimicrobiens des BL peuvent empêcher la croissance des
bactéries
pathogènes;
contaminants possibles des produits fermentés (Smith et
Palumbo, 1983;Andersson, 1986; Adams et Hall, 1988; Berry et al., 1991; Cintas et al.,
1998; Gill et Halley, 2003 et Guessas et al., 2006).
Les mécanismes antimicrobiens particuliers des bactéries lactiques exploitées dans la
bio préservation des aliments (De vuyst et Vandamme, 1994 b; Stiles, 1996; Jacobsen
et al., 2003 et Vermeiren et al., 2004).
III.1. Acides organiques
La production d‘acides organiques cause une acidification du milieu qui peut
limiter la croissance de certaines bactéries indésirable de ce fait une longue expositions dans
un milieu acide peuvent entraîner la mort de plusieurs bactéries (Champagne et al.,1992) ;
kostinek et al.,2005).
La forme moléculaire non dissociée des acides est le facteur le plus toxique pour les
bactéries (Hermier et al., 1997).
En abaissant le pH du milieu, l‘acide lactique permet aussi d‘augmenter l‘effet
toxique de l‘acide acétique (produit par voie hétérofermentaire) envers L. monocytogenes
(Holzapfel et al., 1995). L‘acide lactique et l‘acide acétique pénètrent
passivement la
membrane cytoplasmique, des fortes concentrations d‘acides, le milieu intracellulaire peut
s‘acidifier et les fonctions cellulaires sont inhibées et le potentiel membranaire est annulé
(Ammor et al., 2007).
14
Synthèse bibliographiques
Les substances antimicrobiennes
III.2 .Peroxyde d’hydrogène
Dans les conditions d‘aérobiose, la plupart des bactéries lactiques, les molécules de
NAD réagissent avec l‘oxygène pour former du peroxyde d‘hydrogène (H2O2)
(Desmazeaud,1996).
Les bactéries lactiques sont capables de convertir l‘oxygène moléculaire (O2) en
super oxyde excité (O2), en peroxyde (H2O2) ou en eau (H2O). Ces réactions sont
catalysées par des enzymes spécifiques en présence d‘un substrat à oxyder. Ces enzymes
ont été trouvées chez des souches de Streptococcus Lactococcus, Lactobacillus,
Leuconostoc et Pediococcus (Condon,1987). Ce composé bloque le fonctionnement de
certaines enzymes-clés intervenant dans la glycolyse résultant l' inhibition de la croissance
des microorganismes (Desmazeaud, 1996) ainsi la peroxydation des lipides de membrane;
de ce fait provoque l'accroissement de la perméabilité membranaire (Kong et Davison,
1980).
III.3. Acides gras
Les acides gras insaturés possèdent une activité contre les bactéries à Gram+, son
activité antifongique dépend de la composition, de la concentration, et du pH du
milieu (Gould, 1991).
Quelques
lactobacilles et
lactocoques
possédant
des
activités
lipolytiques
peuvent produire des quantités significatives d'acides gras, dans la fermentation du lait
fermenté
(Rao et al., 1984)
III.4. Dioxyde de carbone (CO2)
Il Crée un milieu anaérobique, qui empêche les décarboxylations enzymatiques,
l'accumulation
de CO2
peut causer un dysfonctionnement de la perméabilité , il est
principalement produit par les BL hétéro fermentaires (Eklund, 1984).
III.5. Acétaldéhyde
L'acétaldéhyde empêche la croissance de
Staphylococcus aureus, de Salmonella
typhimurium et d‘E. Coli à une concentration de 10 à 100 ppm dans les produits laitiers
(Piard et Desmazeaud, 1991.)
15
Synthèse bibliographiques
Les substances antimicrobiennes
La contribution de l'acétaldéhyde à la bio préservation est mineure car le seuil de
saveur est
beaucoup moindre aux niveaux qui
sont nécessaires
à
l'inhibition
des
microorganismes (Kulshrestha et Marth, 1974).
III.6. Di acétyle (2,3- butanédione)
Beaucoup de bactéries lactiques comprenant des souches de Leuconostoc, de
Lactococcus, de Pediococcus et de Lactobacillus peuvent produire le diacétyle (Cogan,
1996).
En 1927, Lemoigne décrit l‘effet antimicrobien de Diacétyle contre les Bacillus
sp.Son utilisation pratique comme conservateur est limitée.
III. 7.Reutérine
La reutérine posséder
un large spectre d'activité antimicrobienne contre
certaines bactéries à Gram+ et à Gram-. Les microorganismes de détérioration
sensibles à la reutérine sont
Salmonella, Shigella, Clostridium, Staphylococcus,
Listeria, Candida, et Trypanosoma, il est produite par Lactobacilles reuteri (Axelsson et
al., 1989)
III. 8. Reutéricycline
Certaines
souches
de
Lactobacillus
reuteri
secrètent
d‘autres
substances
antimicrobiennes, reutericycline. On a remarqué que la concentration d‘inhibition minimale
de cette molécule est de 0.05-1 mg/L pour les bactéries à gram positives. Tandis qu‘on n‘a
pas trouvé aucune sensibilité des bactéries à gram négative et les champignons à la
reutéricycline ( Ouwehand et al., 1996) .
III. 9. 2-pyrrolidone-5-carboxylic Acide
Ou PCA cette molécule est surtout produite par Lactobacillus casei ssp.casei , L.casei
ssp. Pseudoplantarum et Streptococcus bovis. elle est présente aussi dans les fruits, les
légumes. Elle inhibe les Bcillus subtilis, Enterobacter cloacae, Pseudomonas putida et
Pseudomonas fluorescens. Elle est stable à la grande température (121°C/20min) mais elle
perd son activité inhibitrice quand le pH est de 2,5. PCA est reconnu comme un fort agent
antimicrobien comme l‘acide lactique. Et son mécanisme d‘acti on est le même que les acides
organiques ( Ouwehand et al.,1996 ).
16
Synthèse bibliographiques
Les substances antimicrobiennes
III.10. Bactériocine
III. 10. 1. Définition des bactériocines
Les bactériocines sont des composées protéiques ribosomiques ou peptidiques
synthétisées par des genres bactériens ayant des actions antimicrobiennes (Bayoub et al.,
2006). le plus souvent elles sont cationiques, d‘une masse moléculaire comprises entre 2 et 6
kDa (Heng et al., 2007).
Possédant une activité bactéricide (De Vuyst and Vandamme, 1994), leur activité est
dirigée contre les bactéries des espèces proches de celle qui l‘a sécrété sans se faire du mal
(Bayoub et al., 2006), Cependant (Mami et al., 2008) ont affirmé qu‘il existe certaines
bactériocines ont un effet contre les bactéries à Gram négatif.
Dés leur synthèse, elles sont sécrétées dans le milieu extracellulaire, transportées par
un système de transfert (Gálvez et al., 2007; Riley et Chavan, 2007; Khalil et al., 2009 ).
Généralement ces substances sont produites par de bactéries à Gram positif, elles sont
caractérisées par un faible poids moléculaire mais également on observe quelques bactéries à
Gram négatives ont la capacité d‘avoir une activité bactériocinique (Chatterjee et al., 2005).
III. 10. 2. Bactériocines des bactéries lactiques
Ces peptides antimicrobiens synthétisés par les bactéries lactiques sont caractérisés
par un faible poids moléculaire. Elles ont une action bactéricide ou bactériostatique dirigées
envers les souches proches de la souche productrice. Leur spectre d‘activité est souvent étroit
(Dortu et Thonart 2008). sont généralement actives à faible concentration (Belguesmia et
al., 2011, Cotter et al., 2005).
(Dortu et Thonart 2008) ont éclairci que : Toutes les bactériocines produites par
des bactéries lactiques trouvées jusqu‘à présent ont une activité dirigée contre les bactéries
Gram positives . Aucune bactériocine produite par des bactéries lactiques ont une activité
contre des bactéries Gram négatives n‘a été décrite, car la membrane externe des bactéries
Gram négatives ne permettant pas aux bactériocines d‘atteindre la membrane interne, siège
de leur activité.
17
Synthèse bibliographiques
Les substances antimicrobiennes
Cependant, certaines bactériocines possèdent une activité antimicrobienne plus
vaste qui peut même s‘étendre jusqu‘au protozoaire, la levure, le champignon et le virus
(Sass et al., 2008).
Caractéristiques des bactériocines des bactéries lactiques
 Stable à la chaleur ;
 Stable à l‘acidité ;
 Résistante aux protéases qui se trouvent dans l‘aliment ;
 Active pendant une période prolongée ;
 En activité au pH de l‘alimentation (4,5 ; 7) ;
 Avoir un effet bactéricide que bactériostatique ;
Un large d‘éventail d‘hôte, en inhibant plusieurs agents pathogènes et nuisibles selon ( Fox et
al.,2000).
III.10.3. Découverte de la bactériocine
Dans un premier temps, ce terme est défini comme une molécule protéique de type
colicine, caractérisé par un effet létale (Frédériq, 1948).
La découverte des bactériocines remonte à 1925 quand Gratia observait l'inhibition de
E. coli F par E. coli V. Ce type d'agents antibactériens chez E. coli est, par la suite, nommé
colicine (Frédériq, 1948). Par ailleurs, le groupe des bactéries lactiques a montré une grande
aptitude à produire des substances semblables à ces colicines. (Jacob et al. 1953) donnèrent
le terme de bactériocine à cette classe d'antagonistes. La bactériocine la plus connue (nisine),
produite par une souche de Lactococcus lactis fut décrite par (Rogers 1928). Depuis la nisine
a été autorisée comme additif alimentaire par EEC (1983).
III.10.4. Classification des bactériocines des bactéries lactiques
Selon Klaenhammer et al., (1993) ont suggéré une classification des bactériocines en
se basant sur leur structure tridimensionnelle, leur mode d‘export, leur poids moléculaire et
leur stabilité à la chaleur (De Vuyst et Vandamme, 1994) et leur mécanisme d‘action.
Notant que ces substances antagonistes diffèrent entre elles par leur structure primaire.
Ils ont proposé deux classes principales de bactériocines, la première classe
rassemblant les bactériocines modifiées post-traductionnellement- les lantibiotiques- la
18
Synthèse bibliographiques
Les substances antimicrobiennes
deuxième classe renfermant les bactériocines non modifiées et thermo-résistantes appelées «
pediocin-like ».
Par la suite le classe II a subi une subdivision en deux nouvelles classes ce qui à
former une troisième catégorie (la classe III) qui renferme les bactériolysines des protéines
thermosensibles pourvues d‘activité enzymatique (Klaenhammer, 1988).
Ainsi (Heng et al., 2007) ont rajouté une quatrième classe regroupant des complexes
protéiques liés à une partie lipidique ou glucidique. Bien que cette classe ne soit pas
clairement considérée étant une des classes des bactériocines.
III.10.4.1. Classe 1 ( lantibiotiques) :
Sont des petites bactériocines, trouvées chez de nombreuses autres bactéries à Gram
positif autre que les BL. synthétisés par voie ribosomique et subissant des modifications
post-traductionnelles. Ce sont des petites molécules (entre 19 et 37 acides aminées) inferieur
à 5KDa thermostables( Cenatiempo et al.,2000 ) . Dans cette classe on retrouve la nisine A
et Z produites par Lactococcus lactis, ( De Vuyst et Vandamme, 1994) la lacticine 481, la
lactocine S et la carnocine U 149.
Figure 2 : Séquence et structure de lantibiotiques de type A (Nisine), B (Mersacidine) et d‘un
lantibiotique « two-peptides » (Lacticine 3147 A1 et A2) — Sequence and structure of a type
A lantibiotic (Nisin), a type B lantibiotic (Mersacidin) and a « two-peptides » lantibiotic
(Lacticin 3147 A1 and A2) (Nigutova et al., 2007)
19
Synthèse bibliographiques
Les substances antimicrobiennes
III.10.4.2. Classe II (Bactériocines non modifiées)
La classe II rassemble un groupe hétérogène de peptides de masses moléculaires < 10
kDa., ce sont des peptides non modifiés post-traductionnellement. Cependant elles sont
généralement synthétisées sous forme d‘un prépeptide qui sera maturé lors de son excrétion
dans le milieu extracellulaire (Fimland et al., 2000).
La classe II peut être subdivisée en trois sous-classes :
Les bactériocines de la sous-classe IIa , possèdent entre 27 et 48 acides aminés et ont
toutes une partie N-terminale hydrophobe contenant la séquence consensus YGNGV ainsi
qu‘un pont disulfure et une partie C-terminale moins conservée, hydrophobe ou amphiphile
qui détermine la spécificité d‘action supposent(Fimland et al., 2000 ; Richard et al., 2006).
Elles ciblent les Listeria monocytogenes.
La sous-classe IIb comprend les bactériocines ayant besoin de deux peptides pour
avoir une activité. Deux types de bactériocines de classe IIb peuvent être distingués : le type
E (Enhancing) où la fonction d‘un des deux peptides est d‘augmenter l‘activité de l‘autre et
le type S (Synergy) où les deux peptides sont complémentaires(Fimland et al., 2000 ;
Richard et al., 2006).
La sous-classe IIc contient les bactériocines ne pouvant pas être classées dans les
autres sous-classes (Fimland et al., 2000 ; Richard et al., 2006).
Figure 3 : Structures tridimensionnelles de quelques bactériocines de classe IIa.
III.10.4.3. Classe III ( les bactériocines à haute poids moléculaire (de taille ˃à 10 kDa).
20
Synthèse bibliographiques
Les substances antimicrobiennes
Elles sont sensibles à la chaleur (inactivées entre 10 à 15 min. à 60- 100°C) (Jorger
et Klaenhammer, 1986) ont supposé que la bactériocine - l'helvéticine J- produite par
Lactobacilllus helveticus a été très étudiée par les chercheurs ce qui a donné comme résultat
que cette catégorie est peu représentée chez les bactéries lactiques.
Tableau 4 : Bactériocines de classe III produites par des bactéries lactiques.(Nilsen et al.,
2003 ; Papagianni, 2003 ; Nigutova et al., 2007).
Bactériocine
Bactérie productrice
Helveticin J
Lactobacillus helveticus A
Enterolysin A
Enterococcus faecium
Zoocin A
Spreptococcus zooepidemicus
Millericin B
Streptococcus milleri
III.10.4.4.Classe IV
Peptides possèdent une partie carbohydratée ou lipidique pour avoir une activité.
Aucune bactériocine de cette classe n‘a été décrite (Dortu et Thonart, 2009).
III.10.5. Biosynthèse des bactériocines et sa régulation
Au début, les bactériocines sont synthétisées sous forme d‘un prépetide nonbiologiquement actif qui subira par la suite des modifications post-traductionnelles dans le
but d‘atteindre au peptide actif (Dortu et Thonart, 2009).
Cette production ajoutent (Dortu et Thonart, 2009) est souvent régulée par un
système de Quorum Sensing, un mécanisme permettant à certains gènes d‘être exprimés en
fonction de la densité de la population bactérienne.
III.10.5. 1. Lantibiotiques
En choisissant l‘exemple type de cette classe : la nisine afin d‘éclaircir le mécanisme
de production des lantibiotiques.
On désigne par le symbole commun Lan les gènes
responsables de la biosynthèse des Lantibiotiques avec un nom plus spécifique pour chaque
lantibiotique (nis pour la nisine) (McAuliffe et al., 2001 ; Kleerebezem, 2004 ; Xie et al.,
2004 ; Patton et al., 2005).
21
Synthèse bibliographiques
Les substances antimicrobiennes
Le gène de structure, LanA, code pour un prépeptide contenant une séquence N
Terminale de 23 à 30 acides aminés qui sera clivée lors du transport à l‘extérieur de la
cellule. Ce prépeptide subira différentes modifications post-traductionnelles pour aboutir les
quatres acides aminés inhabituels (McAuliffe et al., 2001 ; Kleerebezem, 2004 ; Xie et al.,
2004 ; Patton et al., 2005).
 La première étape : déshydratation de la sérine et de la thréonine pour donner la
déhydroalanine et la déhydrobutyrine. Les gènes responsables de ce phénomène sont
(LanB -déshydratase-) ;
 La deuxième étape : la formation d‘un lien thioéther entre ces résidus déshydratés et
les cystéines environnantes, donnant aux lantibiotiques une structure cyclique.
Gènes (LanC ou LanM)-cyclase-.
 Lors du l‘excrétion à l‘extérieur de la cellule, le prépeptide formé va subir un
clivage par le biais de la protéase LanP ou le domaine protéasique de l‘ABC
transporteur LanT. C‘est la dernière étape, on obtient une molécule biologiquement
active (McAuliffe et al., 2001 ; Kleerebezem, 2004 ; Xie et al., 2004 ; Patton et
al., 2005).
Pour qu‘elles puissent se protéger contre sa propre bactériocine les bactéries lactiques
actives des gènes LanI, LanF, LanE et LanG ce sont des protéines impliquées l‘immunité de
la souche. Malgré le mécanisme n‘est pas bien claire jusqu‘à maintenant, il semble que LanI
est une lipoprotéine qui s‘attache à la surface externe de la membrane et interagit avec le
lantibiotique afin de l‘empêcher d‘y former des pores. LanF, LanE et LanG forment un ABC
transporteur. Il permettrait d‘exporter à l‘extérieur de la membrane cytoplasmique les
lantibiotiques qui n‘auraient pas interagi avec la lipoprotéine LanI et qui s‘y trouveraient,
l‘empêchant ainsi de former des pores (McAuliffe et al., 2002; Stein et al., 2003 ; Lubelski
et al., 2008).
III.10.5. 2. Classe II : Bactériocines non modifiées
Notant que les bactériocines de cette classe ne subissent guère des modifications
post- traductionnelle. Néanmoins elles utilisent les mêmes gènes de ceux des lantibiotiques.
certaines bactéries de cette classe font appelle à un autre système de sécrétion qui est le " secdepedent pathways " basé sur la translocation du peptide par un pore aqueux formé par
plusieurs protéines (Drider et al., 2006).
22
Synthèse bibliographiques
Les substances antimicrobiennes
D‘après (Ennahar et al., 2000) ce type de substances peptidiques sont synthétisées
sous la forme non avtive ( prépeptide) avec une
séquence N-terminal très conservée
(séquence signal) sera clivée du côté C-terminal d‘un motif GG par un domaine protéasique
de l‘ABC transporteur lors de l‘excrétion pour donner une bactériocine biologiquement
active, avec la formation ou deux ponts disulfures (Drider et al., 2006).
Les gènes codant pour la production de ces bactériocines sont pour la plupart du
temps, structurées en trois opérons, le premier contenant les gènes de structure et d‘immunité,
le deuxième les gènes nécessaires à la sécrétion de la bactériocine (l‘ABC transporteur et une
protéine accessoire) et le troisième les gènes du système de régulation à trois composantes
(Diep et al., 2007).
Le gène d‘immunité code pour une protéine intracellulaire qui, en interagissant avec
le complexe membranaire formé par la bactériocine et la « mannose perméase », l‘empêche
de former des pores dans la membrane de la cellule productrice (Diep et al., 2007).
Figure 4: Schéma de la biosynthèse, la régulation de la biosynthèse et l‘immunité
desbactériocines de classe IIa.( Fregeau et al., 1997)
III.10.6. Mode d’action des bactériocines des bactéries lactiques
23
Synthèse bibliographiques
Les substances antimicrobiennes
D‘après les études, les chercheurs ont supposé que toutes les bactériocines des
bactéries lactiques, ont le mode d'action , paraissent agir de façon similaire en formant des
pores dans la membrane plasmique des cellules cibles (Cenatiempo et al.,2000), cependant,
les mécanismes d‘action des bactériocines sur la membranes sont variés.
Les lantibiotiques, agissent avec la membrane cellulaire par des interactions
électrostatiques ou par liaison à des récepteurs spécifiques tels que le lipide II ( un précurseur
de peptidoglycanes. Une foi la liaison est établi, ces composées inhibitrices peuvent former
des pores assez large et non spécifiques dans la membrane cytoplasmique, ce qui va entrainer
un efflux rapide des petits composés cytoplasmiques tels que les ions, les acides aminés,
l‘ATP,…etc. Cette augmentation de la perméabilité membranaire va conduire à un arrêt
rapide des activités cellulaires et à la mort de la cellule (Luquet et Corrieu, 2005).
Selon (Bauer et al., 2005 ; Patton et al., 2005) la stabilité des pores formées va
inhiber la synthèse de la paroi cellulaire ou inactiver l‘enzyme responsable à la biosynthèse
de la paroi bactérienne (Chatterjee et al., 2005, Twomey et al., 2002).
Contrairement aux bactéries à Gram positif, le peptidoglycane chez les bactéries à
Gram négatif est plus fin et enchâssé entre deux membranes plasmiques : la membrane
externe composée de phospholipides, de nombreuses protéines intrinsèques, notamment les
protéines de transport appelées porines, ainsi qu‘un composé non protéique appelé
lipopolysaccharide (LPS). Les bactéries à Gram négatif telles que Escherichia coli (E. coli),
Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa), Salmonella typhimurium et Serratia marcescens
sont résistantes aux lantibiotiques et en particulier à la nisine (Chung et al., 1989, Linnett et
Strominger, 1973). Cette résistance a été attribuée à la membrane externe riche en LPS qui
empêche les bactériocines d‘accéder au lipide II présent dans la membrane cytoplasmique
(Chatterjee et al., 2005).
24
Synthèse bibliographiques
Les substances antimicrobiennes
Figure 5.: Formation de pores membranaires par le complexe nisine-lipide II
(Chatterjee et al., 2005).
Les bactériocines de classe II
Se base sur l‘interaction de la bactériocine avec la membrane ou un récepteur
spécifique, la « mannose perméase », pour former un pore dans la membrane de la bactérie
cible ce qui résulte une perméabilité de cette dernière et par la suite la mort de la cellule
(Héchard et al., 2001 ; Gravesen et al., 2002 ; Arous et al., 2004 ; Bauer et al., 2005).
25
Synthèse bibliographiques
Les substances antimicrobiennes
Figure 6 Mode d‘action utilisé par les bactériocines de classe IIa et par les lactococcines A
et B (classe IId) d’après (Diep et al., 2007).
Les bactériocines de Class III
Ils se diffèrent totalement des autres bactériocines. En effet, l‘entérolysine A, la
zoocine A et la milléricine B agissent par l‘hydrolyse des liens peptidiques des
peptidoglycanes des cellules sensibles (Dortu et Thonart, 2009).
Tableau 5 : Les principales bactériocines produites par certaines espèces de
bactéries lactiques (Dortu et Thonart, 2009).
Dénomination
Espèce productrice
Espèces sensibles
Nisine
Lactococcus
lactis
lactis
subsp.
Lactococcus, bactéries Gram positif
(dont Clostridium, Bacillus, Listeria)
Lacticine 481
Lactococcus
lactis
lactis
subsp.
Lactococcus, Lactobacillus
Diplococcine
Lactococcus
cremoris
lactis
subsp.
Leuconostoc, Clostridium
Lactocoques
Lactostrepcine (S)
Lactococcus
lactis
lactis
subsp.
Lactocidine
Lactocine 27
Lactococcus fermentum
Lactobacillus helveticus
Helveticine
Lactobacillus helveticus
Lactacine B
Lactobacillus acidophilus N2
Lactacine F
Lactobacillus acidophilus SS
Plantaricine A
Lactobacillus plantarum
Lactococcus,
Streptocoques
hémolytiques, Lactobacillus helveticus,
Leuconostoc, Clostridium, Listeria
Lactobacillus
Lactobacillus helveticus
Lactobacillus acidophilus
Lactobacillus helveticus, Lactobacillus
bulgaricus, Lactobacillus lactis
Lactobacillus leichmanii Lactobacillus
bulgaricus,
Lactobacillus
lactis,
Lactobacillus helveticus
Id+
Lactobacillus
fermentum+
Enterococcus faecalis
Lactobacillus plantarum
Pediococcus pentosaceus, Leuconostoc
paramesenteroides
Tableau 6 : Spectre d‘action des bactériocines des bactéries lactiques
26
Synthèse bibliographiques
Les substances antimicrobiennes
bactériocine
Spectre d’action
Références
Classe I
Cible les bactéries pathogènes
Cenatiempo et al .,1996
lantibiotique
mais aussi les bactéries lactiques
elles-même.
Classe II
Distingue des autres classes par
(Drider et al., 2006)
leur spectre étroit limité aux
bactéries
à
Gram
Spécifiquement
positive.
possède
une
activité anti-Listeria
Classe III
Zoocine A a un spectre d‘action
(Nilsen et al., 2003)
étroit
Entérolysine
A et Milléricine B
ont un spectre d‘action large.
Helvéticine J a un mode d‘action
bactéricide.
111.10.7. Application biotechnologique des bactériocines des bactéries lactiques
III.10.7. 1. Dans le secteur alimentaire
Maintenant les bactériocines deviennent beaucoup utilisées dans ce secteur,
considérées étant un moyen de préservation complémentaire (Deegan et al., 2006).
Elles ont été appliqué sous plusieurs états (purifiée, semi-purifiée ou soue la forme
concentrée). Aussi on peut utiliser les souches bactériennes productrices de cette
substance et dans ce cas là c‘est la production des bactériocines in situ ajouta (Deegan et
al., 2006). D‘après (Guinane et al., 2005), on additionne les bactériocines purifiées ou
semi purifiées dans un aliment comme des additifs alimentaires. Seule la nisine est
autorisée à l‘utilisation comme additif alimentaire (E234).
Sous la forme concentrée les bactériocines peuvent être appliquées après être récolté
d‘une souche productrice.
27
Synthèse bibliographiques
Les substances antimicrobiennes
Les Entérococcus faecalis par exemple synthétisent une bactériocine (RuizMoyano et al., 2008) et elles ont été utilisé en tant que probiotiques.
Parmi les applications des bactériocines de bactéries lactiques, on peut citer l‘utilisation de
ferments producteurs de bactériocines dans l‘industrie laitière (Cleveland et al, 2001).
La fixation des bactériocines sur des polymères pour l‘emballage d‘aliments pourrait
aussi être un mode de conservation des aliments (Sebti et al, 2002).
III.10.7. 2. Dans le secteur médical
La nisine est utilisée dans la prévention et le traitement d‘ulcère causé par
Helicobacter pylori (Blackburn et Projan, 1994) elle est aussi appliquée comme agent
thérapeutique des mastites bovines et comme agent prophylactique.
La nisine est récemment utilisée en solution buccale dans le but de protéger les dents
contre la plaque dentaires les inflammations gingivales chez le chien (Howell et al, 1993).
On peut donc fabriquer une pâte dentifrice à base de cette bactériocine ou un rince-bouche
qui détruisent les bactéries associées à la mauvaise haleine.
Plusieurs essais cliniques sont en cours afin de rendre ces produits disponibles.
Cependant, les bactériocines possèdent une courte vie chez l‘humain (Tagg., 2004).
28
Partie expérimentale
Matériel et méthodes
Partie expérimentale
Résultats et discussion
Matériel et méthodes
Objectifs de la recherche
Notre étude se base sur trois objectifs principaux :
 Isolement et identification des souches lactiques à partir du produit laitier fermenté
traditionnel (J‘ben) préparé à base du lait de chèvre collectée dans la région de Ouargla à
(Hassi Ben Abdallah) ;
 Sélection des bactéries lactiques productrice des substances antimicrobiennes ;
 Recherche de la nature des ces substances inhibitrices.
I. 1. Matériels
Réactifs,
Appareils et matériels
milieux
d’isolement
et
d’identification
- Autoclave pour la stérilisation des
-Les réactifs de la coloration de Gram
-L‘eau oxygénée (H2O2)
milieux de culture et la destruction
- Bain Marie
- Ethanol
- Balance pour la pesée
- L‘huile de paraffine
- Bec bunsen
- Ferricyanide de Potassium 10%
- Centrifugeuse
- Citrate ferrique et Citrate de Sodium 2,5%
- Compteur de colonies
- Bleu de méthylène
- Dispositif de dosage acido-basique
- Chloroforme
- Distillateur d‘eau
- Phénolphtaléine pour le dosage acido-basique
-
Etuves
(15°C,30°C,
37°C
et
- L‘eau physiologique (ET)
42°C,62°C)
- Tampon Phosphate
- Four Pasteur (stérilisateur)
- Solution de NaOH N/9 pour la neutralisation
- pH mètre
- Solution de NaCL 1N pour l‘ajustement de
- Plaques chauffantes
- Réfrigérateur pour la conservation
- Vortex ou agitateur de tube
 Petit matériel
- Tube à essai, boîtes de pétri
- Pipette (1 à 10ml), pipette pasteur
pH
 Les milieux d‘isolement et purification :
- gélose MRS et géloseM17
- le bouillon MRS
 Les milieux pour l‘identification des souches
lactiques :
29
Partie expérimentale
Résultats et discussion
- Portoirs - papiers hygiéniques
-M16BCP, MSE ,KMK
-Pince, lames et lamelles
- MRS BCP
- Bécher - Erlenmeyer
- Lait écrémé
- Flacons, Eprouvette, entonnoir
-Les solution de sucres : Glucose, , Saccharose,
- Anse de platine, epindorfs
Lactose, Maltose, Mannitol, Tréhalose, Sucrose,
- Ecouvillon, Micropipette à 1ml
Rhamnose, Xylose, Arabinose et Sorbitol
 Les milieux pour la recherche de l‘activité
antimicrobienne :
-Gélose Muller Hinton
- MRS semi- solide
- Bouillon nutritif et la gélose nutritive
- Cœur de cervelle
I.2. Matériel Biologique
Fromage frais (J‘ben) préparé à base du lait de chèvre de façon traditionnelle.
Des souches pathogènes, E. coli (ATCC25922) , Pseudomonas sp. (ATCC27853) et
Staphylococcus aureus (ATCC25923 ).
II. Echantillonnage
Afin de préparer le fromage frais traditionnel –J‘ben -on a collecté le lait de chèvre
dans la région de Ouargla. Il a été prélevé auprès des éleveurs d‘une ferme Hassi Ben
Abdallah.
Le fromage a été préparé d‘une façon traditionnelle (l‘annexe I résume le procédé
de préparation du J‘ben), salé et additionné quelques gousses d‘ails.
III. Mesure du pH
Avant de commencer notre travail on a mesuré le pH du J‘ben.
IV. Préparation des dilutions décimales :
Selon NF ISO 15214 (V 08-030) on a suivi la méthode des dilutions décimales
jusqu‘à 10-6en utilisant l‘eau physiologique péptonée comme diluant.
IV.1. Préparation de la dilution mère
Nous avons introduit 1g du J‘ben dans un tube stérile remplis de 9ml d‘eau
physiologique peptonée. L‘homogénéisation a été réalisée par le vortex. Cette suspension
30
Partie expérimentale
Résultats et discussion
constitue alors la dilution mère qui correspond à la dilution 1/10 ou 10-1selon (Lebres et
al., 2002).
IV.2. Préparation des dilutions décimales
Un millilitre de la dilution mère (10-1) est prélevé aseptiquement et introduit dans un
tube à essai contenant 9 ml d‘eau physiologique peptonées .On obtient ainsi la dilution
10-2 et on répète la même procédure en prélevant 1ml à partir de la dilution 10-2 et en
l‘introduisant dans un tube contenant 9 ml du diluant et ainsi de suite (Arrêté 11
septembre 2004, JORA n° 70 du 7 novembre 2004 ; Guiraud, 2003). Nous avons
réalisé jusqu‘à 10-6.
V. Isolement, Purification et Conservation des souches
L‘isolement a été fait sur le milieu MRS solide (Man Rogosa Sharp) et milieu M17
gélosé spécifique pour les bactéries lactiques. L‘isolement a été fait en profondeur ; 1ml
pour chaque dilution a été étalé sur les boite de pétri homogénéiser avec les milieux
d‘isolement (chaque dilution est répétée en deux foi). Les cultures sont incubées 24 heures
à 30°C à l‘obscurité (Guiraud, 2003).
Les colonies obtenues après croissance sur les deux milieux vont servir par la suite
à procéder des différentes phases de repiquages successives sur milieux sélectifs MRS
gélosé ensemencé par stries suivie par d‘un enrichissement des souches sur le bouillon MRS
dans le but d‘avoir des colonies pures (Guiraud, 2003).
Pour conserver les souches, on a préféré les tester : par la coloration de Gram et la
production de H2O2 (test de catalase) pour avoir la certitude d‘avoir des colonies pures
appartenant aux bactéries lactiques et donc seules les souches à Gram positif et catalase
négative ont été prises en considération. Pour accomplir l‘étape de la conservation, on suivi
deux méthodes : la première à court terme : les souches pures lactiques ont été pris et
ensemencées sur le milieu MRS solide incliné. Après croissance à la température optimale,
les cultures sont maintenues à 4°C et le renouvellement des souches se fait par repiquage
tous les 15 jours (Badis et al., 2006).
La conservation à long terme ce fait par ensemencement des souches dans des
tubes contenant
30% glycérol + 70% MRS liquide et on les place dans le congélateur
(Badis et al., 2006).
31
Partie expérimentale
Résultats et discussion
VI. Pré-identification des souches
VI. 1. Identification phénotypique
VI. 1. 1. Caractères morphologiques
VI. 1. 1. 1. L’aspect macroscopique
A l‘aide d‘une loupe et après la croissance des souches on a observé l‘aspect des
colonies (la taille, la forme, la couleur) sur milieu MRS solide ainsi la détection des troubles
dans le bouillon MRS (Badis et al., 2006).
VI. 1. 1.2 L’aspect microscopique (Annexe II) :
Pour déterminer l‘aspect morphologique des isolats purs, on a accédé à la coloration
de Gram après les avoir fixé puis les colorés avec les réactifs de Gram, ensuite les avoir
observés au microscope optique au grossissement 100 en utilisant l‘huile à immersion.
VI. 1. 1.3. Etat frais
On ensemence dans Un tube contenant le milieu MRS liquide une colonie isolée
sur gélose MRS, incubé à 30°C/24 h, jusqu‘à l‘apparition d‘un trouble microbien. Afin de
déterminé la mobilité et la forme sur une lame on ajoute une goutte de la culture et on
observe au microscope (Attallah et belyagoubi, 2003).
VI.2. Tests d’identification
Afin de classer les isolats lactiques pures, en genres et en espèces, ils ont subi une
série de tests physiologique et biochimique.
VI.2.1 Identification physiologique et biochimique
VI.2.1.1. Test catalase
L‘objectif de ce test est de faciliter la distinction entre les bactéries lactiques à
catalase négative des autres souches non lactiques.
Certaines bactéries, durant leur respiration produisent du peroxyde d‘hydrogène (H2O2),
ce dernier et très toxiques cependant certaines bactéries ont la capacité de le dégrader
grâce à la catalase selon la réaction suivante : 2H2O2
2H2O + O2
Catalase
32
Partie expérimentale
Résultats et discussion
Sur une lame, on dépose une colonie provient d‘une culture pures avec une ou deux
gouttes de solution de peroxyde d'hydrogène.
La réaction positive se traduit par un
dégagement immédiat de bulles de gaz (O2) (Marchal et al., 1991).
VI.2.1.2. Croissance à différentes températures, pH et à différentes concentration de
NaCl
Les bactéries purifiées ont été testé pour leur pouvoir à résister de se croitre à
différentes températures, pH et à différentes concentration en NaCl.
Température
4°C
15°C
[NaCl]
37°C
42°C
2%
pH
4%
¨6.5%
4
6.8
9.6
VI.2.1.3 Thermoresistance
Le but de cette opération était de faciliter la caractérisation des souches lactiques
thermorésistantes dans le but de savoir qu‘elles appartiennent aux bactéries probiotiques
ou aux enterocoques sans oublier les lactocoques, on ensemence une colonie sur le milieu
MRS liquide, ensuite il va subir à un chauffage ( 62°C/30min) et mettre à l‘étuve
30°C/24h (Teuber et Geis, 2006). Un résultats positif se distingue par un trouble
VI. 2.1.4 Type fermentaire
Le but de ce test est de déterminer les bactéries hétérofermentaires ou
homofermentaires. La méthode se fonde sur l‘ensemencement des cultures jeunes des
souches lactiques pures (incubées à 30°C/18h) dans un tube contenant bouillon MRS
pourvu d‘une cloche de Durham et incubé à 30°C/24h. Si la bactérie est hétérofermentaire
le CO2 dégagé s‘accumule dans la cloche ( Badis et al., 2006).
VI.2.1.5. Test de bleu de Sherman (1937)
Le but de ce test est de bien différencier entre deux genres bactériens appartenant au
groupe des bactéries lactiques qui sont Lactococcus et Enterococcus. De ce fait on a basé
sur cette identification de la réduction de la couleur bleu de bleu de méthylène et la
coagulation du lait.
On a préparé le lait écrémé mélangé avec l‘indicateur coloré le bleu de méthylène à
différentes concentration ( 1% et 3%). Après stérilisation on verse quelques gouttes de la
33
Partie expérimentale
Résultats et discussion
suspension bactériennes ( les isolats en suspension) sur le lait de Sherman ( 1% et 3%),
incubé à 24h/30°C (Leveau et al., 1991)
Les bactéries qui provoquent la réduction de la couleur bleu et coagulation du lait à
3% sont des entérocoques tandis que celle qui poussent à 1% sont des lactocoques.
VI.2.1.6. Hydrolyse de l’arginine
Le test a été effectué sur le milieu M16BCP contenant de L-arginine.
On ensemence en stries une colonie bien distincte de souche lactique sur le milieu M16
BCP et incubé à 30 °C pendant 24 h (Thomas, 1973).
Les isolats lactiques notés comme positifs doivent croitre sur ce milieu en
hydrolysant l‘arginine après l‘utilisation de lactose de milieu en virant la couleur de ce
dernier.
VI.2.1.7. Utilisation du citrate
L‘utilisation de citrate par les bactéries lactiques comme source de carbone et
d‘énergie est un phénomène naturelle accompagne l‘activité aromatique de ces souches.
Exp L. cremoris et L. lactis.
Les isolats sont ensemencés sur le milieu KMK, comprend le citrate après 48h dans
l‘incubateur de 30°C les colonies qui apparaissent en couleur bleue sont concédérés positifs
pour l‘utilisation du citrate avec alcalinisation du milieu (virage de l‘indicateur au bleu).
(Kempler et McKay 1980). Tandis que les colonies blanchâtres ne possèdent pas une
citrate-perméase.
VI.2.1.8 Profil fermentaire (Utilisation des sucres)
Certainement les bactéries lactiques dégradent différentes sources de carbone. Ce test a
été réalisé sur le bouillon MRS BCP dépourvu de l‘extrait de viande et sans glucose
répartit dans les épendorfs à raison de 1ml ajouté a chaque foi un type de sucre.
Les sucres que nous avons utilisés sont : Glucose, , Saccharose, Lactose, Maltose,
Melibiose, Mannitol, Tréhalose, Sucrose, Rhamnose, Xylose, Arabinose et Sorbitol
Après incubation à 30°C/24h à 48h, nous distinguons le virage de milieu du violet
au jaune et cela indique que la souche lactique a pu utiliser cette source de carbones lors de
sa croissance (Bauer et al, 2009).
VI.2.1.9. Production des exo-polysaccharides (dextrane)
34
Partie expérimentale
Résultats et discussion
Ce sont des homopolysaccharides produits par des bactéries utilisant le saccharose
comme substrat spécifique.
Certains germes et notamment quelques bactéries lactiques ont la capacité de
synthétiser des exopolysaccharides à l'extérieur de la paroi cellulaire qui vont être adhérer
avec cette dernière sous forme de capsule, ou excrétés dans le milieu extracellulaire sous
forme de gomme
¨La production de polysacchandes (dextrane) se fait dans un milieu saccharosé ; les
bactéries isolées ont été ensemencé en strie sur le milieu MSE riche en saccharose, incubées à
30°C/24h. (Bauer et al, 2009).
Selon (Bauer et al, 2009) on retient les boites positives s‘il existe des colonies
muqueuses et cela indique la production de dextrane
L‘action de l‘enzyme dextrane-sucrases est soit inductibles c'est-à-dire qui ne peut
être produite en l'absence de saccharose exp chez les L. mesenteroides par contre chez les
Streptococcus sanguis et Streptococcus mutans la dextrane-sucrase est produite même en
absence de saccharose.
VII .Test technologique
VII.1 Etude des activités antimicrobiennes des souches isolées
Il s‘agit de chercher l‘activité antimicrobienne des souches lactiques isolées à partir
du produit laitier fermenté traditionnel, en ce basant sur la détection des bactériocines par
l‘apparition des zones d‘inhibition sur milieu solide.
VII.1.1 Souches bactériennes pathogène et leurs origines
Tableau 7 Bactéries pathogènes utilisées dans le test.
Milieu d’incubation
Souches pathogènes
Gram
Code
E.coli
négatif
ATCC25922
G.N. revivifié sur BN
Pseudomonas
négatif
ATCC27853
G.N. revivifié sur BN
Staphylococcus aureus
positif
ATCC25923
Chapman, revivifié sur
milieu cœur de cervelle
35
Partie expérimentale
Résultats et discussion
VII.1.2. criblage des souches à activité antimicrobienne
On fait tester les souches lactiques isolées pour leur pouvoir antimicrobien, par la
méthode de spots. Pour se faire, on ensemence sur une boite de Pétri contenant un milieu
solide une pré culture des bactéries cibles ensuite en dépose par touche les isolats lactique.
VII.1.3. Méthode de détection directe / Méthode des spots (Fleming et al., 1975)
(figure5)
Dans des boites de Pétri contenant le milieu MRS, on inonde la préculture des
bactéries cibles et à l‘aide d‘un écouvillon on reparti par des stries très serrées la
suspension versée.
Laissée sécher devant le bec benzène ensuite on ensemence par touche les bactéries
lactiques susceptibles d‘avoir un pouvoir de produire des bactériocines. On incube à
30°C/24h, pour la détermination des zones d‘inhibition qui se manifeste par la présence de
zones claire autour d‘un trouble formée par la croissance des souches cibles.
Figure5 : Méthode des spots (Fleming et al., 1975)
36
Partie expérimentale
Résultats et discussion
VII.1.4 Méthode de détection indirecte / Méthode des puits (Barefoot et Klaenhammer,
1983) (figure6)
Parmi les techniques montrées pour la détection des souches lactiques productrices
de bactériocines ; la méthode des puits qui est basée sur le principe de la capacité de ces
substances à se diffuser dans le milieu de culture solide ou semi solide.
On inonde sur le milieu MRS, Miller-Hinton ou la gélose nutritive des souches
pathogènes cibles (citées dans le tableau n°10). Pendant qu‘on le laisse séché ; on prépare
le surnageant comme suivant :
Préparation de surnageant : on centrifuge 15 ml de la suspension bactérienne préparé la
veille afin d‘obtenir une culture jeune 4000 tours/ 30min ensuite on neutralise le
surnageant par NaOH 1/9N de façon à obtenir un pH de 6,8 (l‘élimination de l‘effet de
l‘acide lactique).
On réalise quatre à cinq puits par boîte de Pétri (selon le nombre de test à réaliser) de
8 mm de diamètre, ces puits sont remplis par 50à 60 μl de surnageant[ le premier surnageant
est traité par la pepsine laissé incubé à 37°C/1h] (pour testé la nature protéique de la
substance produite par les isolats on utilise l’enzyme protéolytique à raison de 0,1g
dans 1ml d’eau distillée stérile. A l’aide de micropipette on prélève 100ul de ce
mélange et on le dépose sur 1ml de surnageant). [ les trois autres surnageant sont traités à
différentes températures à 70°C, 90°C et à 110°C pendant 30min], le cinquième puits est
remplis par le surnageant neutre. On ajoute quelques gouttes d‘une suspension de
Staphylococcus aureus pour éliminer l‘effet du peroxyde d‘oxygène. Après incubation 24
heures à 37°C, les diamètres des zones d‘inhibition apparaissant autour des puits sont
mesurés.
Une inhibition est considérée positive si le diamètre est supérieur à 2 mm
(Thompson et al, 1996) cité par (Doumandji et al 2010). La mesure du diamètre
d‘inhibition (Zi) est effectuée selon la formule suivante:
Zi en (mm) = diamètre de la zone d’inhibition obtenue (mm) – diamètre de puits (8
mm)
37
Partie expérimentale
Résultats et discussion
Figure 6 : méthode des puits (Barefoot et Klaenhammer, 1983)
VII.2. Recherche des bactériophages
On prépare 1 ml de tampon phosphate avec 50ul de chloroforme (laisser reposé
5min). Entre temps, on prend un tube contenant 10ml de milieu M.H on lui ajoute 100 ul
d‘une suspension de Staphylococcus aureus et on verse la solution préparé avant.
Mélanger le tous et verser sur la boite de Pétri. Incubé à 37°C/24h
La présence de plage de lyse sur le milieu indique la présence de phage et vis vers ça
l‘absence de plage de lyse indique l‘absence de phage.
VIII. Cinétique d'acidité et l’acidité Dornic
Ce test a permis de repérer les isolats qui ont été capables de coaguler le lait à 30
°C18 h après ensemencement des souches dans des tubes à 10ml de lait écrémé (100µl de la
suspension bactérienne dans chaque tube)
La coagulation de lait indique la croissance des souches,
à partir
d'un flacon
contenant 100ml de lait écrémé stérile , on transfère 3ml de lait coagulé de chaque tube
sélectionné puis on homogénéise chaque flacon et on réparti ces derniers dans des tubes
stériles a raison de 10 ml par tube . La quantité d'acide lactique produit est calculé après
différent temps (2h, 4h, 6h , 8h , 18h ,24h )
38
Partie expérimentale
Résultats et discussion
L‘acide produit par les isolats a été mesuré selon la méthode normalisée au
NaOH (N/9) en ajoutant 5 gouttes de phénophtaléine comme indicateur coloré, le dosage
s'arrête après l'obtention d'une couleur rose pale avec la mesure de pH avant chaque dosage
L‘acidité titrable du lait a été exprimée en degrés Dornic (°D) puis convertie en
g/l selon la formule: 1ml de Na OH ajouté correspond à 10 °D et un degré Dornic
correspond à 0,01% d‘acide lactique.
Figure 7 :méthode de mesure de l‘acidité Dornic (Badis et al., 2006)
39
Partie expérimentale
Résultats et discussion
Résultats et discussion
I. Mesure du pH
On a obtenu un pH acide 5,4. (El Baradei et al., 2008) Interprètent le processus de
l‘acidification du lait jusqu‘à sa coagulation par l‘activité des bactéries lactiques autochtones,
en choisissant la voie de la fermentation lactique elles produisent de l‘acide lactique ce
dernier provoque une coagulation et abaissement de pH.
II. Isolement, purification et conservation des souches
Après avoir réalisé plusieurs repiquages sur le milieu spécifique MRS (solide et
liquide alternativement) à partir des colonies isolés des milieux MRS et M17 nous avons
obtenus des colonies pures (même taille, formes identiques et même couleur). (Figure 8)
22 souches pures ont été isolées du fromage frai (J‘ben) à base du lait de chèvre à partir du
MRS et M17 du fait que ces bactéries lactiques sont exigeantes elles demandent un milieu
très riche en sucre (20g de glucose dans le milieu MRS), en source d‘azote ( Extrait de
levure 5 g, Extrait de viande 10 g et Polypeptone 10 g) et en facteurs de croissance ( Pilet
et al., 2005).
Figure8 : Obtention des colonies pures après plusieurs repiquages sur le milieu MRS
(solide et liquide) Colonie provient de milieu M17
T : Témoin
A : phase claire
B : trouble de croissance
40
Partie expérimentale
Résultats et discussion
III. Pré-identification des souches
III. 1. Identification phénotypique
III. 1. 1. Caractères morphologiques
III. 1. 1. 1. Aspect macroscopique
L‘aspect macroscopique a été observé sur le milieu MRS (solide et liquide) à l‘œil
nu afin de distinguer l‘aspect de croissance, ainsi que la couleur, la forme et la taille des
colonies (Badis et al., 2006).
On a obtenu des petites colonies muqueuses d‘environ 1 à 2mm de diamètre
arrondies régulières, lenticulaire
et bombées avec une couleur blanchâtre à jaunâtre.
(Figure 8 )
D‘après Guiraud, (2003 ); La pureté des souches est révélée par des colonies
homogènes ayant le même aspect extérieur (couleur, taille et forme).
Quelques colonies ont montré un aspect irrégulier et un peu plus grande 2,5à 3 mm
de diamètre (sont éliminées).
III. 1.1.2 Aspect microscopique
L‘examen microscopique des isolats purs après coloration de Gram a révélé que ses
souches ont une coloration positive avec de forme variées : de petites coques, coccobacille
et ovoïde (figure 9 ).
Figure (A)
Figure (B)
Figure 9: observation microscopiques de la souche M17 S83 (A) Gr x 100 et MRS S79(B)
Gr x 40 Coloration de Gram
41
Partie expérimentale
Résultats et discussion
Cela explique que ces bactéries lactiques possèdent plusieurs couches de murèine,
formant un réseau compact ainsi que des acides teichoïques (Guiraud 2003). Voire le
tableau 8.
III. 1.1.3. Etat frais
Après l‘observation sous microscope nous avons observé que les bactéries lactiques sont
immobiles.
Tableau8 : Résultats de coloration de Gram et aspects microscopiques des souches isolées ainsi que
Souches isolées de milieu M17
Souches isolées de milieu MRS
le mode de regroupement
Souche
Coloration de Gram
Forme
Regroupement
S76
+
coccobacille
Diplocoques/chainette
S77
+
Coccus
Isolée/ chainette
S78
+
Coccus
Isolée/ chainette
S79
+
Coccus
Diplocoques/chainette
S80
+
Coccus
Diplocoques/chainette
S81
+
Coccus
Isolée/ chainette
S84
+
Coccus
Isolée/ chainette
S85
+
Coccus
Isolée
S87
+
Coccobacille
Diplocoques/chainette
S89
+
Coccobacille
Isolée
S78
+
Coccus
Chaine
S79
+
Coccus
Diplocoque
S82
+
Coccus
Isolée/ chainette
S83
+
Ovoïde
Diplocoque
S85
+
Coccus
Isolée
S86
+
Ovoïde
Diplocoques/chainette
S87
+
Ovoïde
Diplocoque / chainette
S89
+
Coccobacille
chainette
S94
+
Coccobacille
Isolée/ chainette
S96
+
Coccus
Chainette
S99
+
Coccus
Isolées/ chainette
S100
+
Coccus
Isolées/ chainette
42
Partie expérimentale
Résultats et discussion
IV. Tests d’identification
IV.1. Identification physiologique et biochimique
IV.1.1. Test catalase
En vue de l‘isolement de la flore lactique, on a effectué le test de la catalase. Seules
les souches à catalase négative ont été retenues.
Et ceci est la cause de l‘incapacité des bactéries lactiques de synthétiser les
porphyrines (et donc des cytochromes et de la catalase) de ce fait elles ne dégradent pas le
peroxyde d‘hydrogène en eau et dioxygène qui se manifeste par la formation de bulles
(Whittenbury, 1978).
Whittenbury (1978) a considéré que les bactéries lactiques comme des germes
anaérobies facultatifs préfère qu‘elles soient dans des conditions anaérobies. et
qu'apparemment, elles ne sont pas capables de former de l'ATP par la chaîne de transport des
électrons (ou phosphorylation oxydative).
Si l'oxygène peut parfois leur être substrat affirma (Davis, 1963) , il conduit comme
produit final au peroxyde d'hydrogène (H202) qui est toujours un produit toxique du fait que
dans la plupart des cas, ces bactéries ne peuvent pas normalement le décomposer, ne
possédant pas de catalase fonctionnelle.
En plus de ces tests, nous avons effectué des tests biochimiques et physiologiques
pour bien nous aider à déterminer le genre et l‘espèce de nos 24 souches isolées.
IV.1.2. Croissance à différentes températures, pH , à différentes concentration de
NaCl et la thermoresistance
Les résultats de test physiologie des souches lactiques isolées sont représentés dans
le tableau ci-dessous (tableau 9) nos germes ont subi un examen de croissance dans des
conditions hostiles.
Les résultats indiquent que la moitié des isolats ont montré une croissance sur milieu
MRS à pH 4 et la plupart d‘elles ont pu se croitre dans un milieu MRS à pH 9.
43
Partie expérimentale
Résultats et discussion
Ainsi qu‘on a remarqué que 60% des souches ont supporté les différentes
concentrations de NaCl. Alors que les autres n‘ont pas toléré la grande acidité.
Toutes les bactéries poussent dans les températures : 4°C, 15°C et 37°C Par contre
plus de 70% d‘ elles n‘ont pas
souches
sont
mésophiles.
à des températures élevées . Ce qui confirme que ces
Les
bactéries
lactiques
restantes
sont
thermophiles.
44
Partie expérimentale
Résultats et discussion
Tableau 9 : Résultats des tests physiologique
Souches
pH
Croissance aux différents [NaCl]
4
9
2%
4%
6%
Croissance à différentes températures
4C°
15C°
37C°
42C°
Thermorésistante
M17
Souches isolées de milieu
Souches isolées de milieu MRS
(62°C/30min)
S76
+
+
-
+
-
-
+
+
+
-
S77
-
-
+
-
-
+
+
+
-
-
S78
-
-
+
+
-
-
+
+
-
-
S79
-
-
+
-
-
+
+
+
-
-
S80
-
-
+
+
+
+
+
+
+
-
S81
+
+
+
-
+
+
+
+
+
-
S84
+
+
+
+
+
-
+
+
+
-
S85
-
-
+
+
-
-
+
+
+
-
S87
+
-
+
+
+
+
+
+
-
-
S89
+
+
+
+
+
+
-
+
-
-
S78
+
+
+
+
-
+
+
+
-
+
S79
+
+
+
+
+
+
+
+
-
+
S82
+
+
+
+
-
+
+
+
-
-
S83
-
+
+
+
+
+
+
+
-
+
S85
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
S86
-
+
+
+
-
+
+
+
-
+
S87
+
+
+
+
-
+
+
+
-
+
45
Partie expérimentale
Résultats et discussion
S89
+
+
+
+
+
+
+
+
-
+
S94
-
+
+
+
+
+
+
+
-
-
S96
-
+
+
+
+
+
+
+
-
+
S99
-
+
+
+
+
+
+
+
-
+
S100
-
+
+
+
+
+
+
+
-
+
+ : croissance ; - : pas de croissance.
46
Partie expérimentale
Résultats et discussion
IV.1.3. Type fermentaire
La plupart des souches lactiques isolées à partir du J‘ben préparé à base du lait de
chèvre ont montré qu‘elles sont homofermentaires (donc fermentent le sucre en lactate sans
produire du gaz). Sauf 6 souches pourvues d‘un caractère hétérofermentaire (présence de
CO2 dans la cloche de Durham). (figure 10)
Figure 10 : type fermentaire sur milieu MRS liquide glucosé contenant la cloche du
Durham
D‘après l‘explication de (Atlan et al., 2008) que les bactéries lactiques selon leurs
genres ou espèces utilisent l‘une des deux voies du métabolisme des sucres (figure 11),
soit la voies homofermentaire (Embden- Meyerhof-Parnas, EMP) ou hétérofermentaire
(voie des pentoses-phosphate).
47
Partie expérimentale
Résultats et discussion
Figure 11: Voies fermentaires de la dégradation du glucose (Atlan et al., 2008).
[GLK : glucokinase, FBA : fructose-1,6- bisphosphate aldolase, XPC : xylulose-5-phosphate
phosphocétolase, PK : pyruvate kinase, LDH : lactate déshydrogénase].
Les souches lactiques homofermentaires conduisent dans leurs conditions optimales de
croissance et en présence du glucose à la synthèse de l‘acide lactique et de l‘ATP. La
fructose-1,6-bisphophate
aldolase
(FBA)
est
une
enzyme
clé
indispensable
au
fonctionnement de la voie EMP (Thompson et Gentry-Weeks, 1994). (figure 11).
Thompson et Gentry- Weeks, (1994) ont bien éclairci le phénomène de la voie
hétérofermentraire ou voie des pentoses phosphate ; en le résumant par l‘absence de
l‘enzyme clé FBA et le système de transport PTS
48
Partie expérimentale
Résultats et discussion
IV.1.4. Profil fermentaire ( Utilisation des sucres)
Les résultats sont résumés dans le tableau 10 : caractère fermentaire et fermentation de
sucres
Souches
Type fermentaire
Tréhalose
Sucrose
Rhamnose
Xylose
Maltose
Glucose
Lactose
Saccharose
Arabinose
Sorbitol
Caractère fermentaire
S76
Hétéro
_
_
+
_
_
_
+
_
_
_
S77
Homo
+
_
+
_
+
_
+
_
+
_
S78
Homo
+
_
_
+
+
_
_
_
_
_
S79
Homo
+
+
+
_
_
_
_
_
+
+
S80
Homo
_
+
_
_
_
_
+
+
_
+
S81
Homo
_
_
+
_
+
_
_
+
+
_
S84
Homo
+
+
_
+
+
_
_
+
+
+
S85
Homo
+
_
+
+
+
_
_
+
_
+
S87
Hétéro
_
+
_
+
_
_
+
+
+
_
S89
Homo
+
+
_
_
+
_
_
_
+
+
S78
Homo
_ +
_
_
_
_
_
_
_
S79
Homo
/
_
_
_
_
_
_
_
_
_
S82
Homo
/
+
_
+
_
_
_
_
_
_
S83
Hétéro
/
+
+
_
_
+
_
_
_
_
S85
Homo
/
+
_
_
_
+
_
_
_
+
S86
Hétéro
/
+
_
_
+
+
+
_
+
+
S87
Hétéro
+
_
_
+
+
_
+
_
_
+
S89
Hétéro
_
+
_
+
+
_
_
+
+
_
S94
Homo
_
_
+
+
+
_
+
+
+
+
S96
Homo
_
_
+
_
_
_
+
+
+
_
S99
Homo
_
_
_
+
+
_
+
_
+
_
S100
Homo
_
+
_
_
_
_
+
+
_
_
et
fermentation
Souches isolées de milieu M17
Souches isolées de milieu MRS
sucres
de
/
homo : homofermentaire hétéro : hétérofermentaire + : positive
- :négative
49
Partie expérimentale
Résultats et discussion
Figure 12 : profil fermentaire (utilisation des sucres) souche S85 isolée de MRS.
jaune: dégradation des sucres
T : Tréhalose S : Sucrose L : Lactose M : Maltose
vert: absence de dégradation
X : Xylose
Glu : Glucose A : Arabinose Sor :
sorbitol
Sac : Saccharose Rh : Rhamnose
d‘après les résultats de tableau 10 et la figure 12 ,on constate que les bactéries
lactiques capable d'utilisé plusieurs sucres.
Le virage de couleur bleu de bromothimole contenant dans le milieu MRS BCP
confirme que les souche ont dégradé la pluparts des sucres additionné dans le milieu ce qui
laisse ce dernier (acide).
IV.1.5.Test de bleu de Sherman
Après 24h d‘incubation les résultats obtenus : 8souches ont réduit le bleu de méthylène
3% avec coagulation du lait (voir le tableau 11). L‘explication de cette expérience se fonde
sur le type respiratoire des souches ; si ces dernières sont aérobie le cas des (entérocoques)
elles ont besoin de l‘oxygène pour compléter leur métabolisme et donc elles vont tirer
l‘oxygène depuis le bleu de méthylène et il perdra ensuite sa couleur bleu.( Rabah,2010).
Si c‘est le contraire le cas des lactocoques qui utilisent seulement une petite quantité
d‘oxygène
ceci indique qu‘elles ne réduit que le lait à 1% de bleu de méthylène. On
remarque ce changement avec les autres souches lactiques (Rabah,2010) figure 13
50
Partie expérimentale
Résultats et discussion
R( Réduction)
C( Coagulation)
Figure 13 : test de bleu de Sherman à 1% et 3%
IV.1.6. Hydrolyse de l’arginine
Après avoir ensemencé les isolats sur le milieu M16BCP contenant comme élément
essentiel 4 g de L-arginine ; nous avons obtenu les résultats suivants :
16 souches ont dégradé l‘arginine après avoir consommé le lactose présent dans le
milieu. Cela montre que ces bactéries ont une aptitude d‘utiliser leur enzyme ADH afin de
catalyser ou décarboxyler l‘arginine présent dans le milieu.
Ces éclaircissements on peut les constaté à partir de l‘acidification du milieu et sa
réalcalinisation et cela nous est apparu par le virage de l‘indicateur de pH à sa teinte basique.
Seulement les souches (S78, S79, S82, S83, S85, S86, S87 et S88) isolées à partir de
milieu M17 n‘hydrolysant pas l‘arginine (figure 14). La couleur jaune indique la dégradation
de lactose et NH3 résponsable de la réalcanisation du milieu et l‘apparition de la couleur bleu
et absent (Zarour K. 2010).
51
Partie expérimentale
Résultats et discussion
(a)présence d’ADH
(b) absence d’ADH
Figure14 : test de l‘hydrolyse de l‘arginine
IV.1.7. Utilisation du citrate
Les souches lactiques codées par (S78, S82, S83, S85, S86, S87, S88, S89, S94,S96,
S97,S99,S100 ) souche isolé apartir de milieux M17 ont révélé un résultat positif pour la
production de citrate
Selon Kihel et al..( 1996), Moulay (2006) ; la présence de citrate dans le milieu inhibe
la réaction entre l‘ion de fer et ferricyanide de potassium. Les colonies qui ferment le citrate
lancent la réaction entre ces ions (il en résulte des colonies bleues avec un centre bleu
foncé).
Les 11 souches restantes n‘ont pas montré aucune utilisation de citrate durant leur croissance
(colonies restent blanches ). (Figure 15).
Figure 15 : test de citrate sue le milieu KMK
52
Partie expérimentale
Résultats et discussion
La fermentation des citrates est un phénomène important chez les bactéries lactiques
puisqu'elle est en relation très étroite avec l'activité aromatique de ces microorganismes
(Harvey et Collins, 1962).
La première enzyme induite dans le métabolisme du citrate est le citrate perméase
impliquée dans le transport de celui-ci vers l'intérieur de la cellule. Elle est fonctionnelle aux
pH inférieurs à 6 ; son pH optimum étant 5 (Harvey et Collins, 1962). Une fois à l'intérieur
de la cellule, le citrate est coupé en acétate et en oxaloacétate par la citrate-Iyase (encore
appelée citritase) (Harvey et Collins, 1962).
Figure 16 : Métabolisme du citrate par les souches citrate-positive chez les lactocoques et
les entérocoques (Mc Sweeney et Fox, 2004).
53
Partie expérimentale
Résultats et discussion
IV.1.8 Production des exo-polysaccharides (dextrane)
L'activité des dextrane-sucrases des souches lactiques a pour résultat la formation de
dextranes et d'oligosaccharides (Robyt et Walseth,1978).
Les souches lactiques ensemencées sur le milieu MSE ne sont pas productrices de
dextrane cela indique qu‘elles ne possèdent pas l‘enzyme responsable à la synthèse des
exopolysaccharide (Figure 17)
Figure 17 : test de production des exopolysaccharides ( dextrane)
Sutherland(1982) certaines bactéries se sont développé sur le milieu contenant de
saccharose (ou de substrats très voisins) mais ne peuvent former de polysaccharides.
54
Partie expérimentale
Résultats et discussion
Le tableau ci-dessous résume nos tests d‘identification biochimique sur différentes
souches lactiques.
Tableau 11 : les caractéristiques biochimiques des souches lactiques isolées
Test
Hydrolyse
de
Utilisation du
l’Arginine
Production
Test
de Dextrane
Sherman
de
Citrate
1%
3%
Souches isolées de milieu M17
Souches isolées de milieu MRS
Souches
S76
+
+
-
/
/
S77
+
+
-
+
+
S78
+
+
-
+
+
S79
+
+
-
+
+
S80
+
+
-
+
-
S81
+
+
-
+
+
S84
+
-
-
-
-
S85
+
+
-
/
/
S87
+
+
-
/
/
S89
+
-
-
-
-
S78
-
+
-
+
-
S79
-
-
-
+
+
S82
-
+
-
/
/
S83
-
+
-
/
/
S85
-
+
-
+
-
S86
-
+
-
/
/
S87
-
+
-
/
/
S89
+
+
-
/
/
S94
+
+
-
-
-
S96
+
+
-
/
/
S99
+
+
-
+
-
S100
+
+
-
+
-
+ réaction positive
- réaction négative
/ non déterminée
A l‘aide des résultats trouvé, on a identifié nos isolats en s‘appuyant sur les tests
physiologiques et biochimiques. On a obtenu le tableau suivant.
55
Partie expérimentale
Résultats et discussion
Tableau 12: Identification des souches
Genre
Lactococcus
Leuconostoc
Enterococcus
Latobacillus
Lactococcus lactis subsp cremoris
Lactococcus diacetilactis
Autre Lactococcus lactis
Leuconostoc cremoris
Leuconostoc lactis
Enterococcus durans
Latobacillus brevis
Latobacillus fermentum
Code
Lactococcus lactis subsp lactis
Espèce
*S
*S
*S78,
*S85
*S86
*S83
S77
*S89
S76
79
*S82,
94
S79
*S87
S78
S87
*S96
S80
*S99
*S100
S81
S84
S85
S89
*S (Souche isolée à partir de M17) S ( Souche isolée à partir de MRS)
Les souches ont été identifié à partir du livre – microbiologie alimentaire- (Guiraud,2003 ).
V. Test technologique
V.1. Etude des activités antimicrobiennes des souches isolées
V.1.1. Criblage des souches à activité antimicrobienne
Après avoir ensemencé les 22 souches par touches sur le milieu MRS solide dans le
but de cribler et de sélectionner celles qui possèdent une activité antimicrobienne ; nous
56
Partie expérimentale
Résultats et discussion
avons obtenu quatre souches isolées à partir de milieu MRS ( S77 , S78 , S79 et S87) et 11
souches isolées à partir de milieu M17 dont nous avons travaillé. (Figure 22).
V.1.2. Méthode de détection directe ( Méthode des spots) (Fleming et al., 1975)
Cette méthode nous a permis de cribler les bactéries lactiques ayants une activité
antimicrobienne
Les résultats obtenus a été révélé par la présence des zones claires d‘inhibition
autour des nos souches isolées ensemencées en touche. (Figure 18)
Les résultats de
l‘interaction entre nos bactéries et celles des bactéries pathogènes sont exposé dans les
figures suivantes :
Figure18 : test de l‘activité antimicrobienne des bactéries lactiques
Méthode de spot (Fleming et al., 1975)
57
Partie expérimentale
Résultats et discussion
V.1.2.1.Mesure de spectre d’inhibition
Le tableau ci-dessous représente les résultats d‘inhibition sur milieu solide (Fleming
et al., 1975)
15 souches sur 22 isolats lactiques avaient une action positive sur les germes
pathogènes indicateurs avec des diamètres d‘inhibition différents. (Tableau 13) représente
les diamètres des zones d‘inhibition des souches à activité antimicrobienne positive.
Ce tableau montre que seulement les souches (Enterococcus durans, Lactococcus
lactis, Latobacillus fermentum) ont pu inhiber Pseudomonas aerogenosa .Tandis que les
autres souches n‘avaient pas une activité inhibitrice.
L‘action est noté positive lorsqu‘elle supérieure à 1mm ( Schillinger et Lucke, 1989).
On a détecté 11souches lactiques isolées à partir du milieu M17 avaient des effets
antagonistes sur E.coli et Staphylococcus aureus. Cette action indique l‘inhibition de la
croissance des souches indicatrices qui a été traduit par l‘apparition des zones claires
(Barefoot et Kaenhammer, 1983 ; Fleming et al., 1975).
Tableau13 : diamètre des zones d‘inhibition (mm) des bactéries lactiques à activité
antimicrobienne
Diamètre de la zone d’inhibition en mm
Souches
Indicatrice
Escherichia coli
Staphylococcus
Pseudomonas
aureus
aerogenosa
17mm-
17mm
17mm
S 78 Enterococcus durans
15mm
16 mm
15pmm
S 79 Lactococcus lactis
15mm
13mm
5 mm
S 87 Latobacillus fermentum
13mm
12mm
13mm
S78 Lactococcus diacetilactis
11mm
˃10 mm
/
S82 Lactococcus diacetilactis
10mm
˃10 mm
S83 Leuconostoc lactis
13mm
˃10 mm
/
S 85 Lactococcus lactis
13mm
˃10mm
/
S 86 Leuconostoc cremoris
16mm
14mm
/
de M17
MRS
S 77 Enterococcus durans
Isolées de milieu
Souches
Souches de
Inhibitrice
58
Partie expérimentale
Résultats et discussion
S87 Leuconostoc cremoris
14mm
12mm
/
S89 Latobacillus brevis
15mm
13mm
/
12mm
˃10
/
S96 Lactococcus diacetilactis
10mm
15mm
/
S99 Lactococcus diacetilactis
12mm
16mm
/
S 100 Lactococcus diacetilactis
16mm
13mm
/
S94
Lactococcus
lactis
subsp
cremoris
V.1.3. Méthode de détection indirect / Méthode des puits (Barefoot et Kaenhammer,
1983)
Le principe était de chercher l‘effet inhibiteur des souches productrices dans leur
surnageant de culture. Nous avons remarqué que cette activité inhibitrice est présente dans
le surnageant.
Dans ce test, aucune zone d‘inhibition n‘a été observée autour des puits lorsqu‘on a
utilisé le surnageant des souches sélectionnée malgré de nombreuses répétitions. Sauf quatre
souches S89, S87, S100 ( isolées de milieu M17) et S78(isolée de milieu MRS) ont une
activité contre les Staphylococcus aureus. (figures 19,20,21 et 22)
Zi = mm) = diamètre de la zone d’inhibition obtenue (mm) – diamètre de puits (8 mm
Figure 19 : activité antibactérienne de Lactobacillus brevis vis-à-vis Staphylococcus
aureus Par méthode de diffusion (puits) (Barefoot et Kaenhammer, 1983)
59
Partie expérimentale
Résultats et discussion
Figure 20 :activité antibactérienne de Leuconostoc cremoris vis-à-vis Staphylococcus
aureus Par méthode de diffusion (puits)
Figure 21 : activité antibactérienne de Lactococcus diacetilactis vis-à-vis Staphylococcus
aureus . Par méthode de diffusion (puits)
Figure 22 :activité antibactérienne d‘ Enterococcus durans vis-à-vis Staphylococcus
aureus Par méthode de diffusion (puits)
60
Partie expérimentale
Résultats et discussion
Tableau 13: Résultat de l‘activité antibactérienne des bactéries lactiques vis-à-vis
Staphylococcus aureus
Surnageant
vis-à-vis
Zi de la zone d’inhibition
Staphylococcus aureus
Neutre
70°C
90°C
110°C
Pepsine
Lactobacillus brevis
14mm
2mm
9mm
10mm
0mm
Leuconostoc cremoris
12mm
4mm
4mm
12mm
0mm
Lactococcus diacetilactis
27mm
0mm
2mm
3mm
0mm
Enterococcus durans
2mm
1mm
2mm
10mm
0mm
Ces substances ont été caractérisées par d‘autres chercheurs comme étant des
molécules de nature protéique vue leur traitement par des enzymes protéolytiques
(Broughton 1990).
Généralement la zone d‘inhibition est un peu plus large lorsqu‘on utilise
Staphylococcus aureus car les bactéries lactiques sont surtouts actives sur les bactéries
pathogènes à Gram positves (O’sullivan et al.,2002)et que les bactéries à Gram positives
sont généralement plus sensibles à l‘effet bactéricide des bactéries lactiques (Biswas et
al.,1991). (tableau13)
Après le traitement des surnageant par différentes températures (70°C , 90°C et
110°C) on a remarqué qu‘il y a une inhibition même après chauffage (Lachance,2000 ;
Labioui et al., 2005) (tableau13).
La souche Lactococcus diacetilactis présente une activité bactéricide forte sur
Staphylococcus aureus (zone d‘inhibition de 27 mm) Lactobacillus brevis (14 mm) et
Leuconostoc cremoris.(12mm) (tableau.13.).
Les diamètres d‘inhibition sont plus faible pour la souche Enterococcus durans( 2mm)
Ces résultats qu‘on a obtenu, on nous a laissé de suggéré que ces substances
protéiques Sont diffèrent des acides organiques et du peroxyde d‘oxygène. Pour un
traitement à 110°C pendant 20 et 30 min, la zone d‘inhibition importante suggère que la ou
61
Partie expérimentale
Résultats et discussion
les molécules inhibitrices sont thermostables. Ces caractéristiques font penser qu‘on a
affaire à des bactériocines (Labioui et al., 2005)
En fin, d‘après les résultats de la recherche de pouvoir antimicrobien des bactéries
lactiques ; on suggère que cette bactériocine secrété par les genres testés Lactobacillus
,Leuconostoc , Lactococcu et Enterococcus durans appartient à la classe II qui renferme les
bactériocines thermo-résistantes (Klaenhammer, 1988).
V. 2. Recherche des bactériophages
Le résultat obtenu nous a affirmé l‘absence total des bactériophages et cela a été observé
par l‘inexistence des plage de lyse sur le milieu Muller- Hinton ( Figure 23).
Figure23 : test de recherche des bactériophage ( absence de plage de lyse)
VI. Cinétique d'acidité
Deux souches sur 22 isolats ont été capables de coaguler le lait après une incubation
à 30°C
pendant 18 h S89(M17) S78(MRS) , le pH a diminué progressivement en fonction
de temps et le degré Dornic a augmenté a cause de l'augmentation de l'acide lactique produit
par les souches.
62
Partie expérimentale
Résultats et discussion
Figure 25: dosage d‘acidité
Figure 24 : coagulation du lait ensemencé
par les bactéries lactiques ( après 18h)
Tableau 15 : la variation de pH et de degré Dornic en fonction du temps chez les souches
S89 et S87
S89 isolées de M17
pH
V
S78 isolées de MRS
D°
A. L (g)
pH
V
D°
A.L. (g)
0h
6.7
2.3
23
2,3
6.6
1.9
19
1,9
2h
6.4
2.5
25
2,5
6.5
2.1
21
2,1
4h
6.2
2.6
26
2,6
6.3
2.3
23
2,3
6h
6.06
3
30
3
6.23
2.6
26
2,6
18h
4.48
12
120
12
5.36
6.2
62
6,2
24h
4.23
12.5
125
12,5
5.3
6.3
63
6,3
D° degré dornic
V volume de NaOH ajouté
63
Partie expérimentale
Résultats et discussion
8
7
acidité pH
6
5
4
DO S89
3
DO S78
2
1
0
0h
2h
4h
6h
18h
24h
temps (h)
Figure 26 : variation de pH en fonction du temps chez les souches S78 et S89
200
180
160
acidité DO
140
120
100
80
DO S78
60
DO S89
40
20
0
0h
2h
4h
6h
18h
24h
temps (h)
Figure27 : variation de l‘acidité exprimée en degrés Dornic en fonction du temps
chez les souches S78 et S89
L‘abaissement du pH dans le milieu lait écrémé signifie que chacune des deux
souches lactiques possède un effet acidifiant, en produisant des acides organiques (figure 26
et 27). La comparaison entre les résultats du pH et celui de l‘acidité montre que le taux
d‘acidité augmente avec la diminution du pH.
64
Partie expérimentale
Résultats et discussion
La production de l‘acide a été suivie en fonction du temps en utilisant les cultures
pures des souches séléctionnées (S89 et S78), cette activité acidifiante est souvent utilisée
dans le choix des souches pour l‘industrie alimentaire.
Le suivi de la quantité d‘acide lactique produite et l‘évolution du pH dans les
conditions mésophiles nous a permis de conclure que le temps d‘incubation à influencer
positivement sur le rendement de nos souches. Les résultats sont présentés sous forme de
diagramme (figure 26 et figure 27).
De ces résultats nous avons constaté que la quantité d‘acide lactique produite change
selon le stade de vie de la bactérie cette différence de production peu être expliqué par une
déficience dans le système du transport des substances fermentiscibles du milieu vers le
cytoplasme cellulaire.( Albenzino et al.,2001).
Nous remarquons aussi que la production d‘acide lactique par nos souches est moins
importante, on explique ceci par leur métabolisme hétérofermentaire donc la production
d‘autre composé organique tel que l‘acide acétique, le glyceraldehyde, l‘éthanol et le CO2
plus l‘acide lactique (Kihel et al., 2006).
Le suivie du pH montre une diminution progressive pour les souches sélectionnées et
on a constaté une variation entre les deux souches dans la production d‘acide lactique et aussi
la diminution du pH cela s‘explique par plusieurs facteur le plus important et l‘aptitude des
souches a possédé une activité protéolytique qui est codé par un matériel extrachromosomique (Juillard et al., 1998).
65
Conclusion et
perspectives
Conclusion et perspectives
Conclusion et perspectives
Les bactéries lactiques sont largement utilisées dans les industries agro-alimentaires
dans le but d‘exploiter leur activité aromatisant et acidifiant ; on les emploie surtout dans la
fabrication des fromages et de yaourts. Une autre activité a été envisagé ces dernières années
sur ces germes lactiques est celle de leur capacité à secréter des substances antimicrobiennes,
ce qui a intéressé les chercheurs et les investisseurs afin d‘ augmenter la duré de conservation
des produits alimentaires par l‘utilisation de ces substances bioconservatrices de type
bactériocine..
Actuellement, on dispose d‘un ensemble de souches des bactéries lactiques
productrices de bactériocines possédant des caractéristiques différentes notament au niveau
de leur spèctre d‘action.
Le but de cette recherche était d‘étudier et caractériser les substances antimicrobiennes des bactéries lactiques en se basant surtout sur la recherche des bactériocines
par la méthode des interactions de ces souches productrices et les germes pathogènes (E.coli,
Staphylococcus aureus et Pseudomonas).
Les souches des bactéries lactiques utilisées dans cette étude ont été isolées à partir
de fromage traditionnel (J‘ben) préparé à base de lait de chèvre et ont été identifiées en
s‘appuyant sur les caractéristiques morphologiques, phisiologiques et biochimiques.
Nous avons essyé de montrer que les 22 bactéries lactiques isolées à partir de J‘ben
prduisent une activité antimicrobienne contre les bactéries pathogènes sur le milieu solide.
Nous avons criblé 15 souches lactiques pures appartiennent aux genres ( Lactococcus,
Lactobacillus, Leuconostoc et Enterococcus) qui sont capables de produire des substances
antimicrobiennes permettant d‘éliminer la croissance des germes cibles pathogènes.
Par la suite, nous avons determiné la nature biochimique de ces substances inhibitrices
et leur localisation dans la cellule productrice par traitement de surnageant à différentes
températues(70°C,90°C et110°C) pendant 30min et par des enzymes protéolytiques
( pepsine) en adoptant la méthode de diffusion sur milieu solide (méthode de puits). On a
constaté que ces composés étaient de nature protéique et se localisent dans les fractions
extracellulaires parce que les zones d‘inhibition ont été détéctées lors de traitement de
surnageant des bactéries lactiques et non pas le culot bactérien.
66
Conclusion et perspectives
La mesure de diamètres des zones d‘inhibition sur la culture de la souche cible a
révélée une variation des résultats pour chaque traitement ce qui nous a laissé suggérer que
ces bactériocines appartiennent à la classe II –bactériocine like-.
A la fin, le fromage que nous avons préparé se caractérise par un rendement important
de bactéries lactiques de point de vue la diversité, charge et activité antimicrobienne.
L‘importance de ce travail est d‘employer les bactériocines des bactéries lactiques
comme un bio conservateur au lieu des additifs chimiques utilisés dans les industries agroalimentaire et de montrer l‘efficacité de ces composés vis-à-vis les bactéries pathogènes.
D'autres études seront nécessaires pour en savoir plus sur l'action des bactériocines
sur les champignons, les protozoaires et ainsi sur les bactéries à Gram négatif qui sera
intéressant de fonder une recherche approfondie sur ce point.
Aussi des perspectives peuvent être proposées pour terminer ce travail :

L‘identification de poids moléculaire, composition en acides aminés

L‘étude de leurs spectre d‘inhibition

Action du pH sur la stabilité de la bactériocine

L‘analyse de leurs structures chimiques

La purification de bactériocines

Leur utilisation dans le domaine médical et biotechnologique.
67
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81
Annexes
Annexe I : procédé de préparation du J‘ben
Lait cru
Coagulation/ acidification
Caillage
Égouttage
Salage
Procédé de préparation de J‘ben
Annexes
Annexe II : Préparation des dilutions décimales, isolement, conservation et
identification (Badis et al., 2006)
Annexes
Annexe III : Protocole de coloration de Gram
Technique

Réaliser un frottis et fixer le.

Plonger la lame dans le violet de gentiane (ou cristal violet) phéniqué pendant 1
minute.

laver la lame à l‘eau distillée.

plonger la lame dans une solution de lugol pendant 1 minute

Laver à l‘eau distillée

Décolorer dix secondes à l‘alcool.

Rincer immédiatement a l‘eau distillée

Plonger la lame dans la safranine (ou la fuchsine) phéniquée pendant 1 minute

Laver la lame à l‘eau distillée.

Sécher la lame en la tamponnant avec du papier Joseph.

Observer à l‘objectif x100 à l‘immersion dans l‘huile.
Annexes
Annexe IV : Conservation longue durée des bactéries lactiques (Badis et
al.,2005)
Culture jeune de 18h sur milieu bouillon MRS
Centrifugation à 4000 tr/min pendant 10min
Culot est additionné de 10ml de milieu de conservation (7ml de MRS + 3ml de glycerol)
Répartition dans des eppendorfs
Conservation au congélateur
Annexes
Annexe V : Protocole de profil fermentaire (utilisation de sucre) (Badis et al.,
2006)
Annexes
Annexe VI : Composition des diluants (g/l)
Eau physiologique peptonée
Peptone
Chlorure de sodium
Eau distillée
1g
8,5g
1000 ml
Eau physiologie 9 /ml:
NaCl
Eau distillée
9g
1000 ml
Annexe VII : Composition des milieux de cultures (g/l)
Milieux solides
 Milieu MRS (de Man Rogosa et Sharpe, 1960)
Extrait de levure
5g
Extrait de viande
5g
Peptone
10 g
Acétate de sodium
5g
Citrate de sodium
2g
Glucose
20g
KH2PO4
2g
MgSO4
.0.1g
MnSO4 .
0.05 g
Agar
12g
Tween80
1 ml
Eau distillée
1000 ml
pH=6.50.2 à 37°C
Autoclavage : 121°C /15min.
MRS semi solide : agar 7g
 Milieu M-17
Extrait de levure
2,5g
Extrait de viande
5g
Peptone de caséine
2, 5g
Peptone de viande
2, 5g
Peptone de soja
5g
Peptone de soja
5g
Acide ascorbique
0, 5g
Β-glycérophosphate de sodium
19g
Agar
. 12, 75g
Sulfate de magnésium
0.25g
Eau distillée
.
1000 ml
Annexes
pH=7.10.2 à 37°C
Autoclavage : 121°C pendant 15min.
 Milieu MSE (Mayeux, Sandine et Elliker, 1962)
Tryptone
Gélatine
Extrait de levure
Saccharose
Glucose
Citrate de sodium
Azide de sodium
Agar-Agar
Eau distillée
pH 6,8

20 g
2.5 g
5g
100 g
5g
1g
0.075 g
15 g
1000 ml
Autoclavage 120°C/ 20 minute
Milieu KMK (Kempler et Mc Kay, 1980)
Extrait de levure
Biopolytone
Glucose
Agar
Eau distillée
pH 6.6
3g
2,5g
5g
15 g
1000 ml
Le milieu est réparti à raison de 100 ml par flacon, puis autoclavé 15 minutes à 121°C.
Au moment de l‘emploi on ajoute :
1 ml d‘une solution aqueuse de ferricyanide de potassium 10 % (p/v)
1 ml d‘une solution aqueuse à 2.5 % (p/v) de citrate ferrique et citrate de sodium (p/p)
Ces solutions sont stérilisées par filtration sur filtre millipore 0.22 μm et sont
conservées à l‘obscurité à 4°C.

Milieu M16 BCP (Thomas, 1973)
Extrait de levure
2,5 g
Extrait de viande
5g
Peptone
10 g
Acide ascorbique
0,5 g
Lactose
2g
L-arginine
4g
Pourpre de Bromocrésol
0,05 g
Agar-Agar
15 g
Eau distillée
1000 ml
pH 6,8
Autoclavage 120°C pendant 20 minutes
Annexes

Milieu Mueller-Hinton (Mueller et Hinton, 1941)
Infusion de viande de bœuf
3000 cm3
Peptone de caséine
17,5 g
Amidon de mais
1,5 g
Agar-agar
17 g
pH 7.4
Autoclavage 120°C/ 20 minutes

Gélose nutritive
Extrait de viande
Extrait de levure
Peptone
Chlorure de sodium
Agar-agar
Eau distillée
pH 7,4
1g
2g
5g
5g
15 g
1000 ml
Autoclavage 120 °C pendant 20 minutes
 Milieux liquides

Milieu MRS BCP
MRS (milieu liquide) moins l‘extrait de viande et sans sucre 1000 ml
Bromocrésol pourpre
0,025 mg
pH 7.0
Autoclavage 120°C/ 20 minutes

Bouillon nutritif
Extrait de viande
1g
Extrait de levure
2g
Peptone
5g
Chlorure de sodium
5g
Eau distillée
1000 ml
pH 7,4
Autoclavage 120 °C pendant 20 minutes

Lait écrémé
Lait en poudre
Eau distillée
Extrait de levure
110 g
1000 ml
3g
Annexes
Autoclavage 110°C pendant 10 minutes
 Cervelle -cœur
Proteose péptone
10g
Infusion de cervelle de veau
12,5g
Infusion de cœur de bœuf
5g
NaCl
1g
Phosphate disodique
2,5g
Glucose
2g
Eau distillée
1000 ml
pH 7,4
Autoclavage 120 °C pendant 20 minutes
Tampon phosphate de sodium
Solution (a) : 27.8g NaH2PO4 dans 100ml d‘eau distillée.
Solution (b) : 53.65g Na2HPO4 dans 100ml d‘eau distillée.
Tampon 0.1 M : 39ml solution (a) + 61 ml solution (b).
Stérilisation à 1100C pendant 20mn.
Résumé
Les bactéries lactiques font l‘objet de recherche dans les laboratoires en Algérie, vue leur importance et leur intérêt
dans l‘alimentation et la santé humaine.
Pendant leur croissance les bactéries lactiques produisent de nombreux métabolites aux propriétés
antimicrobiennes tels que les acides organiques, le peroxyde d‘hydrogène, le dioxyde de carbone, la reutérine et le diacétyl
Parmi ces substances produites, des peptides antimicrobiennes dites bactériocines à faible poids moléculaire ayant des
propriétés inhibitrices contre les bactéries proches et lointaines de la souche productrice. Elles sont sécrétées par les Gram
positifs. Se caractérisent par un spectre d‘action étroit.
Notre étude a pporté sur la recherche et la caractérisation des bactériocines produit par les bactéries lactique isolées
apartir de J'ben .
Vingt deux souches de bactéries lactiques ont été isolées sur les milieux M17 et MRS.les souches ont pu être
identifiées aux genres:Lactococcus , Leuconostoc , Lactobacillus et Enterococcus. 15 souches de bactéries lactiques ont été
selectionné pour leur pouvoir antimicrobien capable d'inhiber la croissance des Staphylococcus aureus , Escherichia coli ,
Pseudomonas aerogenosa par la production des bactériocine remarqué par l'aparition des zones d'inhibition .
Une carastérisation physico-chimique nous a permis d'observer que les bactériocines étudiée présentent une forte
thermorésistanse (thraitement a 70°C 90°C 110°C pendant 20 min ) .Ces substances inhibtrices sont entiérement detruite
sous l'action des enzymes protéolytique
Ces propreities suggérent que cette bactériocine appartient à la classe II(bactériocine-lik).
Les produits laitiers traditionnels constituent une source de nouvelles souches antimicrobiennes.
Mots clé : J'ben, bactéries lactique, bactériocine ,activité antimicrobienne ,bactérie pathogène
Abstrat
Lactic acid bacteria are the subject of research in laboratories in Algeria, for their importance and their interest in
food and human health.
As they grow lactic acid bacteria produce numerous metabolites with antimicrobial properties such as organic
acids, hydrogen peroxide, carbon dioxide, and diacetyl reuterin These substances produced antimicrobial peptides called low
molecular weight bacteriocins having inhibitory properties against bacteria near and far from the producer strain. They are
secreted by Gram-positive. Are characterized by a narrow spectrum of action.
Our study made on the research and characterization of bacteriocins produced by lactic bacteria isolated apartir of
J'ben..
Twenty two lactic acid bacterial strains were isolated on M17 MRS meduim . strains were identified to genera
Lactococcus, Leuconostoc, Lactobacillus and Enterococcus. 15 strain of lactic acid bacteria were selected for their
antimicrobial capacity capable of inhibiting the growth of Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Pseudomonas
aerogenosa by the production of bacteriocin by the aparition observed zones of inhibition.
Physicochemical carastérisation allowed us to observe that the studied bacteriocins exhibit strong thermorésistanse
(thraitement 70 ° C 90 ° C 110 ° C for 20 min) .These inhibtrices substances are entirely destroyed by the action of
proteolytic enzymes
These propreities suggest that this bacteriocin belongs to the class II (bacteriocin-lik).
The traditional dairy products are a source of new antimicrobial strains.
Keywords: J'ben, lactic acid bacteria, bacteriocins, antimicrobial activity, bacterial pathogen.
‫الملخص‬
‫ ألهميتهب انغذائيت وانصحيت‬،‫تعتبز بكتيزيب حمط انهبه مىظىع بحث في انمختبزاث انجشائزيت‬
،‫ بيزوكسيذ انهيذروجيه‬،‫خالل ومى بكتيزيب حمط انالكتيك تىتج انعذيذ مه وىاتج األيط مع خصبئص معبدة نهميكزوببث مثم األحمبض انععىيت‬
‫هذي‬،bacteriocines
‫ ثىبئي األسيتيهت وانزوتزيه كمب تىتج مىاد ببتيذيت معبدة نهميكزوببث مىخفعت انىسن انجشيئي تسمى‬،‫ثبوي أكسيذ انكزبىن‬
.‫ ويفزس مه قبم انجزاو إيجببيت‬.‫االخيزة نهب خصبئص مثبطت ظذ انبكتيزيب انقزيبت وانبعيذة مه ا نسالنت انمىتجت‬
. ‫ التً تنتجها البكتٌرٌا اللبنٌة معزولة من جبن تقلٌدي‬bacteriocines ‫تركزت دراستنا على البحث وتوصٌف‬
‫ ساللة بكتٌرٌة حمض اللبنٌك اوساط‬22 ‫فً تم عزل‬
Lactococcus‫ و‬Leuconostoc, Lactobacillus , Enterococcus‫ وتم تحدٌد سالالت ألجناس‬MRS‫ و‬M17
‫ ساللة من بكترٌا حمض الالكتٌك قادرة على إنتاج مضادات المٌكروبات تم بها على تثبٌط النمو و ه ذا من خالل مالحظة‬15
. ‫مناطق التثبٌط‬
‫ سمح لنا أن نالحظ احتمالها لدرجة حرارة عالٌة مع تثبٌطها‬bacteriocines ‫دراسة الخصائص الفٌزٌائٌة‬
. ‫بشكل كامل عن طرٌق عمل اإلنزٌمات المحللة للبروتٌن‬
. (bacteriocin-lik). ‫تنتمً هذه المواد المضادة المٌكروبات إلى فئة‬
. ‫منتجات األلبان التقلٌدٌة هً مصدر سالالت جدٌدة منتجة لمضادة المٌكروبات‬
،‫ بكتٌرٌا حمض الالكتٌك‬، ‫ بكتٌرٌا ممرضة‬،bacteriocines ، ‫ جبن تقلٌد‬،‫ نشاط مضادات المٌكروبات‬.:‫كلمات البحث‬