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Taxonomie = Systématique: science qui étudie la diversité des êtres vivants ainsi que les relations qui existent entre eux. Elle recouvre 3 domaines différents: la classification, la nomenclature et l’identification. Elle consiste à: Caractériser les bactéries, Les classer sur la base de leur similitude, en groupes ou taxons (genres, espèces) Appliquer le code international de la nomenclature bactérienne pour les nommer (Exp: Escherichia coli,) Identifier de nouveaux organismes et déterminer leur appartenance ou non à l’une des espèces connues. Règne Procaryotes Domaine Bacteria Phylum Firmicutes Classe Bacilli Clostridia Sous-classe Ordre Archaea Actinobacteria Euryarchaeota Actinobacteria Methanomicrobi a Actinobacteridae Lactobacillales Bacillales Clostridiales Sous-ordre Actinomycetales Methanosarcina -les Micrococcineae Famille Enterococcaceae Staphylococcaceae Clostridiaceae Micrococcaceae Methanosaetaceae Genre Enterococcus Staphylococcus Clostridium Micrococcus Methanosaeta Espèce avium durans faecalis faecium gallinarum solitarius aureus acetobutylicum aerotolerans bifermentans botulinum perfringens mucilaginosis concilii harundinacea Methanothrix thermophila Principe: Tout individu appartient à une espèce, Les espèces proches sont groupées en un genre Les genres rapprochés sont réunis en une famille, Les familles présentant des similitudes forment un ordre Les ordres apparentés sont rangés en une classe, Les classes semblables sont réunies en une division ou phylum Phylum CLASSE ORDRE « ales » FAMILLE « aceae » GENRE « us», « er », « a » ESPECES SOUCHES BIOTYPES LYSOTYPES SEROTYPES PATHOTYPES GENOTYPES TOXOTYPES TP1: La famille des Enterobacteriacae : IDENTIFICATION BIOCHIMIQUE GENERALITES On définit classiquement les entérobactéries par 7 critères: -Bacilles Gram- de dimension moyenne -Non exigeants (culture facile) -Oxydase négative. -Nitrate réductase + (capables de réduire les nitrates en nitrites) -Aéro-anaérobies facultatifs(capables de pousser en présence ou en absence de dioxygène) -Voie fermentaire de dégradation du glucose (avec ou sans production de gaz) -Immobiles ou mobiles par ciliature péritriche -Non sporulés I- Etude du Métabolisme Energétique 1-Etude du type respiratoire Incubation 24 h à 37°C Milieu VF avant utilisation ABCD- Résultat Si elle pousse le long du tube => Bactérie aérobie anaérobie facultative Si la bactérie pousse à la surface du tube => Bactérie aérobie stricte Si la bactérie pousse dans une zone intermédiaire => Bactérie micro aérophile Si la bactérie pousse au fond du tube => Bactérie anaérobie stricte - Technique de recherche de l’Oxydase N-N dimethylparaphénylène diamine Pipette Pasteur Aucune Tache Oxydase - Tache violette Oxydase + II- Etude du métabolisme glucidique: Voies d’attaques des Glucides Etude effectué sur milieu Hugh et Leifson : milieu semi liquide contenant un indicateur de PH : le Bleu de bromothymol ou le rouge de phénol. -Les bactéries peuvent utilisées le Glucose selon 2 voies: Voie Fermentative : la Réaction se déroulent en absence d’oxygène provoquant une baisse de pH du milieu suite à la formation d’acide Voie Oxydative: l’oxygène de l’air est obligatoirement utilisé , donc il y a peu d’acide formé et l’acidification aura lieu uniquement à la surface Le milieu reste tel qu’il était avant ensemencement. Il n’y a pas de culture. Les bactéries sont inertes vis-à-vis du glucose - Technique Aucun virage dans les 2 tubes Germe inactif vis à vis du Glucose Virage au jaune débutant dans le tube ouvert Incubation Ouvert Milieu Hugh et Leifson + Glucose Ensemencement (+ 48h à 37°C Virage de l’indicateur de pH au jaune dans tout le tube. Le milieu est devenu acide. Il y a eu production d’acides lors de l’utilisation du glucose par les bactéries en présence et en absence d’O2. Fermé: Les bactéries sont Huile de paraffine) fermentatives vis-à-vis du glucose. Virage de l’indicateur de pH au jaune dans la partie supérieure du tube. Le milieu est devenu acide. Il y a utilisation du glucose par les bactéries en présence d’ O2. Les bactéries sont oxydatives vis-à-vis du glucose. Virage au jaune dans les 2 tubes 3- Recherche de la Nitrate réductase : Bouillon Nitrate (NO 3 - ) NO 3 - + 2H + + 2 e NO 3- + 6 H + + 5 e - Nitrate Réductase NO2-+ H2 0 Stade Nitrite Nitrite Réductase ½ N2 + 3 H2 O Stade Azote : Stade Gazeux Technique Virage au Rouge Stade Nitrite => Nitrate Réductase + Ensemencement 24h à 37°C Bouillon Nitrate (NO 3 Virage au Rouge Nit1 +Nit2 Nitrate Réductase Ajout de Zinc -) Pas de virage : Stade Azote Nitrate Réductase + Ex: Pseudomonas Le Zn a la propriété de réduire les nitrates en nitrite. Cet ajout va répondre à deux interrogations : -premier cas : la bactérie ne possède pas la nitrate réductase. L'ajout de Zn va réduire les nitrates en nitrites qui vont réagir avec les réactifs de Griess (Nit1 et Nit2) - deuxième cas : la bactérie possède une nitrate réductase très active qui a réduit les nitrates jusqu'au stade azote moléculaire N2(=diazote). Dans ce cas l'ajout de Zn ne provoquera pas la réduction des nitrates car il n'en reste plus dans le milieu. 4- Recherche de l’Uréase, Tryptophanase et Tryptophane désaminase (TDA): Milieu Urée Indole -Recherche de l’Uréase Coloration orange jaune : pas d’hydrolyse de l’Urée Uréase Ensemencement Incubation 24h à 37°C Milieu Urée Indole Coloration Rouge : hydrolyse de l’Urée Uréase + - Recherche de la Tryptophane Désaminase: TDA Tryptophane + H2O TDA Acide Indole pyruvique Quelques gouttes de chlorure de Fer III Urée Indole Si précipité marron: la bactérie a dégradé la tryptophane avec la tryptophane désaminase TDA + Absence de précipité : La bactérie n'a pas dégradé la tryptophane avec la TDA TDA- - Recherche de la Tryptophanase Tryptophanase Tryptophane Ammoniac + H2O Indole + Acide 2 –céto-propanoique + Acide pyruvique Réactif de Kovacs -Présence d’un anneau Rouge : Indole + -Absence d’un anneau Rouge : Indole - V- Métabolisme du Lactose: Milieu Kligler–Hajna Ensemencement Milieu rouge qui permet de dégager 4 caractères: L’utilisation du Lactose L’utilisation du Glucose La production de H2S La production de Gaz 1) Piqûre centrale dans le culot Fil droit ou pipette boutonnée 2) Stries serrées sur la pente Öse ou pipette boutonnée 1- La lecture du lactose au niveau de la pente: • Si virage vers le jaune => la bactérie possèdent la βgalactosidase Lac + • Si pente rouge : Bactérie ne possède pas de β Galactosidase Lact 2- la lecture du Glucose au niveau du culot : • Si culot rouge Bactérie Glucose – • Si culot Jaune Bactérie Glucose + 3- Production de H2S à partir du thiosulfate du milieu H2S + Fe III précipité noir ( Sulfure de Fer) => H2S + 4- Production de Gaz : Si il y a présence de bulles ou bien décollement du gélose Gaz + Sinon Gaz - - Lecture du milieu Kligler Hajna Exemple Lactose - - + - Glucose - + + + H2S - + - + Gaz - - + - ONPG ?? - Test à l’ONPG (Ortho Nitro Phényl β Galactoside) La dégradation du lactose par les micro-organismes passe par sa transformation en glucose. Elle n’est possible que s’il y si ces micro-organismes posédent : - La β Galactosidase perméase - La β Galactosidase β Galactosidase Lactose + H2O Si la Bactérie Glu + , Lac - Glucose + Galactose Absence de β Galactosidase Bactérie Lac – (vrai) Présence de β Galactosidase + β Galactoside perméase membranaire défectueuse ONPG (substrat artificielle) Milieu d'ONPG : Ce test permet de rechercher la présence d'une enzyme intracellulaire ß-galactosidase (ONPG hydrolase) qui permet l'hydrolyse du lactose en glucose et galactose. Une bactérie lactose- peut l’être pour 2 raisons : - Absence de ß-galactosidase. - Absence de ß-galactoside perméase Le test ONPG permet de recherche directement la présence de ß-galactosidase en fournissant à la bactérie un substrat de cette enzyme : L'orthonitrophényl- â-D-galactopyranoside. Recherche de la -galactosidase Elle s’effectue sur un tube de Kligler LAC - 1) Le tube reste incolore. absence de la -galactosidase : ONPG - 2) Ajouter stérilement un disque ONPG 1) Faire une suspension épaisse à partir de colonies prélevées sur la pente 3) Incuber à 37°C pendant 30 minutes 2) La suspension est colorée en jaune présence de la galactosidase : ONPG +, mais absence de la perméase. Milieu Citrate de Simmons Ce milieu permet de mettre en évidence l'utilisation du citrate comme seule source de carbone et d'énergie. Ce caractère est intéressant pour discriminer les bactérie entre-elles et ainsi de les identifier. Milieu Mannitol - mobilité - nitrate Caractères lus sur MMN (Mannitol-Mobilité-Nitrate) : - deux caractères sont lus directement : l'utilisation du mannitol et la mobilité de la bactérie. - un caractère est lu indirectement après ajout des réactifs VI- Identification Biochimique des Bactéries :Galerie API 20E 1- Présentation de la galerie Galerie de 20 microtubes prêts à l’emploi permettant de réaliser 23 tests biochimiques afin d’identifier des bacilles Gram – appartenant à la famille des ENTEROBACTERIACEAE. cupule microtube contenant le milieu déshydraté La suspension bactérienne introduite dans le tube dissout les substrats déshydratés 2- Préparation de l’inoculum 1 seule colonie isolement Prélèvement d’une souche pure 5 mL d’ED stérile Suspension d’opacité 0,5 sur l’échelle de Mac Farland 3- Ensemencement de la galerie API 20 E Introduire la suspension bactérienne dans chaque tube à l’aide d’une pipette Pasteur stérile, pointe appuyée à l’intérieur et sur le côté pour éviter la formation de bulles Pour certains caractères: Remplir de suspension le tube et la cupule CIT, VP, GEL Remplir le tube de suspension et recouvrir d’huile de paraffine ADH, LDC, ODC, H2S, URE Les 10 premiers tests Tests négatifs Tests positifs Les 10 derniers tests Tests négatifs Tests positifs 5- Identification de la souche Résultats de la galerie: - 5 2 1 5 7 7 + + 3 Résultats reportés sur la fiche d’identification Code n°: 5 215 773 (55) Se référer au catalogue pour identifier la souche à l’aide du code 5 + + 5
