Travail à faire - cloudfront.net

Ndéye Fatou Mbow
ICAA 3
Travail à faire :
Manipulation à effectuer
Introduction.
But.
Mode opératoire.
Résultats obtenus.
Interprétation et discussion.
Conclusion.
Manipulation a effectué :
1

Au cours de cette séance de travaux pratiques, nous avons eu à étudier le
métabolisme glucidique, le métabolisme protidique, et l’étude du type
respiratoire, d’une bactérie (le numéro 13)
Lors de la 2éme séance de manipulation nous avons analysé
microbiologiquement une eau impure.
Introduction :
Les analyses microbiologiques ne sont pas un indicateur fiable à 100 % de la qualité
sanitaire des denrées produites destinées à la commercialisation, la conservation ou la
consommation mais elles sont utiles.
Elles nous renseignent sur le type des micro-organismes que renferme le produit à
analyser car la principale cause de dégradation de ces denrées est les micro-organismes
pathogènes.
C’est dans ce cadre que nous allons d’abord étudier les métabolismes bactériennes en
procédant à l’identification avant de passer à l’analyse alimentaire.
But :
Le but du TP consiste :
Pour la première séance :
étudier le métabolisme de la bactérie
Pour la deuxième séance
à faire une analyse microbiologique d’une eau souillée :
Dénombrement des flores aérobies mésophiles totaux sur milieu PCA.
Dénombrement des coliformes totaux sur milieu DCL 1pour mille
Mode opératoire :
L’étude des métabolismes
Pour l’étude du métabolisme glucidique =étude de la voie d’attaque des glucides.
On utilise le milieu Hajna-Kliger , qui permet la recherche de plusieurs caractères
biochimique notamment l’utilisation du glucose (culot), l’utilisation du lactose (pente)
,production de H2S , production de gaz.
Mode d’ensemencement
2

Etape préliminaire, d’abord prendre une colonie dans la boite de pétrie 13 la mettre dans de
l’eau physiologique. Ensuite ensemençons abondamment la surface par stries serrées, puis le
culot par simple piqure, à l’aide de la même pipette boutonnée. Dévissons partiellement la
capsule afin de permettre les échanges gazeux. Incubons pendant 24 H à 37ºC.
Lorsque l’on utilise le milieu Hugh et Leifson, un milieu semi solide agar qui
permet de voir si la bactérie catabolise le glucose par voie fermentaire (en l’absence
d’oxygène) ou par voie oxydative (en présence d’oxygène).
Mode d’ensemencement
Apres l’étape préliminaire, régénérons nos 2 milieux au bain marie bouillant à 45 -50 ºC.
Ajoutons aseptiquement dans l’un des tubes 3gouttes de la suspension bactérienne et 7gouttes
de glucose 1% refermons le tube agitons légèrement avant de refermer le tube ne pas serrer le
bouchon afin de permettre les échanges gazeux. Dans le 2nd tube faisons la même expérience
mais rajoutons y une couche de paraffine de 2cm de hauteur. Incubons pendant 24 H à 37ºC.
Cette fois si on utilise le milieu Mannitol mobilité nitrate .Le mannitol est un sucre
réducteur composé par la liaison du glucose et du fructose. La bactérie va dégrader le
mannitol pour libérer le glucose qui sera sa seule source de carbone .La dégradation du
glucose s’accompagne de l’acidification du milieu le rouge de phénol devient jaune. Pour
l’étude de la mobilité on observe si la bactérie s’est déplacée et à poussée tout au tour de la
tube.
Mode d’ensemencement
Pour ce ensemencement pas de régénération du milieu , on fait une piqure centrale dans le
tube ensuite incubons pendant 24 H à 37ºC.
Le milieu Clark Lubs permet l’étude de la voir de fermentation du glucose. Avec les
produits de dégradation après fermentation. Les produits de fermentation peuvent être des
acides mixtes qui sont mis en évidence par le test RM (Rouge de Méthyle), ou des acétoines
qui sont mis en évidence par le test VP (Voges –Proskauer).
Mode d’ensemencement
Etape préliminaire, d’abord prendre une colonie dans la boite de pétrie 13 la mettre dans de
l’eau physiologique. Ensuite ensemençons largement, à l’aide de la pipette boutonnée.
Dévissons partiellement la capsule afin de permettre les échanges gazeux. Incubons pendant
24 H à 37ºC. Après les 24h avant la lecture des résultats faire le test (VP) c'est-à-dire
ajoutons à chaud 2 gouttes alpha-naphtol +2gouttes de KOH dans l’un des tubes.
Dans le second tube faisons le test RM en ajoutant 2 à 3 gouttes de rouge de méthyl. Passons
à la lecture.
Tableau récapitulatif des résultats
Milieu de culture Résultat Coloration
3

départ
/arrivée
Hajna –kliger
Glucose sur le culot et lactose sur la
pente
Glucose +
Lactose +
H2S -
Production de
gaz +
Rouge/Jaune
Rouge/Jaune
Pas de noirceur
Séparation du
milieu
Hugh et Leifson Tube sans
paraffine :
Glucose +.
Tube avec
paraffine :
Glucose -
Vert/ Jaune
Vert/ Vert
Mannitol mobilité nitrate Mannitol +
Mobilité +
Rouge/Jaune
Clark et Lubs RM+
VP +
…./Rouge
…./Rouge
Pour l’étude du métabolisme protidique =étude de la voix d’attaque des protéines.
On commence avec le milieu Uree-Indole . L’urée est hydrolysée par l’uréase, que
l’on recherche avec production d’indole. Pour l’uréase la lecture est directe pour l’indole on
ajoute quelques gouttes de réactifs de kovaks. Pour la mise en évidence du TDA on met du
FeCl.
Mode d’ensemencement
On ensemence directement une colonie dans le milieu puis on incube a à 37°C pendant 24H.
Ensuite on enchaine avec le milieu Citrate de Simons .Ce milieu est un exemple de
milieu synthétique, c'est-à-dire le milieu dont la composition, qui est complexe, est connue
exactement tant qualitativement que quantitativement. Le caractère recherché est l’utilisation
de citrate comme seul source de carbone.
Mode d’ensemencement
4

La pente est ensemencée par une strie longitudinale, réalisée à l’anse, à partir d’une
suspension de la culture solide. Ne pas visser le bouchon à fond, afin de permettre les
échanges gazeux. Mettre à l’étuve a 37°C pendant 24h.
Les milieux L.D.C. ; O.D.C. ;A.D.H.et témoin ces milieux sont utilisés pour la
recherche des décarboxylases et dihydrolases bactériennes. Ces milieux sont tous 4constitués
d’eau distillée à la base de pourpre de bromocrésol de glucose et de NaCl , d’extrait de levure.
Pour le ODC il y a L-ornithine comme acide aminé, pour le ADH il y a le L-arginine comme
acide aminé et enfin pour le LDC il y a le L-lysine comme acide aminé.
Mode d’ensemencement
Apres l’étape préliminaire mettre une goutte de la suspension bactérienne dans les 4
tubes et incubons à 37°C pendant 24h .
Tableau récapitulatif des résultats
Milieu de culture Résultat Coloration
départ
/arrivée
Uréé-indole Uréase -
Indole +
TDA -
Jaune /Jaune
Jaune/Annau
rouge
Jaune/Jaune
Citrate de Simons Citrate de
simons -
Jaune / Jaune
Milieu Témoin Milieu ODC Milieu ADH Milieu LDC
-
Jaune/Jaune
-
Jaune/Jaune
+
Jaune/Violet
+
Jaune/Violet
5