Travail à faire - cloudfront.net

Ndéye Fatou Mbow
ICAA 3
Travail à faire :
 Manipulation à effectuer
 Introduction.
 But.
 Mode opératoire.
 Résultats obtenus.
 Interprétation et discussion.
 Conclusion.
Manipulation a effectué :
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Au cours de cette séance de travaux pratiques, nous avons eu à étudier le
métabolisme glucidique, le métabolisme protidique, et l’étude du type
respiratoire, d’une bactérie (le numéro 13)
Lors de la 2éme séance de manipulation nous avons analysé
microbiologiquement une eau impure.
Introduction :
Les analyses microbiologiques ne sont pas un indicateur fiable à 100 % de la qualité
sanitaire des denrées produites destinées à la commercialisation, la conservation ou la
consommation mais elles sont utiles.
Elles nous renseignent sur le type des micro-organismes que renferme le produit à
analyser car la principale cause de dégradation de ces denrées est les micro-organismes
pathogènes.
C’est dans ce cadre que nous allons d’abord étudier les métabolismes bactériennes en
procédant à l’identification avant de passer à l’analyse alimentaire.
But :
Le but du TP consiste :
Pour la première séance :
 étudier le métabolisme de la bactérie
Pour la deuxième séance
à faire une analyse microbiologique d’une eau souillée :
 Dénombrement des flores aérobies mésophiles totaux sur milieu PCA.
 Dénombrement des coliformes totaux sur milieu DCL 1pour mille
Mode opératoire :
L’étude des métabolismes
Pour l’étude du métabolisme glucidique =étude de la voie d’attaque des glucides.
On utilise le milieu Hajna-Kliger , qui permet la recherche de plusieurs caractères
biochimique notamment l’utilisation du glucose (culot), l’utilisation du lactose (pente)
,production de H2S , production de gaz.
Mode d’ensemencement
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Etape préliminaire, d’abord prendre une colonie dans la boite de pétrie 13 la mettre dans de
l’eau physiologique. Ensuite ensemençons abondamment la surface par stries serrées, puis le
culot par simple piqure, à l’aide de la même pipette boutonnée. Dévissons partiellement la
capsule afin de permettre les échanges gazeux. Incubons pendant 24 H à 37ºC.
Lorsque l’on utilise le milieu Hugh et Leifson, un milieu semi solide agar qui
permet de voir si la bactérie catabolise le glucose par voie fermentaire (en l’absence
d’oxygène) ou par voie oxydative (en présence d’oxygène).
Mode d’ensemencement
Apres l’étape préliminaire, régénérons nos 2 milieux au bain marie bouillant à 45 -50 ºC.
Ajoutons aseptiquement dans l’un des tubes 3gouttes de la suspension bactérienne et 7gouttes
de glucose 1% refermons le tube agitons légèrement avant de refermer le tube ne pas serrer le
bouchon afin de permettre les échanges gazeux. Dans le 2nd tube faisons la même expérience
mais rajoutons y une couche de paraffine de 2cm de hauteur. Incubons pendant 24 H à 37ºC.
Cette fois si on utilise le milieu Mannitol mobilité nitrate .Le mannitol est un sucre
réducteur composé par la liaison du glucose et du fructose. La bactérie va dégrader le
mannitol pour libérer le glucose qui sera sa seule source de carbone .La dégradation du
glucose s’accompagne de l’acidification du milieu le rouge de phénol devient jaune. Pour
l’étude de la mobilité on observe si la bactérie s’est déplacée et à poussée tout au tour de la
tube.
Mode d’ensemencement
Pour ce ensemencement pas de régénération du milieu , on fait une piqure centrale dans le
tube ensuite incubons pendant 24 H à 37ºC.
Le milieu Clark Lubs permet l’étude de la voir de fermentation du glucose. Avec les
produits de dégradation après fermentation. Les produits de fermentation peuvent être des
acides mixtes qui sont mis en évidence par le test RM (Rouge de Méthyle), ou des acétoines
qui sont mis en évidence par le test VP (Voges –Proskauer).
Mode d’ensemencement
Etape préliminaire, d’abord prendre une colonie dans la boite de pétrie 13 la mettre dans de
l’eau physiologique. Ensuite ensemençons largement, à l’aide de la pipette boutonnée.
Dévissons partiellement la capsule afin de permettre les échanges gazeux. Incubons pendant
24 H à 37ºC. Après les 24h avant la lecture des résultats faire le test (VP) c'est-à-dire
ajoutons à chaud 2 gouttes alpha-naphtol +2gouttes de KOH dans l’un des tubes.
Dans le second tube faisons le test RM en ajoutant 2 à 3 gouttes de rouge de méthyl. Passons
à la lecture.
Tableau récapitulatif des résultats
Milieu de culture
Résultat
Coloration
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départ
/arrivée
Hajna –kliger
Glucose +
Rouge/Jaune
Glucose sur le culot et lactose sur la
pente
Lactose +
Rouge/Jaune
H2S -
Pas de noirceur
Production de
gaz +
Séparation du
milieu
Hugh et Leifson
Tube sans
paraffine :
Glucose +.
Vert/ Jaune
Tube avec
paraffine :
Mannitol mobilité nitrate
Glucose -
Vert/ Vert
Mannitol +
Rouge/Jaune
Mobilité +
Clark et Lubs
RM+
…./Rouge
VP +
…./Rouge
Pour l’étude du métabolisme protidique =étude de la voix d’attaque des protéines.
On commence avec le milieu Uree-Indole . L’urée est hydrolysée par l’uréase, que
l’on recherche avec production d’indole. Pour l’uréase la lecture est directe pour l’indole on
ajoute quelques gouttes de réactifs de kovaks. Pour la mise en évidence du TDA on met du
FeCl.
Mode d’ensemencement
On ensemence directement une colonie dans le milieu puis on incube a à 37°C pendant 24H.
Ensuite on enchaine avec le milieu Citrate de Simons .Ce milieu est un exemple de
milieu synthétique, c'est-à-dire le milieu dont la composition, qui est complexe, est connue
exactement tant qualitativement que quantitativement. Le caractère recherché est l’utilisation
de citrate comme seul source de carbone.
Mode d’ensemencement
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La pente est ensemencée par une strie longitudinale, réalisée à l’anse, à partir d’une
suspension de la culture solide. Ne pas visser le bouchon à fond, afin de permettre les
échanges gazeux. Mettre à l’étuve a 37°C pendant 24h.
Les milieux L.D.C. ; O.D.C. ;A.D.H.et témoin ces milieux sont utilisés pour la
recherche des décarboxylases et dihydrolases bactériennes. Ces milieux sont tous 4constitués
d’eau distillée à la base de pourpre de bromocrésol de glucose et de NaCl , d’extrait de levure.
Pour le ODC il y a L-ornithine comme acide aminé, pour le ADH il y a le L-arginine comme
acide aminé et enfin pour le LDC il y a le L-lysine comme acide aminé.
Mode d’ensemencement
Apres l’étape préliminaire mettre une goutte de la suspension bactérienne dans les 4
tubes et incubons à 37°C pendant 24h .
Tableau récapitulatif des résultats
Milieu de culture
Résultat
Coloration
départ
/arrivée
Uréé-indole
Uréase -
Jaune /Jaune
Indole +
Jaune/Annau
rouge
Jaune/Jaune
TDA -
Citrate de Simons
Milieu Témoin
Citrate de
simons -
Jaune / Jaune
Milieu ODC
Milieu ADH
Milieu LDC
-
-
+
+
Jaune/Jaune
Jaune/Jaune
Jaune/Violet
Jaune/Violet
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Maimona Kane
Ndéye Fatou Mbow
 L’analyse microbiologique d’une eau souillée
Dilution
Les dilutions consistent à atteindre la concentration la plus faible pour effectuer une bonne
analyse microbiologique de notre échantillon d’eau souillée.
Pour l’obtention de la dilution 100 : On prélève 1ml du produit à analyser à l’aide d’une
pipette graduée stérile et on le met dans la boite de pétri PCA .
Pour l’obtention de la dilution 10-1 : On prélève 1ml du produit à analyser à l’aide d’une
pipette graduée stérile qu’on va ajouter à 9ml d’eau physiologique puis homogénéiser bien le
contenu ; à partir de ce tube et avec la même pipette on prélève 1ml du produit et on le met
dans la boite de pétri PCA .
Pour l’obtention de la dilution 10-2: On prélève 1ml du tube de la dilution précédente (10 -1)
à l’aide de la même pipette qu’on va ajouter à un tube contenant 9ml d’eau physiologique ; on
jette la pipette. A l’aide d’une nouvelle pipette graduée stérile, on prélève 1ml du produit de ce
tube et on le met dans la boite de PCA .
A partir de la dilution 10-2 et de la même façon, on prépare les autres dilutions jusqu’à 10 -5
pour le milieu PCA et 10-3 pour le milieu DCL.
Remarque :
 Les manipulations doivent être faites dans la zone stérile.



Les dilutions doivent être faites en milieu aseptique.
Homogénéiser bien les tubes entre chaque dilution.
Changer les pipettes après chaque dilution.
L’ensemencement :
a) Dénombrement en profondeur : Milieu PCA.
A l’aide d’une pipette graduée stérile on prélève 1ml dans chaque tube qu’on va
ensemencer dans la boite de pétri correspondante a la dilution sur laquelle on va :
 écouler le milieu PCA fondu et refroidi à 45-50°C ;
 homogénéiser légèrement ;
Laisser se solidifier ;
 Laisser se solidifier à nouveau; ensuite retourner les boites de Pétri ;
 Incuber à l’étuve réglée à 37°C pendant 24 heures ;
b) Dénombrement en profondeur : Milieu DCL
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A l’aide d’une pipette graduée stérile on prélève 1ml dans chaque tube qu’on va
ensemencer dans la boite de pétri correspondante a la dilution sur laquelle on va :
 écouler le milieu DCL fondu et refroidi à 45-50°C ;
 homogénéiser légèrement ;
 Laisser se solidifier ;
 Laisser se solidifier à nouveau; ensuite retourner les boites de Pétri ;
 Incuber à l’étuve réglée à 37°C pendant 24 heures.
Tableau récapitulatif des résultats
10-3
Flore Bactérienne
F .A.M.T.
219/214
Colliformes totaux
82/81
10-4
29/30
:
Nombre de germe /ml = n ×taux de dilution.
Nombre de colonies = 219 /214
Taux de dilution
= 10-3
nombre de germes FAMT = 219×103 UFC
FAMT = 214×103 UFC
Nombre de germe /ml = n ×taux de dilution×10.
Nombre de colonies …………..= 29/30
nombre de Colliformes totaux= 29×104 UFC
Dilution ………………………..= 10-4
=30×104 UFC
Interprétation :
Au prima bord l’ensemencement sur la gélose nutritive nous a permis de montrer la
pureté de la souche. Elle s’est effectuer en repiquant une colonie dans une eau
physiologique ensuite en l’ensemençant sur une boite de pétrie a 37°C pendant 24h. les
résultats obtenus, pour le métabolisme glucidique, la bactérie utilise d’abord le glucose
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comme source de carbone ensuite il scinde le lactose pour dégrader le glucose .Elle
possède donc la Bétagalactosidase .La production de gaz est compréhensif car la
dégradation du lactose s’accompagne avec production de CO2 .Pour le milieu High
Leifson , la dégradation du glucose s’est faite par voie oxydative, donc on peux en
conclure que la bactérie est aérobie .Pour le tube contenant la paraffine , nous n’avons pas
eu décoloration car cela est due a une erreur de manipulation car nous avons pas rajouter
de glucose et de suspension bactérienne. Pour le milieu Mannitol mobilité nous pouvons
dire que la bactérie possède l’enzyme qui permet de dégrader le mannitol en glucose et
fructose, afin d’utiliser le glucose comme source de carbone. Nous avons à faire à une
bactérie mobile. Le milieu Clark-Lubs nous a permis de nous rendre compte que les
produis de dégradation âpres la fermentation du glucose par la bactérie sont les acides
mixtes et les acétoines. Pour le métabolisme protéique ma souche ne possède pas d’uréase
donc l’urée ne sera pas dégradée, cependant il possède de l’indole. La bactérie ne possède
pas de tryptophane désaminase donc pas de TDA. Pour le mannitol mobilité nitrate pour
étudier l’étude de la dégradation du nitrate on se penche sur le bouillon nutritive
nitraté .On ajoute 3 gouttes de griess 1 griess2 si il y a coloration rouge présence de nitrate
réductase si non on met du zinc si il y a coloration rouge alors la bactérie n’ a pas de
nitrate réductase si il n’y a pas de coloration alors la bactérie a dégradée le nitrate en
nitrite puis le nitrite en azote donc la bactérie est nitrate réductase + nitrite réductase
+.Lors de notre manipulation la bactérie étudiée est nitrate réductase + car après ajout de 3
gouttes de griess 1 griess2 . Il y a coloration rouge. Pour le citrate Simmons la bactérie a
trouvé une autre source de carbone. Les milieux de Falkov nous permettent de dire que
notre bactérie possède les enzymes qui permettent la dégradation des 2 acides aminés qui
sont le L-arginine et le L-lysine.
Pour notre eau souillée elle est vraiment souiller avec les indices de
contaminations fécaux, elle ne doit pas être ni consommer ni commercialiser.
Conclusion :
A partir des résultats obtenues, on peut conclure que l’eau est contaminé par les germes
totaux et elle ne doit pas être consommé ni commercialiser. Les bactéries présentent une
activité métabolique importante et très intéressante à étudier.
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