L`azathioprine dans les maladies inflammatoires

Faculté de médecine
Service de gastro-entérologie
L’azathioprine dans les maladies
inflammatoires chroniques intestinales :
impact de son métabolisme sur
l’efficacité et la sécurité thérapeutique
Olivier Dewit
Thèse présentée en vue de l’obtention du grade de Docteur en
Sciences Biomédicales - Orientation gastro-entérologie
Promoteur : Professeur Yves Horsmans
Co-promoteur : Professeur Jean-Luc Gala
« L’azathioprine dans les maladies inflammatoires
chroniques intestinales : impact de son métabolisme sur
l’efficacité et la sécurité thérapeutique »
Avant-propos et remerciements
p. 4
Liste d’abréviations
6
Liste des figures et tableaux
8
Introduction : aperçu des maladies inflammatoires chroniques de l’intestin
9
Chapitre 1. Les Thiopurines (TP)
16
- 1.1. Historique de leur découverte
16
- 1.2. La famille des Thiopurines : descriptif des différentes molécules
19
1.2.1 : absorption des TP
19
1.2.2 : distribution des TP
21
- 1.3. Métabolisme des Thiopurines : les différentes enzymes impliquées
1.3.1. Thiopurine Méthyltransférase (TPMT)
21
24
a. Génotypage de la TPMT
24
b. Phénotypage de la TPMT
27
c. Corrélation génotype/phénotype.
28
1.3.2. Xanthine Oxydase (XO)
30
1.3.3. Aldéhyde Oxydase (AO)
31
1.3.4. Inosine triphosphate pyrophosphatase (ITPA)
31
1.3.5. Glutathion-S-Transférase (GST)
33
1.3.6. Méthylène tétrahydrofolate réductase (MTHFR)
34
- 1.4. Thiopurines : indications et efficacité dans les MICI et utilisation aux Cliniques
universitaires Saint Luc (analyse d’un échantillon de patients via la base de données)
1.4.1. Indications
36
1.4.2. Utilisation des TP aux Cliniques universitaires Saint Luc chez les patients MICI 37
- 1.5. Effets secondaires des TP
1.5.1 : doses-indépendants ou allergiques
41
a. Pancréatite
41
b. Syndrome grippal, myalgies, arthralgies, rash
44
1.5.2 : doses-dépendants
45
a. Intolérance digestive
45
b. Toxicité médullaire
45
c. Hépatotoxicité
46
2
d. infections
51
e. néoplasies
52
Chapitre 2. Relations entre enzymes du métabolisme des TP et effets secondaires des TP
55
Impact des variations d’activité enzymatique de
2.1. TPMT
55
2.1.1 : activités TPMT basse (LM) ou intermédiaire (IM)
55
Impact d’un génotypage extensif de la TPMT dans la prise en charge de la
myelosuppression induite par les TP chez des patients MICI
2.1.2 : activités TPMT élevé (HM) et ultra-élevée
56
68
2.2. XOD et AO
69
2.3. ITPA
69
2.4. GST
71
2.5. MTHFR
71
Chapitre 3. Relations entre métabolites et efficacité/effets secondaires des TP
73
3.1. Les 6-thioguanine nucléotides (6-TGN)
73
3.2. La 6-méthylmercaptopurine & les 6-méthyl-mercaptopurine ribonucléotides
77
Chapitre 4. Interactions médicamenteuses et Thiopurines
80
4.1. Allopurinol
80
4.2. Aminosalicylés
84
Interaction entre azathioprine et aminosalicylés : étude in vivo chez des patients
souffrant de maladie de Crohn.
85
4.3. Diurétiques
98
4.4. Infliximab
98
4.5. AINS
99
4.6. Méthotrexate
100
4.7. Warfarine
100
Chapitre 5. Recommandations pratiques des analyses du métabolisme des TP
102
5.1. Analyse des enzymes
102
5.2. Analyse des métabolites
103
Conclusions
108
Perspectives
110
Bibliographie
113
Annexes
124
3
Avant-propos et remerciements
La première fois que j’ai entraperçu le métabolisme des thiopurines, il s’agissait d’un schéma griffonné
sur le tableau noir de la salle de repos de l’endoscopie ; j’étais alors en fin de formation en gastroentérologie. Les premières explications me furent données par Yves Horsmans. J’ignorais bien
évidemment à l’époque que ce sujet deviendrait mon sujet de thèse et Yves mon promoteur, bien qu’il
ait accompli cette tâche à maintes reprises pour bien d’autres.
C’est donc bien évidemment à lui que j’adresse mes tous premiers remerciements. Sans son esprit
critique très aiguisé, ses lumières, sa disponibilité, sa capacité à « pousser mon moteur » quand il
s’essouffle ainsi que nos multiples discussions ce travail n’aurait pas abouti.
Je remercie pour leur accompagnement les membres du comité d’encadrement : les professeurs
Bertrand Tombal, Frédéric Houssiau, Dominique Lison, Pierre Hoang et Jean-Luc Gala.
J’exprime toute ma gratitude aux professeurs Laurent Peyrin-Biroulet, du CHU de Nancy et Edouard
Louis du CHU de Liège d’avoir accepté d’être membres du jury ainsi que pour leur lecture attentive de
ce manuscrit.
La réalisation des études décrites dans cette thèse est un travail d’équipe et de nombreuses personnes
sont à remercier :
-
Le laboratoire GAEN et Jean-Pierre Desager pour les techniques d’analyses métaboliques.
-
Le professeur Jean-Luc Gala et son équipe du centre de technologie moléculaire appliquée
pour la réalisation des tests génétiques.
-
Les membres des différents centres du BIRD (Belgian Inflammatory Bowel Disease Research
group) qui ont grandement contribués au recrutement des patients.
-
Christine De Bouvere pour son engagement au quotidien dans la prise en charge des patients
et sa très grande contribution à la base de données.
Je remercie tous les membres du service de gastro-entérologie les Professeurs Pierre Deprez, Hubert
Piessevaux, Peter Starkel, Ivan Borbath, les Docteurs Marie-Armelle Denis, Ziad Hassoun et les
différents consultants, tant pour m’avoir donné la possibilité de libérer du temps pour mener à bien cette
thèse, que pour leurs grandes qualités de collègues et amis. Mention spéciale pour Peter et Hubert pour
leur contribution à l’écriture des articles. Mention très spéciale pour Marie et sa prise en charge de nos
patients MICI.
Je souhaite remercier toutes les personnes qui ont contribués à ma formation de médecin. Parmi eux,
durant ma formation spécifique en gastro-entérologie : les professeurs André Geubel, Robert
Vanheuverzwyn, Jean-Claude Liénard, Jean-Frédéric Colombel et Antoine Cortot du CHU de Lille.
Merci au Professeur René Fiasse pour son engagement inextinguible dans les MICI, ses comptesrendus de lecture et son travail pour l’association des patients Crohn-Rectocolite.
4
Un grand merci à tous les assistants avec qui j’ai travaillé ces douzes dernières années. J’espère avoir
contribué efficacement à leur formation et leur avoir quelque peu inculqué le « goût des MICI ». Je
remercie les docteurs Nicolas de Suray et Bénédicte De Vroey pour leur collaboration passée et à venir,
et tous mes collègues gastro-entérologues qui m’accordent leur confiance dans la prise en charge
directe ou indirecte de leurs patients.
Enfin comment ne pas remercier toutes les personnes qui jalonnent mon quotidien à l’hôpital :
Dominique Vandenbosch et le personnel infirmier d’endoscopie, Annik Uytterhoeven et l’U51, Inès
Peres y Mira et toutes les secrétaires, Marie-Claire Wauthier et ses collègues de l’Unité de
Pharmacologie Clinique. Un immense merci !
La prise en charge des MICI est multidisciplinaire et de nombreux collègues de différentes spécialités
(rhumatologie, de dermatologie,…) sont à remercier. Plus particulièrement nos chirurgiens digestifs : les
professeurs Kartheuser, Detry, les docteurs Remue et Léonard ; nos radiologues, les professeurs
Danse, Annet et le docteur Dragean. Merci de votre disponibilité.
Un grand merci à Véronique Corbisier et à Marc Lefebvre des laboratoires Ferring et MSD pour leur
soutien, notamment, à l’organisation de cette journée.
Une place toute particulière et un remerciement total à Pierre Hoang : quelle chance d’avoir un « ainé »,
gastro-entérologue intéressé par les MICI et la coloproctologie, avec qui discuter parfois de cas « hors
normes » et très souvent d’autres choses : un véritable ami.
A mes parents, à mes sœurs, à ma grande famille, à mes amis que je remercie de leur affection.
J’espère que la fin de cette thèse me permettra d’être plus souvent près de vous.
Cette thèse est dédicacée à Sophie, ma moitié, mes trois-quarts (?) ou mon autre moi-même ainsi qu’à
mes 2 fantastiques enfants, Laure et Antoine, les plus belles choses auxquelles j’ai contribué.JVA.
Olivier Dewit
Bruxelles, le 5 septembre 2012
5
Liste des abréviations
5-ASA : mésalazine, dérivé aminosalicylés
6-MMP : 6-methylmercaptopurine
6-MMPR: 6-méthylmercaptopurine ribonucléotides
6-MP ou MP : 6-mercaptopurine (Puri-Nethol®)
6-MTG : 6-methylthioguanine
6-MTGMP : 6-methylthioguanine monophosphate
6-MTIMP, 6-MTIDP et 6-MTITP : 6-methylthionosine mono, di et triphosphate
6-TG : 6-thioguanine (Lanvis®)
6-TGMP, 6-TGDP et 6-TGTP : 6-thioguanine mono, di et triphosphate
6-TGN : 6-thioguanine nucleotides
6-TIMP, 6-TIDP et 6-TITP : 6-thioinosine mono, di et triphosphate
6-TUA : 6-thiouric acid
6-TX : 6-thioxanthine
6-TXMP : 6-thioxanthosine monophosphate
8-OH 6-MMP : 8hydroxy-6methylmercaptopurine
8-OHAZA : 8-hydroxy-azathioprine
8-OHMP : 8-hydroxy-mercaptopurine
8-OHTX : 8-hydroxy-thioxanthine
AB : antibiotique
ABCC4 : ATP-binding cassette sub-family member C4
ANCA : antcicorps anti-cytoplasme des neutrophiles
AO : aldéhyde oxydase
ASCA : anticorps anti-saccharomyces cerevisiae.
AZA : azathioprine (Imuran®)
CS : methylprednisolone
DPK : diphosphate kinase
ECCO : European Crohn’s ans Colitis organisation
GD : guanine déaminase
GMPS : guanosine monophosphate synthétase
6
GST : gluthation-S-transférase,
Hb : hémoglobine
HGPRT : hypoxanthine guanine phosphoribosyl transférase
HM : haut méthylateur
IM : méthylateur intermédiaire
IMPDH : inosine monophosphate déhydrogénase
ITPA : inosine triphosphate pyrophosphatase
LM : méthylateur bas
MPK : monophosphate kinase
MTHFR : méthyltétrahydrofolate réductase
NMI : nitrométhylimidazole
[P ] : transfusion de plaquettes
[RC] : transfusion de globules rouges concentrés
SLC28A3 : solute carrier family ou transporteur de nucléoside
SZP : sulphasalazine
TPMT : thiopurine méthyltransférase
WBC : white blood cells count
XOD : xanthine oxidase/déhydrogénase
7
Liste des tableaux et figures
Tableau 1 : comparaison entre maladie de Crohn et rectocolite.
Tableau 2 : médicaments utilisés dans la maladie de Crohn
Tableau 3 : médicaments utilisés dans la Rectocolite
Tableau 4 : indications des Thiopurines
Tableau 5 : analyse base de données MICI
Tableau 6 : toxicité des Thiopurines
Tableau 7 : médicaments pancréatotoxiques reconnus
Tableau 8 : résultats détaillés
Tableau 9 : résumé des résultats
Tableau 10 : second épisode de myélosuppression
Tableau 11 : seuils thérapeutiques de 6-TGN
Tableau 12 : données cliniques des patients étudiés
Tableau 13 : évolution des 6-TGN et de l’activité TPMT
Tableau 14 : adaptation des doses de TP selon l’activité TPMT
Tableau 15 : résultats de l’analyse des métabolites des TP : 6TGN-6MMP chez 9187 patients
Tableau 16 : accès et remboursement des tests de monitoring du métabolisme des Thiopurines
Figure 1 : histoire naturelle de la maladie de Crohn
Figure 2 : métabolisme des Thiopurines
Figure 3 : distribution de l’activité TPMT
Figure 4 : métabolisme des Thiopurines : focus sur XO/AO
Figure 5 : métabolisme des Thiopurines : focus sur ITPA
Figure 6 : métabolisme des Thiopurines : focus sur GST
Figure 7 : métabolisme des Thiopurines : focus sur MTHFR
Figure 8 : délai entre l’administration de l’azathioprine et la survenue de la myélosuppression
Figure 9 : devenir du traitement par AZA
Figure 10 : focus sur les 6-TGN
Figure 11 : design de l’étude interaction 5-ASA/AZA.
Figure 12 : évolution des 6-TGN
Figure 13 : évolution de l’activité TPMT
Figure 14 : évolution des 6-TGN et de l’activité TPMT
Figure 15 : interaction MTX/TP via SAM
Figure 16 : indications de la mesure des métabolites des Thiopurine dans les MICI
8
Introduction : aperçu des maladies inflammatoires chroniques intestinales
Le nom de MICI (ou IBD en anglais pour « Inflammatory Bowel Diseases ») est un terme général qui
regroupe les affections caractérisées par une inflammation récidivante des différents segments du tube
digestif. On les subdivise en 2 sous-groupes principaux : la maladie de Crohn (MC) et la Rectocolite
(RC). Chacune de ces entités peut présenter différents phénotypes, dont la sévérité clinique est
variable. Les principales différences entre les deux maladies sont résumées dans le tableau 1 (1).
Tableau 1: comparaison des
M.Inflammatoires Chroniques Intestinales (MICI)
Crohn
RC
(Rectocolite)
Localisation: iléon et/ou colon,
rectum +/- colon
« de la bouche à l’anus »
Atteinte
Transmurale….fistules
Muqueuse
Segmentaire
Continue
Histologie Granulome (30-40% cas) Absence de granulome
Action Tabac Favorisée par tabac « Protégée» par le tabac
Sérologie
ASCA
ANCA
Chirurgie
R/ complications
Chirurgie « guérit »….
L’inflammation intestinale présente est responsable de symptômes liés notamment à la zone atteinte :
diarrhées, douleurs abdominales, amaigrissement, fièvre, pertes de sang,….. Des manifestations extradigestives peuvent également être rencontrées notamment au niveau des yeux (uvéites,..), de la peau
(érythème noueux, pyoderma gangrenosum, syndrome de Sweet,…), des articulations (arthralgies,
arthrites, spondylarthropathies,…),…liées notamment à la présence de cytokines pro-inflammatoires.
Ces affections peuvent avoir un impact négatif très important sur la qualité de vie des patients,
l’intégration sociale et familiale, le développement professionnel, ou sur la croissance des cas
pédiatriques.
9
L’évolution de ces maladies est caractérisée par une succession de phases de poussée (période
symptomatique) et des phases de rémission (période asymptomatique). Ces cycles peuvent être très
différents d’un patient à l’autre. A un extrême, on retrouve des patients qui présentent une seule
poussée puis demeurent asymptomatique. A un autre extrême, certains patients restent en phase de
poussée sans jamais atteindre une véritable rémission. La fréquence de ces cycles « phase activephase quiescente» est un des paramètres qui caractérise la sévérité de la maladie.
L’origine exacte de ces maladies reste hypothétique. Plusieurs facteurs semblent intervenir : génétique,
environnemental et immunitaire. Actuellement, plus de 100 gènes favorisant ces MICI ont été
découverts mais ils ne sont impliqués que pour 30 % des tableaux cliniques rencontrés (2). Un facteur
environnemental est également nécessaire pour déclencher l’apparition des ces maladies. Ceci est
notamment clairement démontré chez les jumeaux monozygotes : si un des 2 jumeaux est atteint,
l’autre ne présentera une maladie que dans 20 % à 62 % des cas pour la MC et 6 % à 19 % pour la RC,
alors que pour une maladie exclusivement génétique, à forte pénétrance, on s’attendrait à une
concordance de 100 % (3). De même, ces maladies se rencontrent préférentiellement dans les pays au
mode de vie occidental. En comparaison, l’incidence de ces maladies est d’ailleurs plus importante
parmi les maghrébins vivant en Belgique que chez ceux demeurés au pays. Ceci signifie qu’à
patrimoine génétique identique un facteur de notre environnement européen/occidental favorise
l’émergence de ces MICI.
La prévalence des MICI est estimée à plus de deux millions d’individus en Europe. L’incidence de la MC
est en augmentation, alors que celle de la RC est plutôt en diminution (4). Par ailleurs, de plus en plus
de cas de MICI sont observés chez de jeunes enfants ou des adolescents (5).
Le diagnostic de MICI repose sur un faisceau d’arguments : cliniques, biologiques, histologiques,
endoscopiques et/ou radiologiques. Il n’existe pas de test biologique discriminant pour l’existence d’une
MICI. La découverte d’un syndrome inflammatoire biologique chez un sujet symptomatique doit faire
suspecter le diagnostic de MICI. L’absence de syndrome inflammatoire n’en exclut pas une pour autant.
10
Le dosage de la calprotectine (enzyme du cytoplasme des neutrophiles) dans les selles est un test très
sensible qui fait suspecter, lorsqu’il est élevé (>200 μg/g de selles), la présence de lésions dans le grêle
ou le colon sans que cela soit spécifique des MICI (6). Le dosage sanguin des ASCA (anticorps antisaccharomyces cerevisiae, plus spécifiques de la MC) et des ANCA (anticorps anti-cytoplasme des
neutrophiles, plus spécifiques de la RC) n’est pas recommandé dans le dépistage des MICI, car peu
sensible, mais peut s’avérer utile dans certaines situations (colite indéterminée)(7). L’endoscopie est
une étape obligée dans le diagnostic des MICI car elle objective la présence de lésions, leur sévérité,
leur localisation et est complétée par la réalisation de biopsies qui permettent une analyse histologique.
La radiologie (échographie abdominale, entéro-IRM, IRM du périnée, CT scan abdominal si
complications de la maladie) contribue également à ce diagnostic, en particulier dans la MC où elle
objective notamment les lésions grêles non accessibles à l’endoscopie.
Les principaux traitements utilisés dans les MICI sont repris dans les tableaux 2 et 3 (1).
Tableau 2.
Médicaments dans la maladie de Crohn
• Poussée
• Maintien en rémission
(Aminosalicylés)
- Sulphasalazine
- dérivés 5-ASA
Antibiotiques
- ciprofloxacine
- métronidazole
Corticoïdes
- classiques
- topiques (budésonide)
(Ciclosporine)
Ac anti-TNF
Infliximab (Remicade®)
Adalimumab (Humira®)
(Aminosalicylés)
Immunosuppresseurs
- Azathioprine (Imuran®)
- Mercaptopurine (Puri-Nethol®)
- Méthotrexate (Ledretrexate®)
Ac anti-TNF
Infliximab (Remicade®)
Adalimumab (Humira®)
11
Tableau 3.
Médicaments dans la RCUH
• Poussée
Aminosalicylés
- Sulphasalazine
- dérivés 5-ASA
Corticoïdes
- classiques
- topique (Clipper ®)
Ciclosporine
Ac Anti-TNF
-infliximab (Remicade®)
(adalimumab-Humira®)
• Maintien en rémission
Aminosalicylés
Immunosuppresseurs
- Azathioprine (Imuran ®)
- Mercaptopurine (Puri-Nethol ®)
Ac anti-TNF: Infliximab
(adalimumab)
Des différences existent :
- Les aminosalicylés constituent le traitement de premier choix de la RC et sont d’ailleurs très efficaces
tant pour le traitement de la poussée que pour le traitement d’entretien. Leur utilisation dans la MC est
discutée. Ils ne sont plus repris dans les « guidelines » ECCO du traitement d’attaque de la MC (8). Des
études sont en cours évaluant leur efficacité lorsqu’ ils sont prescrits à des doses plus élevées que
4g/jour.
- Les antibiotiques sont utilisés dans la MC, en particulier dans les formes compliquées d’abcès, de
fistules ou les formes périnéales. Ils ont également démontré une efficacité dans la prévention des
récidives post-opératoires (9). Les plus utilisés sont la ciprofloxacine et le métronidazole. Leur utilisation
au long cours n’est pas recommandée.
12
- Les corticoïdes « topiques » de type budésonide (Entocort® et Budénofalk®) sont utilisés dans la
maladie de Crohn étant donné leur action iléo-colique droite. La béclaméthasone dipropionate
(Clipper®) est, par contre, plus souvent utilisée dans la RC car son action est disséminée tout le long du
colon. La principale caractéristique de ces corticoïdes topiques est d’éviter une imprégnation
systémique, et dès lors, d’occasionner moins d’effets secondaires que les corticoïdes classiques. Ils
sont néanmoins moins efficaces que ces derniers.
- Les corticoïdes classiques (prednisolone) sont très efficaces ; tant dans le traitement de la MC (à la
dose de 1mg/kg, 90 % de réponse (10)) que dans la RC. Leur première utilisation dans les années 50 a
d’ailleurs révolutionné la prise en charge des colites ulcéreuses graves et permis de diminuer
drastiquement la mortalité liée à cette situation (11, 12). Malheureusement, l’importance de leurs effets
secondaires lors d’une prise prolongée contre-indique une utilisation à long terme. Or, bon nombre de
patients deviennent dépendant des corticoïdes : une diminution des doses ou un arrêt du traitement
entraine une réapparition des symptômes (13).
- Ce phénomène de corticodépendance est une des principales indications de la mise en route des
immunosuppresseurs. Ces médicaments sont utilisés comme traitement de fond pour stabiliser la
maladie et permettre une épargne cortisonique. Parmi ceux-ci, les Thiopurines (TP) sont la principale
classe d’immunomodulateurs utilisés, tant dans la MC que dans la RC. Ils constituent le sujet principal
de cette thèse.
- Le méthotrexate, agent immunosuppresseur a une efficacité reconnue dans la MC(14) et est, le plus
souvent utilisé, en deuxième intention, après les TP. Son utilité dans la RC n’est pas prouvée et iI fait
d’ailleurs actuellement l’objet d’un essai contrôlé (METEOR).
- La ciclosporine, agent immunosuppresseur, est utilisée chez les patients souffrant de colite ulcéreuse
grave, réfractaire aux corticoïdes intraveineux (15). Son utilisation est limitée dans le temps
(habituellement 3 mois) notamment à cause de ses effets secondaires, et son action est le plus souvent
relayée par les TP. Elle n’est plus guère utilisée dans la MC depuis l’avènement des anti-TNF. Cela
13
pourrait également être le cas dans la RC. En effet, une étude récente (CYSIF) a démontré une
efficacité similaire de l’infliximab et de la ciclosporine en cas de colite ulcéreuse réfractaire aux
corticoïdes intraveineux (16).
- Les Anti-TNF (infliximab-Remicade ® et adalimumab-Humira®) sont efficaces dans le traitement des
formes inflammatoires et fistulisantes de la MC ainsi que dans la RC, tant pour l’induction que pour le
maintien d’une rémission (17-19).
- La chirurgie est réservée aux formes compliquées de la maladie de Crohn : sténose, abcès, fistule,
perforation, cancer... En effet, la résection du segment malade ne guérit pas le patient. Cependant le
recours à la chirurgie est très fréquent et est estimé à 50 % après 5 ans et 80 % après 20 ans
d’évolution (20). Ceci est expliqué par l’histoire naturelle de la maladie évoluant d’une forme
inflammatoire vers des formes sténosantes ou pénétrantes (fistulisantes) (21). Une récidive
endoscopique de la maladie s’observe dans près de 75 % des cas à 1 an (22). Le mot d’ordre est donc
d’être « économe » et de ne réséquer que le strict nécessaire, voire d’éviter des résections par la
réalisation de stricturoplasties. La chirurgie est également très fréquemment pratiquée en cas d’atteinte
anale de la maladie de Crohn, et son traitement dans cette situation est le plus souvent médicochirurgical (23).
Dans la rectocolite, la chirurgie « guérit » le patient de la maladie, puisque l’ensemble de l’organe
malade est réséqué (proctocolectomie totale). L’exérèse du rectum et du colon, organes de confort,
entraine un nombre accru de selles (5-6 selles/jour en moyenne) et justifie fréquemment la poursuite de
traitement par ralentisseurs du transit (lopéramide-Imodium®,….). Le plus souvent, une anastomose
iléo-anale avec réservoir en J est confectionnée et permet au patient de retrouver une bonne qualité de
vie. Par ailleurs, il existe une morbidité propre à la chirurgie (complications post-opératoires,..) ainsi
qu’un risque de complication à long terme telle la « pochite » qui correspond à une inflammation de ce
réservoir iléo-anal. Les taux d’incidence de pochite varient selon les études de 45 à 60 % (en fonction
des critères choisis) (24). Le traitement comprend la prise d’antibiotiques, voire même de corticoïdes,
14
d’immunosuppresseurs ou d’anti-TNF en cas de pochite chronique. Environ 5 à 15 % des patients
atteints de pochite développent une pochite chronique (24). Pour ces différentes raisons, la chirurgie
n’est réalisée qu’en cas d’échec du traitement médical ou de cancérisation. Le risque cumulé de
colectomie dans la RC varie entre 10 et 30% après 25 ans. L'extension et la sévérité de la RC au
moment du diagnostic sont les meilleurs facteurs prédictifs du risque de colectomie.
Figure 1: Histoire naturelle de la MC :
formes inflammatoire/ sténosante/ perforante
100
90
Cummulative risk (%)
80
Fistule
70
60
50
chirurgie
Sténose
40
30
20
Inflammation
10
0
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
years
Patients at risk
N = 2002
552
229
95
37
Cosnes J et al. Inflamm Bowel Dis. 2002;8:244
Le développement au fil du temps de formes « compliquées » de la MC (sténose et/ou fistules)
nécessite davantage de recours à la chirurgie.
15
Chapitre 1 : Les Thiopurines
1.1 Historique de leur découverte
Les Thiopurines (TP), également appelées anti-purines, regroupent une famille de 3 substances :
l’azathioprine (AZA), la 6-mercaptopurine (MP) et la thioguanine (TG).
Ces médicaments ont été synthétisés par Gertrude Elion et George Hitchings au début des années 50
(25). Ils ont substitué un groupe sulphydryl à l’oxygène du carbone en position 6 de la guanine (pour
obtenir la thioguanine, en 1950) ou de l’hypoxanthine (pour obtenir la MP, en 1951) et ont démontré que
ces nouvelles substances étaient capables d’inhiber l’utilisation des purines (26). Cependant, la plus
grande partie de la MP administrée aux patients était rapidement dégradée sans avoir pu exercer un
effet thérapeutique. En 1957, un groupement méthyl-nitro-imidazolyl a été ajouté à l’atome de soufre de
la MP pour lui éviter une oxydation immédiate in vivo, et permettre une libération prolongée de MP. Le
composé ainsi obtenu a été a dénommé azathioprine, mis sur le marché en 1962 sous le nom
d’Imuran®.
La première efficacité de ces molécules a été mise en évidence chez les rongeurs : elles se sont
révélées actives contre un large spectre de tumeurs (27, 28). Leur intérêt chez l'homme a d'abord été
démontré chez les enfants souffrant de leucémie lymphoblastique aigüe (29, 30). Avant l’avènement
des TP, le pronostic vital de ces jeunes patients était très mauvais avec une survie d’au maximum
quelques mois. La découverte de la capacité de la MP à induire une rémission complète de la leucémie
lymphoblastique aigüe (même si la plupart des patients subissaient une récidive par après) a amené la
Food and Drug Administration (FDA) à approuver son utilisation dans cette indication en 1953.
L’azathioprine a été introduite plus tard, en 1963, lorsqu'il a été découvert qu'elle pouvait prolonger la
survie de l’allogreffe rénale (31).
16
En 1988, Gertrude Elion et George Hitchings se sont vus décerner le prix Nobel de médecine
conjointement avec Sir James Black (découvreur du propranolol et de la cimétidine) pour leurs travaux
sur la conception de nouveaux médicaments. Au-delà des TP, Elion a également découvert la
pyriméthamine, la triméthoprime, l’allopurinol, l’acyclovir,… Elle est docteur honoris causa de 25
universités tout en n’ayant jamais eu le temps de terminer sa thèse, trop occupée par ses recherches et
découvertes. Elle est décédée le 21 février 1999 à l’âge de 81 ans.
Gertrude Elion
George Hitchings
Les TP sont utilisées dans le traitement des maladies inflammatoires intestinales depuis 50 ans. En
effet, la première trace de l’utilisation de TP dans cette indication remonte à 1962, date à laquelle Bean
publia un article concernant le cas d’un patient souffrant de rectocolite traité par MP (32). Il s'agissait
d'un patient de 38 ans souffrant d'une rectocolite chronique active à qui il administra une haute dose de
mercaptopurine (300 mg/j). Il observa non seulement une diminution des besoins en transfusions
sanguines mais également un retour des haustrations à la normale à la radiographie ainsi qu'une
cicatrisation des ulcères à l'endoscopie. Le patient fut ensuite traité par une dose de 50 mg/j et les
17
symptômes réapparurent. Un retraitement avec 300 mg/j fut administré suivi d’une dose d'entretien de
100 mg/j. Ceci permit d’obtenir une période de rémission de plus de 80 semaines.
L’utilisation de l’azathioprine dans la maladie de Crohn a été, pour la première fois, rapportée dans le
Lancet en 1969 (33) : six patients souffrant de maladie de Crohn réfractaire ont été traités par AZA 4
mg/kg pendant 10 jours suivi d’un traitement d’entretien par 2 mg/kg. Tous les patients ont été très
nettement améliorés et cinq d’entre eux ont pu reprendre le travail.
Depuis, les Thiopurines ont été largement utilisées dans de nombreuses pathologies. Une liste nonexhaustive de leurs indications actuelles est reprise dans le tableau 4.
Tableau 4 : indications des Thiopurines (liste non exhaustive)(34)
Leucémies lymphoblastiques aigues de l’enfant
Transplantation d’organes solides
Leucémies non-lymphocytaires aigues de l’adulte
Polyarthrite rhumatoïde
Leucémies aigues lymphocytaires de l’adulte
Lupus érythémateux systémique
Leucémie aigue myéloide de l’enfant
Psoriasis
Lymphome non-hodgkinien de l’enfant
Eczéma atopique sévère de l’enfant
Maladie de Crohn
Hépatite auto-immune
Rectocolite
18
1.2. La famille des Thiopurines
L'azathioprine et la mercaptopurine sont des analogues des purines et ils agissent comme antagonistes
des purines endogènes qui constituent les composants essentiels de l'ADN, de l’ARN et de certaines
coenzymes (26).
Les données pharmacocinétiques des TP n’ont pas été étudiées systématiquement chez les patients
MICI. Les profils connus proviennent de données obtenues chez des patients leucémiques.
1.2.1 : Absorption des TP
A : La 6-Mercaptopurine (MP)
Après une prise orale de MP aux doses habituelles de 1 à 1,5 mg par kilo, le pic de concentration
plasmatique est observé en moyenne après 2,2 heures. Un des défauts de la MP est sa faible
biodisponibilité d‘environ 16 % (variation de 5 à 37 %) (35). Une grande partie de la MP est métabolisée
dès son premier passage dans le foie. Sa demi-vie est mesurée à 21 minutes. La biotransformation de
la MP a lieu en intracellulaire. Le transport de la MP en intracellulaire est effectué par différents
transporteurs de nucléosides (SLC28A2-3, SLC29A1-2).
HYPOXANTHINE
6-MERCAPTOPURINE
19
B : La Thioguanine (TG)
Après une prise orale de TG de 20 mg/m2, le pic plasmatique est observé 4 h après l'ingestion. La
biodisponibilité de la TG varie de 14 à 46 % avec une demi-vie plasmatique de 90 minutes.
GUANINE
THIOGUANINE
C : L’Azathioprine (AZA)
Après une prise orale de 2 mg/kg d'azathioprine (dont 55 % du poids moléculaire est de la MP), le pic
de concentration plasmatique de MP est de 75 ng/ml et la demi-vie plasmatique est de moins de 2 h.
L'absorption intestinale de l'AZA varie de 50 à 72 % et, une fois absorbée, 88 % de la dose est
rapidement convertie en MP et dérivé nitroimidazolé, tandis que les 12 % restant sont excrétés dans les
urines.
AZATHIOPRINE
20
1.2.2 Distribution des TP
Les données de distribution des TP proviennent d’expériences menées chez la souris avec de l’AZA
radio-marquée (36). Cette étude a montré une distribution relativement homogène du produit dans
l’ensemble du corps. Les TP passent peu dans le liquide céphalo-rachidien mais bien la barrière
placentaire. Par contre, la MP n’a été dosée qu’en de très faibles quantités dans le lait maternel après
prise d’AZA ou de MP (37), alors que les métabolites des TP se sont révélés indosables chez les
nouveau-nés allaités par des mères traitées par TP (38).
1.3. Métabolisme des Thiopurines : les différentes enzymes impliquées
Les Thiopurines sont des pro-drogues définies comme des médicaments qui sont administrés sous une
forme inactive. Une fois administrée, la pro-drogue est métabolisée in vivo en un métabolite actif. Nous
avons vu que la demi-vie plasmatique des TP est courte variant de 1 à 2 h. Par contre, leurs
métabolites actifs, notamment les 6-thioguanine nucléotides (6-TGN) ont une demi-vie plasmatique
longue variant de 3 à 13 jours, avec une large variation inter-individus. Les taux de 6-TGN atteignent
leur état d’équilibre après 4 à 5 semaines (39-41). Pour la plupart des patients l'efficacité thérapeutique
est atteinte entre 12 et 17 semaines après le début du traitement (42).
Les 6-TGN sont incorporés dans l'ADN à la place des guanine-nucléotides. Il en résulte une inhibition
de la synthèse des nucléotides et des protéines et, en fin de compte, une inhibition de la prolifération
lymphocytaire et leur apoptose (via RAC1, cfr chap 3.1). D’autres métabolites, les 6-méthylmercaptopurine-ribonucléotides (6MMPR) constituent des inhibiteurs de la synthèse de novo des purines et
contribuent également à l'effet antiprolifératif des TP. Les Thiopurines nécessitent une métabolisation
avant de pouvoir exercer leur activité cytotoxique. Cette métabolisation est complexe et schématisée
dans la figure 2.
21
Figure 2 : métabolisme des Thiopurines (42)
AZA
NMI
AO
GST
AO
TPMT
8-OHAZA
6-MMP
6-MTIDP
MPK
HGPRT
TPMT
6-MMPR
6-MTIMP
6-TIMP
6-TUA
6-MTITP
DPK
MP
XOD
Inhibition de novo
synthèse nucléotide
8-OH-6MMP
MPK
6-MTG
IMPDH
TPMT
6-MTGMP
6-TIDP
DPK
6-TXMP
ITPA
6TG
TPMT
GMPS
HGPRT
6-TGMP
6-TITP
MPK
6-TGN
6-TGDP
DPK
Inhibition de Rac-1 ,
Incorporation de « faux nucléotide »
et cassure de brins d’ADN/ARN.
22
6-TGTP
Fig 2. Métabolisme des thiopurines (43).
AZA
NMI
AO
GST
TPMT
8-OHAZA
Allopurinol
AO
6-MMP
XOD
6-MTIDP
MPK
HGPRT
TPMT
6-MMPR
6-MTIMP
6-TIMP
6-TUA
6-MTITP
DPK
MP
-
Inhibition of de novo
nucleotide synthesis
8-OH-6MMP
MPK
6-MTG
IMPDH
TPMT
6-MTGMP
6-TIDP
6-TXMP
ITPA
DPK
6TG
TPMT
GMPS
HGPRT
6-TGMP
6-TITP
MPK
6-TGN
6-TGDP
DPK
6-TGTP
Rac-1 inhibition,
False nucleotide incorporation and
DNA/RNA strand breakage.
AZA : azathioprine, 6MP : 6-mercaptopurine,
6TG : 6-thioguanine,
8-OHAZA :8-hydroxy-azathioprine, NMI :
nitromethylimidazole, 8-OHMP : 8-hydroxy-mercaptopurine, 6-TUA : 6-thiouric acid, 6-MMP : 6-methylmercaptopurine, 8-OH
6-MMP : 8hydroxy-6methylmercaptopurine, 6-TIMP, 6-TIDP and 6-TITP : 6-thioinosine mono, di and triphosphate, 6MTIMP,6MTIDP and 6-MTITP : 6-methylthionosine mono, di and triphosphate regroupés sous le nom de 6-MMPR: 6méthylmercaptourine ribonucléotides, 6-TXMP : 6-thioxanthosine monophosphate, 6-TGMP, 6-TGDP and 6-TGTP : 6thioguanine mono, di and triphosphate regroupés sous le terme de 6-TGN: 6-thioguanine nucléotides, 6-MTGMP : 6methylthioguanine monophosphate, 6-MTG : 6-methylthioguanine, 8-OHTX : 8-hydroxy-thioxanthine, 6-TX : 6-thioxanthine,
AO :
aldehyde
oxydase,
GST :
gluthation-S-transferase,
XOD :xanthine
oxidase/dehydrogenase,
TPMT :
thiopurinemethyltransferase, HGPRT : hypoxanthine guanine phosphoribosyl transferase, MPK : monophosphate kinase,
DPK : diphosphate kinase, ITPA : inosine triphosphate pyrophosphatase, IMPDH : inosine monophosphate dehydrogenase,
GMPS : guanosine monophosphate synthetase, GD : guanine deaminase.
23
L’AZA est rapidement convertie par une conjugaison enzymatique et non-enzymatique via le
Glutathion en MP, qui est, à son tour, convertie par différentes enzymes en des composés actifs et
inactifs. Parmi les différentes enzymes impliquées, nous nous concentrerons sur les enzymes ayant
fait l’objet du plus d’études dans les MICI : la Thiopurine Méthyltransférase (TPMT), la Xanthine
oxydase/déshydrogénase (XOD), l’Aldéhyde oxydase (AO), l’Inosine triphosphate pyrophosphatase
(ITPA), la Glutathion-S-transférase (GST) et la methylènetétrahydrofolate réductase (MTHFR).
1.3.1 : Thiopurine méthyl transférase (TPMT)
La TPMT est une enzyme cytosolique retrouvée dans de nombreux tissus et est responsable de la
catalyse par méthylation de nombreux cycles aromatiques, tels les thiopurines. Pour exercer son
action, elle nécessite la présence de S-adénosyl-méthionine (SAM), son cofacteur essentiel qui agit
comme groupement moléculaire donneur de méthyle. Dès lors, une carence en cofacteur SAM
diminue l’activité de la TPMT (44).
La TPMT est l'enzyme du métabolisme des TP la plus étudiée et la seule habituellement testée en
pratique clinique. Le statut TPMT d'un individu peut être défini par des tests de génotypage ou de
phénotypage de l’enzyme.
a. Génotypage de la TPMT.
Le génotypage de la TPMT consiste à détecter les polymorphismes d’un seul nucléotide (SNPs)
responsables d'une inactivation ou d’une diminution de l’activité de la TPMT.
En se basant sur le polymorphisme génétique de la TPMT et à partir d’un échantillon de 298
individus caucasiens sélectionnés au hasard, Weinshilboum et al (45) ont divisé la population
générale en trois groupes (figure 3) :
24

HM ou « high methylator » : les homozygotes pour un allèle TPMT normal avec une activité
de méthylation élevée (88 %).

IM ou « Intermediate methylator » : les hétérozygotes pour un allèle TPMT déficient avec
une activité de méthylation intermédiaire (11 %).

LM ou Low methylator » : les homozygotes pour un allèle TPMT déficient avec une activité
de méthylation faible (0,3 %).
Une étude allemande englobant 1214 donneurs de sang caucasiens, retrouve la répartition
suivante : 89,5% (HM), 9,9% (IM) et 0,6% (LM)(46). En ce qui concerne les patients souffrant de
maladies auto-immunes (MICI, hépatite auto-immune, sclérose en plaque,..), une cohorte
espagnole regroupant 14.545 patients a rapporté une répartition de 87,6% (HM), 11,9% (IM) et
0,5% (LM)(47). Ces études retrouvent donc des valeurs similaires de distribution d’activité de la
TPMT au sein de la race caucasienne. Différentes études ont révélé que la prévalence des
mutations du gène de la TPMT, toute mutation confondue, était plus faible chez les Chinois (5%) et
les habitants du sud-ouest asiatique (2%)(48).
Par contre, il n’existe pas de différence entre une population de patients MICI (Rectocolite et M.
Crohn) et des sujets normaux en ce qui concerne la distribution des variantes TPMT dans des
populations caucasiennes (espagnole, hollandaise, et danoise)(49, 50).
Le gène humain de la TPMT est localisé sur le bras court du chromosome 6 et contient 10 exons (8
codants) et 9 introns. A ce jour, 30 allèles responsables d'une possible déficience de l'activité de la
TPMT ont été décrits (51-54) : *2,*3A,*3B,*3C,*3D,*3E,*4 jusqu’à *28. La mutation *3A associe
deux polymorphismes d’un seul nucléotide qui sont également retrouvés isolément dans les
mutations *3B et *3C (exons 7 et 10 respectivement)(figure annexe).
Les différentes mutations peuvent engendrer une baisse d’activité de l’enzyme TPMT qui serait
expliquée par une modification de la structure protéique de la TPMT : la protéine devient instable et
25
son activité enzymatique diminue. En effet, la demi-vie de la TPMT est de 18 heures en cas de
génotype homozygote normal et chute à 15 minutes pour les génotypes *2 et *3A (55).
Dans une population caucasienne, les mutations *3A, *2 et *3C sont les plus fréquentes et
constituent 95 % de toutes les mutations rencontrées (34, 56) (voir annexe 1). Dans les
populations africaine et asiatique, la mutation *3C est la plus fréquemment rencontrée : 5,4 à 7,6%
et 0,3 à 3 % respectivement (34, 57). Des divergences existent cependant aussi entre ces
populations : la mutation TPMT*8 est plus fréquemment rencontrée chez les africains et la mutation
TPMT*6 chez les natifs du Sud-est Asiatique (58).
Toutes les mutations évoquées précédemment surviennent sur les séquences codant la protéine.
D’autres mutations affectant des segments non-codants du gène de la TPMT ont été évoquées
comme pouvant être responsables de variation sur l’expression ou l’activité de la TPMT et seront
discutées dans le chapitre 2 (voir 2.1.2).
Fig 3 :Distribution de l’activité TPMT
Allèle TPMT
mutant ou
« déficient »
Génotype
Allèle TPMT
normal ou
« sauvage »
Activité élevée (89%)
% de sujets
par 0,5 U
d’activité
Phénotype
Activité intermédiaire
(11%)
Activité indosable
(0,3%)
Activité
TPMT (U/mL)
D’après Weinshilboum et al,1980
26
b. Phénotypage de la TPMT
Le phénotype de la TPMT reflète l'activité enzymatique qui peut être mesurée in vitro par la conversion
de la MP en 6-methylmercaptopurine (6-MMP). Cette activité est le plus souvent mesurée au sein des
globules rouges. Différentes variétés de tests (test radiochimique, chromatographie liquide à haute
performance HPLC) sont disponibles utilisant parfois différentes unités de mesure ce qui complique
l'interprétation des résultats en pratique quotidienne.
L’étude allemande (46), citée plus haut, a observé une variation considérable de l’activité TPMT
érythrocytaire : de 2,9 à 65 nmol de 6-methylthioguanine formées par heure et par gramme
d’hémoglobine. Une distribution trimodale des valeurs d’activité de la TPMT était retrouvée : < 2, de 9 à
22 et > à 22 nmol/h/g Hb pour les populations définies respectivement LM, IM et HM.
De plus, la population avec une activité TPMT dite « normale » ne constitue pas un groupe homogène.
Jusqu’à 15 % des patients peuvent présenter une activité plus élevée que la normale (59) et
approximativement 2% de la population étudiée dans la cohorte allemande présentait une activité TPMT
ultra-élevée (de 51 à 65 nmol/h/g Hb). Ce résultat corrobore ceux d’une étude antérieure (60) suggérant
l’existence d’un sous-groupe d’individus «métaboliseurs ultra-rapides ».
L’activité de la TPMT n’est pas modifiée significativement par le genre ou l’âge du patient (61), elle est
mature dès la naissance. Par contre, le vieillissement des globules rouges s’accompagne d’une
diminution de l’activité TPMT comme cela a pu être observé chez de jeunes patients leucémiques (62).
Par ailleurs, de jeunes globules rouges semblent avoir une activité TPMT plus élevée. Ceci est illustré
par le cas rapporté par de Boer : un patient a présenté une pancytopénie et une pneumonie à CMV
après plusieurs années de traitement par AZA (63). Durant la phase initiale de récupération de cette
pancytopénie, l’activité TPMT érythrocytaire a été mesurée et s’est révélée très élevée (182 nmol/h/g).
Par la suite, après récupération complète de l’épisode de myélosuppression, la TPMT a été, à nouveau,
mesurée cette fois-ci à une valeur normale de 43 nmol/h/g. Ce changement d’activité TPMT peut être
expliqué par une variation de l’activité enzymatique en fonction de l’âge des érythrocytes, les jeunes
27
globules rouges présentant une activité plus élevée qui diminuerait au fur et à mesure de leur
vieillissement.
Corrélation Génotype-Phénotype
Il existe une corrélation, variant de 76 à 99 %, entre le phénotypage ou mesure de l’activité de la TPMT
et son génotypage (46). En d’autres termes, un patient qui est hétérozygote pour un allèle déficient de
la TPMT présente un déficit partiel de l’activité TPMT, de même qu’un patient TPMT homozygote
déficient présente un déficit total de l’activité enzymatique. Dans la cohorte allemande, la concordance
globale entre phénotypage et génotypage était de 98,4% et l’utilisation d’un test génétique prédisait le
phénotype avec une sensibilité et une spécificité supérieures à 90 % (57). Une méta-analyse récente,
portant sur 19 études de valeurs inégales et incluant 1715 patients, retrouve des valeurs moins
optimistes. La sensibilité du test génétique pour prédire les patients à activité TPMT basse ou
intermédiaire est jugée imparfaite variant de 70 à 86 %, alors que la spécificité est presque parfaite (64).
D’autre part, il existe un petit chevauchement entre les groupes TPMT homozygote normal (phénotype
prédit HM) et TPMT hétérozygote déficient (phénotype prédit IM). En effet, 1 à 2 % des individus
génotypés TPMT normale présentent une activité enzymatique intermédiaire. Dès lors, il existe un
risque qu’en se basant sur le résultat du test génétique, on initie un traitement par TP à dose pleine
exposant le patient à un risque accru de toxicité hématologique. A contrario, 5 % des individus
génotypés TPMT hétérozygote présentent une activité TPMT normale/élevée (46). Dans ce cas-ci, en
se basant sur le test génétique il est tentant de prescrire une dose de TP plus faible et de ce fait
éventuellement sous-traiter le patient.
Les experts sont toujours divisés sur la nécessité de réaliser une analyse de la TPMT avant de
démarrer un traitement par TP : cette analyse est recommandée par la FDA, qui a demandé une mise à
jour de la notice des TP en 2003 visant à informer de l’existence des tests de détermination de la TPMT
et de leur implication (65), alors qu’elle ne l’est pas dans les lignes de conduite d’ECCO concernant le
28
traitement des MICI (66). Les opposants au test mettent notamment en avant le coût de l’analyse qui ne
dispense, par ailleurs, pas de poursuivre les contrôles sanguins. Bien entendu, la disponibilité du test
intervient également dans ce choix comme nous le verrons dans le chapitre 5. Le test est cependant
recommandé par ECCO en cas de survenue d’un accident thromboleucopénique.
De même, les avis divergent en ce qui concerne le choix d'un phénotypage ou d'un génotypage de la
TPMT. Un des avantages du phénotypage est de déterminer plus précisément l'activité de la TPMT qui
peut varier au sein du groupe d’individus possédant le même génotype (comme évoqué dans le
paragraphe précédent). De plus, il permet la détection de patients présentant une très haute activité de
méthylation. D'un autre côté, le phénotype peut être influencé par de possibles interactions
médicamenteuses au contraire du génotype, et sa reproductibilité est inférieure à celle du génotypage.
Par ailleurs, le génotypage est la seule méthode fiable pour déterminer le statut TPMT d’un patient qui a
été transfusé dans les 8 à 12 semaines qui précède l’analyse. En effet, le mélange du sang du donneur
et du receveur peut amener à une erreur de catégorisation de la TPMT par la mesure de l’activité
enzymatique (67-69).
Enfin, un phénomène d’induction enzymatique de la TPMT a été décrit lors de l’administration chronique
de TP (70, 71) en particulier après transplantation rénale et chez les patients leucémiques. Cette
augmentation d’activité de la TPMT est inconstante puisqu’elle varie de 0 à 55 % selon les sujets. Le
mécanisme de cette possible induction n’est pas connu. Une conséquence possible de cette induction
enzymatique serait un échappement thérapeutique chez certains patients. Cependant, la réalité de cette
induction n’a pas été retrouvée dans une étude menée chez 60 patients MICI suivis prospectivement
pendant 20 semaines lors de l’initiation d’un traitement par TP : aucune modification de l’activité TPMT
n’a été observée (72).
29
1.3.2 : Xanthine oxydase/Déhydrogénase (XOD)
La xanthine oxydase/déhydrogénase est une enzyme cytoplasmique ubiquitaire impliquée dans la
dégradation de substances endogènes et exogènes comme les TP (fig. 4). Son activité est
particulièrement élevée dans les entérocytes et les hépatocytes. La XOD oxyde la MP en acide 6thiourique (6-TUA), métabolite inactif éliminé dans les urines. En dehors de désordres génétiques rares
que sont les xanthinuries type I et IIa (incidence de 1/70.000), on observe des variations interindividuelles de l'activité de la XOD allant de 4 à 10 (73-75). Cette variation est partiellement liée à des
facteurs environnementaux et des facteurs génétiques (75-77). Comme pour d'autres enzymes,
différents polymorphismes (SNPs) du gène de la XOD ont récemment été décrits, et peuvent expliquer
en partie les variations inter-individus (78-80). De façon similaire à la TPMT, les faibles métaboliseurs
XOD s'exposent à un risque élevé d'effets secondaires des TP, alors que les hauts métaboliseurs XOD
ont un risque accru de résistance aux traitements étant donné la faible formation de métabolites actifs
(6TGTP) (74).
Figure 4
30
1.3.3 Aldéhyde oxydase (AO)
Le rôle de l’aldéhyde oxydase en physiologie humaine est mal connu. Cette enzyme est plus largement
distribuée que la XOD et ses substrats très variés. AO catalyse l’hydroxylation d’AZA ou de 6MMP en
composés présumés inactifs. Il existe des variations interindividuelles d’activité de la AO (81). La
présence de polymorphisme (C.3404A > G) a été récemment décrite (80). Son implication clinique est
discutée dans le chapitre 2 (2.2).
1.3.4 : Inosine triphosphate pyrophosphatase (ITPA)
L’Inosine Triphosphate Pyrophosphatase est une enzyme largement exprimée dans les différents
tissus, y compris dans les érythrocytes et les leucocytes. Dans les cellules normales, l’inosine
diphosphate (IDP) et l’inosine triphosphate (ITP) sont produits par une kinase à partir de l’inosine
monophosphate (IMP). L’ITPA intervient après les enzymes précédemment décrites dans le
métabolisme des TP, au niveau de l’IMP (figure 5). Ce dernier, résultat de la transformation de MP, est
converti en adénine ou guanine nucléotides dans le noyau des cellules ; mais il peut aussi être
phosphorylé en ITP qui peut, à son tour, subir une déphosphorylation par l'ITPA (figure 5). Ce cycle
futile est bloqué si l’ITPA est déficiente, avec pour conséquence l'accumulation d’ITP dans les globules
rouges. Jusqu'à présent, les implications de cette accumulation d’ITP chez les personnes ne prenant
pas de TP demeurent inconnues. Il a été suggéré que l'ITPA protégerait les cellules de l'accumulation
de nucléotides potentiellement dangereux qui pourraient être incorporés dans les acides nucléiques
(82).
Le gène de l'ITPA est localisé sur le chromosome 20 p et, à ce jour, deux mutations rares (*94C>A et
*IVS 2+21 A>C) ont été décrites (83, 84). La mutation *94C>A est retrouvée chez 6 % de la population
caucasienne et africaine et chez 19 % de la population asiatique. La mutation IVS2+21 A>C est
retrouvée chez 13 % d’une population caucasienne. L'expression phénotypique de ces mutations est
différente. Aucune activité enzymatique n'est détectable chez un patient ITPA homozygote *94C>A et,
31
chez un patient hétérozygote cette activité est diminuée à 22,5 % de la valeur moyenne des contrôles.
En cas de mutation IVS 2+21 A>C, l'activité ITPA diminue à 60 % de la valeur contrôle chez un
homozygote et à 90 % de cette valeur chez un hétérozygote. L'impact clinique de ces mutations sera
discuté dans le chapitre 2.
Figure 5
32
1.3.5 : Glutathion-S-transférase (GST)
La première étape du métabolisme de l’AZA en MP fait appel au glutathion. Le glutathion sous sa forme
réduite est un élément essentiel dans la protection contre de nombreux composés toxiques ou dans la
lutte contre le stress oxydatif et protège les cellules des dommages causés par les radicaux libres. Une
déplétion en glutathion hépatique prédispose donc à la peroxydation et à la dénaturation de nombreux
composés tels que les lipides, les mucopolysaccharides, les protéines et les acides nucléiques (85).
La conversion de l'azathioprine en mercaptopurine a longuement été considérée comme une réaction
non-enzymatique facilitée par le glutathion et d'autres protéines endogènes contenant du sulfhydryl
(86). Cependant certaines études suggèrent que dans certains organes, comme dans le foie et l'intestin
grêle, une réaction enzymatique catalysée par la GST pourrait être responsable de 99 % de la
biotransformation d’AZA en MP (87).
Trois familles majeures de GST ont été décrites : cytosolique, mitochondriale et microsomale. Les GST
cytosoliques sont réparties en 8 classes, dont 5 présentent un polymorphisme génétique : GST alpha,
mu, pi, thêta et zêta. Parmi ces polymorphismes, les plus étudiés sont GST M1, P1 et T1, dont la
fréquence varie en fonction de l’origine ethnique.
Parmi les GST cytosoliques A1-1, A2-2, et M1-1 sont intensément exprimées dans le foie et démontrent
la plus grande activité envers AZA (87). Cinq variants allèliques de la GST A2-2 montrent une activité
élevée envers l’AZA. Un de ces variants A2-2*E présente une activité enzymatique 3 à 4 fois plus
élevée que la normale. Eklund a suggéré qu’une activité élevée de GST combinée à une dose élevée
d’AZA peut amener à une déplétion en glutathion causant dès lors des dommages cellulaires (87).
Ainsi, la surconsommation du GSH hépatique a pour conséquence l’apparition de lésions
mitochondriales conduisant à la lyse des membranes cellulaires et à la mort de l’hépatocyte.
Nous verrons dans le chapitre 2, le possible impact de l’activité GST sur la survenue d’effets
secondaires lors d’un traitement par AZA.
33
.
Figure 6
1.3.6 : Methylene tétrahydrofolate réductase (MTHFR)
Au-delà des enzymes intervenant dans le métabolisme propre des TP, des variations génétiques
d’autres enzymes peuvent également interférer avec la transformation des TP. Un exemple de ce type
d’interaction est donné par la methylenetetrahydrofolate réductase (MTHFR) qui influence la
disponibilité du cofacteur de la TPMT, la S-adénosylméthionine (SAM).
La méthionine, acide aminé essentiel apporté uniquement par l’alimentation, est transformée en Sadénosylméthionine (SAM) par la S-adénosylméthionine synthase. La SAM est l’un des principaux
donneurs de méthyle dans les réactions biochimiques chez les mammifères et, en donnant son
groupement méthyle, elle se transforme en S-adénosyl-homocystéine (SAH). Cette dernière est, à son
tour, hydrolysée en homocystéine par une réaction réversible catalysée par la S-adénosyl homocystéine
hydrolase. L’homocystéine formée est soit reméthylée en méthionine soit catabolisée par transsulfuration en donnant une cystéine. MTHFR est essentielle au fonctionnement de la voie de
reméthylation de l’homocystéine. 5-CH3-FH4, un dérivé des folates (vitamine B9) issu de notre
alimentation, provient de la transformation de 5,10-CH2-FH4 par MTHFR et est utilisé comme donneur
34
du groupement méthyle. Cette reméthylation de l’homocystéine en méthionine, réaction catalysée par la
méthionine synthase (MS) a pour cofacteur la vitamine B12. L’activité de l’enzyme MTHFR et l’apport
alimentaire en folates de même que les réserves en B12 vont donc influencer la disponibilité en 5-CH3FH4 nécessaire à la méthylation de l’homocystéine, et donc avoir une influence sur la production de la
SAM (figure 7).
Or, il existe différents polymorphismes de MTHFR et notamment deux d'entre eux (c.1298A>C et
c.677C>T), sont présents dans 20 % de la population générale et sont associés à une diminution de
l'activité enzymatique (88). Si cette activité MTHFR est réduite, elle entraîne une diminution de
production de SAM avec pour conséquence une diminution de l'activité enzymatique de la TPMT par
défaut de cofacteur. De nombreuses autres enzymes intervenant dans le cycle des folates et de
l’homocystéine font l’objet de mutations et de modifications d’activité mais n’ont pas, à ce jour, été
étudiées spécifiquement dans le traitement des MICI.
Fig 7. Interaction MTHFR/TPMT via SAM
B12
METHIONINE
S-adénosylméthionine
synthase
Méthionine
synthase
MTHFR
MTHFR
5-CH3FH4
5-10-CH2FH4
Folates
SAM
SAH
S-adénosylhomocystéine
hydrolase
HOMOCYSTEINE
Cystathionine
α-cétobutarate
Cystéine
35
TPMT
1.4. Indications des TP dans les MICI et utilisation aux cliniques universitaires Saint Luc
1.4.1 : Indications
Le but du traitement des MICI, en l’absence d’un remède définitif, est d’induire et de maintenir une
rémission de ces maladies sans l’utilisation prolongée de corticoïdes. Idéalement, cette rémission
clinique est accompagnée d’une cicatrisation des lésions. Ces dernières années l’approche de
traitement dit séquentielle (« Step-Up ») utilisant en premier lieu les médicaments les moins toxiques
mais également potentiellement moins efficaces, s’est vue opposée une approche plus agressive
(« Top-Down ») où les agents les plus efficaces, comme les agents biologiques et les
immunosuppresseurs, sont utilisés dès le diagnostic (89). L’idée de cette approche maximaliste est
d’arriver à modifier l’histoire naturelle de la maladie pour éviter certains dommages irréversibles. Quelle
que soit l’approche thérapeutique envisagée, l’utilisation des TP a considérablement augmenté au cours
des deux dernières décennies (90). Ils sont utilisés chez un plus grand nombre de patients et de plus en
plus tôt après le diagnostic voire dès celui-ci. L’AZA et MP sont indiqués comme traitement de maintien
de la rémission de la MC et de la RC (91-93). Ils ont montré une efficacité dans les atteintes périnéales
fistulisantes de la MC (23, 94). Ils sont également efficaces dans la prévention de la formation des autoanticorps anti-infliximab (95, 96) ainsi que dans la prévention de la récidive post-opératoire de la MC
(97).
36
1.4.2 : Utilisation des TP aux Cliniques universitaires Saint Luc chez les patients MICI
Au cours de ces deux dernières années, nous avons élaboré une base de données (IDB) spécifique aux
MICI. Elle est accessible via internet sur un site protégé, par l’intermédiaire d’un nom d’utilisateur et
d’un mot de passe. Le but est d’utiliser la base de données au quotidien, lors de la visite du patient afin
d’encoder au fur et à mesure les informations et maintenir à jour les fichiers. De plus, pour stimuler
l’utilisation de cette base de données, il est prévu qu’après chaque visite un rapport de consultation
puisse être directement généré. Cette base de données est encore loin d’être parfaite mais est
améliorée au fur et à mesure des erreurs ou défauts rencontrés et la rapidité d’exécution informatique
est en constante amélioration.
L’ensemble des patients MICI suivis au sein des Cliniques universitaires saint Luc n’a pas encore été
inclus dans IDB. C’est donc une analyse d’un échantillon de notre population MICI qui est décrite dans
le tableau ci-dessous. Par ailleurs, pour chaque patient encodé, l’ensemble des données n’a pas
toujours pu être collecté (nouveau patient, données incomplètes au diagnostic,….).
Une sélection des données récoltées est reprise dans le tableau 5, et notamment celles qui se réfèrent
plus particulièrement à l’utilisation des TP.
La classification de Montréal est utilisée pour décrire les profils de maladies (98, 99) :
-
Age au diagnostic : A1 : < 16 ans, A2 : entre 17 et 40 ans, A3 : > 40 ans
Pour la maladie de Crohn :
- Topographie des lésions : L1 : iléale, L2 : colique, L3 : iléocolique, L4 : tractus digestif supérieur isolé.
- Comportement : B1 : inflammatoire (Non B2, Non B3), B2 : sténosant, B3 : pénétrant.
p0 : pas d’atteinte périnéale, p1 : atteinte périnéale.
Pour la rectocolite :
Topographie : E1 : limitées au rectum, E2 : jusqu’à l’angle gauche, E3 : au-delà de l’angle gauche.
37
Tableau 5
Base de données MICI 434 patients
(15 mars 2012)
Maladies
297 M. de Crohn
129 Rectocolite
MC :
RC :
CI 4 ♀/4♂
162 ♀/ 135 ♂
61♀/ 68 ♂
Age moyen: 40 ans
MC: 39 [14-84]
RC: 42 [15-82]
24,9 ans
32,3 ans
14,3 ans
9,6 ans
Distribution de l’âge au
A1= 69 (25 %)
A1= 21 (18%)
diagnostic
A2= 192 (68 %)
A2= 63 (54%)
A3= 19 (7 %)
A3= 33 (28%)
8 colites indéterminées
Répartition 227 ♀ / 207 ♂
Age moyen au moment du
diagnostic
Durée moyenne d’évolution
Localisation de la maladie au
L1= 41 (17 %)
p1= 58 (24%)
E1: 21 (21%)
diagnostic
L2= 102 (43%)
p0 = 180 (76%)
E2: 49 (49%)
L3= 70 (30%)
E3: 30 (30%)
L4= 23 (10%)
Comportement de MC au
B1=119
diagnostic
B2=61
B3=35
Nombres de patients
fumeurs ou anciens fumeurs
120 (40%)
38
25 (19%)
Base de données MICI 434 patients
Nombre de patients testés pour la TPMT
Résultats tests TPMT
125
2 homozygotes déficients (2%)
17 hétérozygotes (14 %)
Nombre de patients qui ont reçu un
222 (51 %)
traitement par AZA et/ou MP
par MTX
32 (7%)
par Ciclosporine
15 (3 %)
par Anti-TNF
155 (36 %)
(infliximab ou adalimumab)
Nombre de patients qui ont présenté un
Nombre de patients traités par TP
effet secondaire donné sous TP :
N = 222 patients
effet secondaire
64 /222 (29 %)
(tout effet secondaire confondu)
stoppé définitivement pour leucopénie
5 /222 (2 %)
pour pancréatite
16 /222 (7 %)
pour intolérance digestive (nausées,..)
17 /222 (8 %)
pour Rash, Fièvre, Σ grippal, myalgies,.
18 /222 (8 %)
pour toxicité hépatique
8/222 (4 %)
pour infection, cancer ou lymphome
0
La fréquence des différents effets secondaires sous TP observée dans notre cohorte est en accord
avec les données de la littérature décrites dans le chapitre suivant (1.5).
39
1.5 : Effets secondaires des Thiopurines
Chez près d'un tiers des patients l'efficacité des TP n'est pas obtenue à cause de la survenue d'effets
secondaires (EII) amenant soit à une réduction de dose soit à un arrêt complet de la prise du
médicament (100).
Dans 2 méta-analyses, la prévalence des effets secondaires des TP qui ont amené au retrait du
traitement variait de 5,8 à 9,3% (91, 92). Dans une des études reprises dans ces méta-analyses, le taux
d’EII atteignait 40 % (101).
La prévalence des effets secondaires des TP semble plus élevée en cas de MICI que pour d’autres
indications (sclérose en plaque, hépatite auto-immune,…)(102-104).
Ces EII sont généralement divisés en 2 types :
- dose-dépendant,
- dose-indépendant (ou immuno-allergique).
Parmi les effets secondaires immuno-allergiques, on retrouve la pancréatite, la fièvre, les myalgies et
arthralgies, le rash et certains types d'hépatites.
Les effets secondaires liés à la dose et à la durée d'exposition comprennent les infections, les cancers,
certaines hépatites et les leucothrombocytopénies.
Des symptômes gastro-intestinaux, comme des nausées et vomissements ainsi que des douleurs
abdominales, sont fréquents mais généralement légers. Ils surviennent précocement après le début du
traitement et s'améliorent lors de la réduction de la dose ou spontanément.
Dans le tableau 6, la toxicité des TP selon le mécanisme dose-dépendant ou indépendant est décrite
dans une cohorte MICI historique du Mont Sinai Hospital à New York.(105)
40
N=396 patients
Tableau 6 : toxicité des TP
dose-indépendant
Réactions type allergique
• Pancréatite (13) 3.3 %
• Fièvre
2%
• Rash
• Malaise
• Diarrhée
• Hépatotoxicité 0.3 %
dose-dépendant
Reactions type non-allergique
• Leucopénie
2-5%
• Thrombocytopénie
• Infections (29)
7.4 %
• Cancer (12)
3.1 %
• Hépatotoxicité
0.3 %
Present et al,Ann Intern Med,1989
1.5.1 Effets secondaires doses-indépendants ou immuno-allergiques
a. La pancréatite.
La fréquence de la pancréatite est évaluée à 1,3 à 5 % des cas de tous les patients MICI traités par
AZA/MP (106) voire jusqu’à 15 % dans une série (107). Les premiers cas ont été publiés il y a 40 ans
(108, 109).
Le diagnostic de pancréatite aiguë est, dans la plupart des cas, facile grâce aux données cliniques,
biologiques et morphologiques : élévation de plus de 3X la limite supérieure de la norme des tests
pancréatiques (amylases et lipases) ET douleurs abdominales ET anomalies morphologiques du
pancréas à l’imagerie. L’imputabilité du médicament est, par contre, difficile à établir et il s’agit, le plus
souvent, d’un diagnostic d’exclusion devant écarter toutes les autres causes de pancréatite. La
pancréatite d’origine médicamenteuse est relativement rare : elle ne représente que environ 2 % de
l’ensemble des pancréatites retrouvées dans la population générale (110, 111). Le seul critère formel
permettant d’affirmer l’origine médicamenteuse d’une pancréatite est la récidive de celle-ci après
41
réintroduction du médicament. Pour des raisons évidentes, cette épreuve ne peut être proposée lorsque
la toxicité pancréatique du médicament a déjà été reconnue.
Il existe deux « classifications » ou deux manières de définir la responsabilité d’un médicament dans la
survenue d’une pancréatite médicamenteuse :
1. la classification de Mallory, qui suit essentiellement des critères chronologiques pour définir
l’imputabilité d’une pancréatite à un médicament (112) :
- la pancréatite apparaît durant le traitement médicamenteux. Plus le délai de survenue entre le début
du traitement et la survenue de la pancréatite est court, plus le médicament est suspect,
- la pancréatite se résout à l’arrêt du médicament,
- la pancréatite récidive lors de la réintroduction du médicament : argument d’imputabilité majeur !
- aucune autre cause de pancréatite n’est retrouvée.
L’association est jugée certaine si les 4 critères sont retrouvés. Elle est probable si tous les critères sont
réunis sauf la réexposition. Elle est enfin jugée possible lorsqu’il n’existe que des niveaux de preuves
incomplets. L’AZA et la MP répondent à ces différents critères. L’imputabilité du médicament a été
établie par des observations de récidive après réintroduction (113, 114) ainsi que par des expériences
animales (115, 116). Un nouvel essai de traitement croisé par AZA ou MP entraînera un nouvel épisode
de pancréatite. Ceci indique, qu’un métabolite situé en aval de la transformation d’AZA en MP doit être
responsable de cette réaction pancréatique. La pancréatite survient typiquement dans les deux à quatre
semaines après le début du traitement (117) et présente une évolution bénigne avec résolution rapide
de la symptomatologie à l’arrêt du médicament, habituellement dans les 1 à 11 jours (114). Il existe de
rares cas de déclenchement tardif (118) ainsi qu’un faible risque de pancréatite grave voire de décès en
particulier s’il existe des facteurs de co-morbidité associés (119). En cas de persistance d'anomalie
pancréatique, une autre étiologie doit être recherchée.
42
2. La classification de Trivedi qui repose sur le nombre de cas rapportés dans la littérature (120) :

Médicaments de classe I : plus de 20 cas rapportés dans la littérature. Au moins 1 cas avec
réexposition positive.

Médicaments de classe II : entre 10 et 20 cas rapportés avec ou sans réexposition positive.

Médicaments de classes III : moins de 10 cas rapportés ou cas non publiés (fichiers
pharmaceutiques ou FDA).
L’azathioprine est un médicament de classe I selon Trivedi : 86 cas rapportés dans la littérature et 16
cas de réexposition positive. Son dérivé la 6-Mercaptopurine est également de classe I : 69 cas
rapportés et 10 tests positifs de réintroduction.
Un phénomène immuno-allergique a été suspecté pour expliquer l’apparition d’une pancréatite sous TP,
notamment sur base des arguments suivants :

récidive précoce et plus sévère après réintroduction,

indépendance par rapport à la dose administrée et notamment élévation des enzymes
pancréatiques 2 heures après ré-administration d’une dose très faible (1 mg) (121).
La Thioguanine (TG) a été essayée avec succès en cas de pancréatite ou autre réaction
idiosyncrasique liée à AZA ou MP (122). En effet en 2003, Dubinsky a mené une étude chez 21 patients
ayant présenté un effet secondaire considéré comme allergique dans les 6 semaines après l’initiation
de la TP. La 6-TG a été prescrite à une dose moyenne de 20 mg/j. Seuls 4/21 patients ont représenté
un EII. Par ailleurs, 82 % des patients qui ont poursuivi le traitement par 6-TG ont présenté une
amélioration de leur MICI. Ces données ont suscité un nouvel engouement pour cette molécule mais
celui-ci a très vite été tempéré par la survenue de complications liées à son hépatotoxicité, comme nous
le verrons plus loin.
Par ailleurs, la pancréatite secondaire aux TP serait plus fréquente en cas de MICI qu'au cours des
autres affections relevant d'une autre indication d'azathioprine (123, 124), sans qu’aucune explication
avérée ne puisse être donnée.
43
Enfin, les TP ne sont pas les seuls médicaments utilisés dans les MICI qui soient potentiellement
dangereux pour le pancréas (cfr tableau 7 ci-dessous). En cas de pancréatite chez un patient MICI, un
relevé complet des différents traitements suivis par le patient est donc indispensable.
Tableau 7 : Médicaments pancréatotoxiques reconnus (125)
Acide valproïque
Didanosine
Mésalazine
paracétamol
Sulfasalazine
asparaginase
énalapril
Méthyldopa
pentamidine
sulindac
Azathioprine
furosémide
Métronidazole
phenformine
tétracycline
cimétidine
Mercaptopurine
Oestrogènes
Prednisone
En gras, les médicaments couramment utilisés dans le traitement des MICI.
b. Le syndrome grippal, myalgies, arthralgies et le rash
Dans la série historique du Mount Sinai Hospital à New York, près de 2 % des patients sous TP ont
présenté un effet secondaire sous TP qui mime un syndrome grippal. Parfois ce sont des myalgies et/
ou arthralgies sans fièvre. Dans notre expérience, nous avons deux cas de patients qui ont présenté
une impotence fonctionnelle majeure quelques jours après le début de l’AZA et qui disparait à l’arrêt de
celui-ci. Chez un des deux patients, la MP a été ensuite introduite avec réapparition du même tableau.
Selon une série publiée par Hindorf, les patients intolérants à l’AZA qui présentent des myalgies ou des
arthralgies peuvent bénéficier du remplacement par la MP : près de 70 % d’entre eux supportent la MP
sans effets secondaires (126).
De plus, il est intéressant de noter que des désensibilisations à l’AZA ont été réalisées avec succès
chez des patients présentant des effets secondaires de type rash ou fièvre (127-129).
44
1.5.2 Effets secondaires doses-dépendants
a. L’intolérance digestive
L’apparition de nausées est fréquente en début de traitement par AZA. Celles-ci peuvent être
retrouvées jusque dans 11 % des cas et sont souvent transitoires. On observe souvent une disparition
des symptômes soit de façon spontanée soit après réduction de la dose d’AZA. Le dérivé imidazolé
(NMI) issu de la conversion d’AZA en MP semble être responsable de la survenue de cet effet
secondaire dans la majorité des cas. En effet, la prescription de MP en remplacement d’AZA permet
d’éviter ces nausées dans 50 à 75 % des cas (126, 130-134). Un phénomène similaire est observé en
cas de douleurs abdominales ou de diarrhées.
b. La toxicité médullaire
Il s’agit d’un des effets secondaires les plus sérieux des TP qui peut amener à une leucopénie sévère,
une thrombocytopénie, une anémie ou une combinaison des trois (pancytopénie). Dans certains cas,
cette complication peut mettre la vie du patient en danger notamment en cas de sepsis ou
d'hémorragie.
En analysant les études rétrospectives de patients MICI traités par TP, on retrouve une incidence de
leucopénie et/ou thrombocytopénie qui varie de 2 à 5 % (105, 135). Deux méta-analyses s'intéressant
aux patients souffrant de M. de Crohn traités par TP retrouvent des incidences de leucopénie variant de
1,4 à 1,7 % (91, 136). Un même type de méta-analyse, cette fois dans la Rectocolite, rapporte une
incidence de 3,9% de leucopénie (93) .
Dans une revue reprenant 8302 patients de 66 études différentes et s'intéressant aux patients MICI
souffrant de myélotoxicité induite par les TP, l'incidence cumulée de myélotoxicité induite par AZA/MP
était de 7 %. Le taux d'incidence (par patient et année de traitement) était de 3 % (137). Les différences
d'incidence de myélotoxicité dans les différentes études rapportées peuvent être partiellement
45
expliquées par les valeurs seuils différentes (de 2 à 4000/ml) utilisées pour définir une leucopénie
induite par le médicament.
Cette myélotoxicité peut survenir à n'importe quel moment après le début du traitement par TP. Dans la
revue citée, le délai de survenue de la myélotoxicité variait de 12 jours (138) à 27 ans (139) mais la
plupart des cas survenaient durant les premiers mois de traitement.
Parmi les patients souffrants de leucopénie induite par la TP, 6,5 % vont souffrir d'une infection
(incidence cumulée) et trois décès dus à une septicémie ont été rapportés (135, 137, 140). La
fréquence de manifestations hémorragiques dues à la thrombocytopénie semble être faible puisque
rarement rapportée.
Alors que les patients souffrant de myélotoxicité doivent parfois être hospitalisés, les données
concernant les taux et les durées d'hospitalisation sont habituellement manquantes dans les différentes
études.
c. L’hépatotoxicité.
L’hépatotoxicité des TP peut résulter de 3 mécanismes différents : une hypersensibilité, une toxicité
liée à la dose ou suite à des lésions induites au niveau de l’endothélium des sinusoïdes hépatiques. Les
manifestations peuvent être diverses.
 C1 : Anomalies des test hépatiques:
La prévalence des anomales biologiques hépatiques chez des patients traités par TP pour leur MICI a
été étudiée chez 161 patients (141). Il s’agissait d’une étude prospective portant sur une période
médiane de 271 jours. Les anomalies biologiques hépatiques étaient définies par la présence de
transaminases (ALT) ou de phosphatases alcalines supérieures à 2 fois les valeurs normales et ont été
rencontrées chez 10 % des patients. La perturbation portait plus fréquemment sur les transaminases
que sur les phosphatases.
46
Dans plus de 50 % des cas, ces anomalies surviennent durant les 3 premiers mois de traitement. Les
TP ont été définitivement stoppées dans 31 % des cas, diminuées temporairement et ensuite ramenés
à la dose initiale dans 44 % des cas. L’hépatotoxicité observée semblait liée à de multiples facteurs : la
dose de TP journalière utilisée, les traitements associés (corticoïdes), le statut nutritionnel du patient,
des interactions médicamenteuses,….. Des anomalies hépatiques sur TP peuvent être observées à des
intervalles variables (2 jours à 8 ans)(142).
Gisbert a réalisé une revue systématique de toutes les études qui ont répertorié les anomalies
hépatiques dues aux TP (143). Lorsqu’on ne prend en compte que les études avec suivi des patients,
2992 patients ont été suivis pendant une durée totale de 6952 ans. La prévalence moyenne de
problèmes hépatiques sous TP était de 3 %. L’incidence de l’hépatotoxicité (définie par un taux d’ALT
augmenté) était de 1,4% par patient et par année de traitement. Il s’agissait essentiellement d’études
rétrospectives ; et ces valeurs basses contrastent avec une incidence dépassant les 10 % retrouvée
dans l’étude prospective citée plus haut (141).
Comme évoqué, un petit pourcentage de patients vont présenter, à un moment de leur traitement par
TP une petite perturbation des tests hépatiques qui n’a pas d’implications cliniques et les tests
redeviennent normaux au cours du suivi sans qu’un ajustement de dose n’ait été nécessaire.
Cependant, lorsque les anomalies des tests hépatiques sont plus marquées, une réduction de dose de
50 % peut être préconisée. Le suivi clinique et biologique ultérieur montre souvent une normalisation
des tests, et la dose initiale de TP peut souvent être prescrite à nouveau (141).
Dans de rares cas, les TP peuvent induire un ictère cholestatique sévère qui ne régresse pas, voire
progresse, malgré l’arrêt du traitement (143). Dès lors, il est recommandé de stopper les TP (et pas
seulement de diminuer la dose) en cas d’ictère.
47
 C2 : Anomalies du réseau vasculaire hépatique
C2.1 : L’hyperplasie nodulaire régénérative (HNR)
L’HNR est une maladie hépatique rare que l’on définit par la présence de nodules dans le parenchyme
hépatique sans qu’il y ait d’anneaux fibreux autour et qui a pour possible conséquence le
développement d’une hypertension portale sévère. Historiquement, l’intérêt des gastro-entérologues
s’occupant de MICI pour l’HNR est apparu avec l’utilisation de la 6-thioguanine.
Au début des années 2000, la 6-thioguanine a été utilisée avec un certain succès chez des patients
MICI qui ne toléraient pas les TP du fait de la survenue d'une pancréatite, de manifestations immunoallergiques et/ou d'hépatites (122). Malheureusement, ce traitement s'est fréquemment compliqué d'une
hyperplasie nodulaire régénérative, et, de ce fait, a pratiquement été totalement abandonné aujourd'hui.
Son utilisation est confinée à des cas bien particuliers voire à des études cliniques.
Cette complication a été décrite par l’équipe qui avait « promotionné » la 6-TG : Dubinsky a suivi
l'hémogramme et les tests hépatiques de 111 patients traités par TG (144). Vingt-six pourcent des
patients (29/111) présentaient des anomalies des tests hépatiques et/ou une toxicité hématologique
induite par le traitement. Les anomalies les plus fréquemment rencontrées étaient une augmentation
des enzymes hépatiques et une diminution des plaquettes inférieures à 200.000/mm3. Le suivi de ces
29 patients a révélé que les tests hépatiques ont continué leur ascension tandis que les plaquettes
diminuaient. Une biopsie hépatique a été réalisée chez 17/29 patients qui présentaient des anomalies
biologiques (groupe 1) et chez 9/82 patients qui n’en présentaient pas (groupe 2). L'hyperplasie
nodulaire régénérative a été retrouvée chez 13/17 (76 %) patients du groupe 1 et chez 3/9 patients
(33%) du groupe 2. Il n'y avait pas de corrélation entre la durée du traitement, la dose totale cumulée et
les taux de 6-TGN.
L'hyperplasie nodulaire régénérative n’est pas spécifique à la 6-thioguanine et survient également en
cas de prescription d’AZA ou de MP avec une incidence cependant beaucoup moins élevée. Une étude
du GETAID a répertorié 36 cas d'hyperplasie nodulaire régénérative chez des patients souffrants de
48
MICI traités par AZA ou MP. 29/36 étaient des hommes et 31 présentaient une hypertension portale au
moment du diagnostic. Quatorze patients avaient d'ailleurs présenté une complication sévère de cette
hypertension portale : hémorragie digestive sur varices œsophagiennes chez 9 patients, ascite chez 5.
Une résection iléale a du être pratiquée chez 21 patients, 14 d'entre eux ayant subi plusieurs résections
chirurgicales. Deux facteurs ont été associés au risque de développer une HNR en cas de traitement
par TP : le genre masculin et la résection iléale. Seksik et coll (145) ont rapporté 15 cas de HNR après
une médiane de traitement de 52 mois d’AZA dans une cohorte de 1888 patients, soit une prévalence
estimée de 0,7 %. Ce chiffre peut cependant être sous-estimé étant donné que la biopsie hépatique n'a
été réalisée que chez les patients qui présentaient une thrombopénie. Les facteurs de risque retrouvés
étaient à nouveau le genre masculin et un antécédent de résection iléale. Un homme qui a subi une
résection iléale et qui a été traité par AZA présenterait un taux actuariel d’HNR de 11,4 +/- 5,1 % à 10
ans après le début du traitement.
La découverte de cette complication sévère a deux implications pratiques dans le suivi des patients
traités par TP (142). La première est de dépister une possible cholestase anictérique et/ou une
diminution des plaquettes. La deuxième est de prescrire des explorations morphologiques pour identifier
l'étiologie des anomalies biologiques observées. La résonance magnétique est probablement la plus
utile de même qu'une biopsie hépatique avec coloration de la réticuline. Cette démarche devrait
s'avérer suffisante pour éviter un diagnostic tardif (dû à une surveillance insuffisante) ou excessif d’HNR
(où toute anomalie observée serait faussement attribuée à cette étiologie).
La physiopathologie de l’HNR est mal connue. Elle pourrait résulter d’une vascularisation inhomogène
du parenchyme hépatique entrainant une atrophie des hépatocytes dans les territoires mal perfusés et
une hyperplasie compensatrice dans les territoires normalement vascularisés. L’HNR induite par les TP
semble être consécutive aux lésions des sinusoïdes suite à une déplétion des cellules en glutathion et
éventuellement à la formation de petites veinules extra-hépatiques (dilatation sinusoïdales, péliose,
fibrose périsinusoidale et maladie veno-occlusive). L’HNR a également été associée à des facteurs
49
thrombogènes comme l’hyperhomocystéinémie. Celle-ci est favorisée par des déficits en Vit B6
(pyridoxine), B9 (folates) et B12 (cobalamine), que l’on rencontre fréquemment en cas de maladie de
Crohn iléale notamment après chirurgie de résection iléale. Dès lors, une surveillance des taux de
vitamine B12 et d’acide folique, ainsi que leur supplémentation en cas de carence, semble indiquées en
particulier chez les patients ayant subi une résection grêle afin de tenter de prévenir le développement
d’HNR (146).
C2.2 : syndrome d’obstruction sinusoidal
Ce syndrome correspond à une obstruction fibreuse, non thrombotique, de la veine centrolobulaire. Le
diagnostic est histologique et est basé sur la présence de dilatation des sinusoïdes dans la zone
centrolobulaire associée à une atrophie voire à une nécrose des hépatocytes, ou même dans les
formes les plus sévères à une hyperplasie nodulaire régénérative. La manifestation principale est liée à
l'hypertension portale et donc au développement progressif d'une ascite. Une cholestase anictérique
peut être observée et, dans les formes plus avancées, une thrombopénie induite par l'hypersplénisme
secondaire à l'hypertension portale. Un syndrome d'obstruction sinusoïdale a été observé chez des
patients MICI traités pendant un à deux ans par TP (147, 148). Dans la plupart des cas, la maladie était
lentement progressive bien qu'un cas d’obstruction aigüe ait été rapporté chez un patient souffrant de
MC et traité par Thioguanine (148).
Une étude in vitro utilisant des cultures de cellules murines endothéliales et hépatocytaires a démontré
que lorsque ces cellules étaient exposées à de l'AZA, elles subissaient une altération associée à une
déplétion en glutathion (149). Aucune étude sur l'association de lésions endothéliales hépatiques et du
statut de la GST n’a été réalisée à ce jour.
50
 C3.Autres atteintes hépatiques
Hépatocarcinome
Quatre cas d’hépatocarcinome, où aucune maladie hépatique prédisposante n’avait été retrouvée, ont
été rapportés dans la littérature chez 3 patients MC et 1 patient RC, tous exposés à de l'AZA (150, 151),
Aucune conclusion ne peut être tirée de ces rares cas.
d. Les infections
L’apparition d’une infection peut évidemment résulter de la survenue d’une leucopénie induite par les
TP (137). Une série historique de patients traités par TP pour MICI révèle un taux d’infections évalué à
7,4%, dont 1,8 % ont été jugées sévères (105).
 D1. Les infections virales
La survenue d'une fièvre, d'un rash cutané, d'une cytopénie brutale, d'une pneumopathie interstitielle ou
une exacerbation brutale des signes digestifs doit faire rechercher une infection à CMV ou à EBV.
Des zonas peuvent être rencontrés : dans une série de 550 patients traités par TP, et suivis pendant 25
ans, 12 cas de zona ont été rapportés (152). Parmi ces 12 cas, 9 étaient bénins, 2 avaient une
localisation ophtalmique et 1 s’est compliqué d’une encéphalite de courte durée et non compliquée. Il
apparait que le risque de développer un zona est légèrement plus élevé chez les patients MICI traités
par TP que chez les patients MICI en général. Une diminution ou un arrêt temporaire des TP est
généralement décidé, mais cela n’est peut être pas nécessaire. Après traitement par acyclovir, et
résolution du zona, les TP peuvent être repris s’ils sont toujours indiqués dans le traitement de la MICI.
 D2. Les infections opportunistes
Le risque d'infection opportuniste, est considéré comme très faible en cas de traitement isolé par
l'azathioprine à la posologie usuelle et ne justifie pas de traitement prophylactique de la
pneumocystose.
51
 D3. Prévention des infections
Comme évoqué, les complications infectieuses sont peu fréquentes et rarement sévères. Par ailleurs,
les TP peuvent avoir un effet bénéfique indirect sur la prévention des infections. En effet, ils permettent
d’utiliser moins de corticoïdes chez les patients MICI. Or, parmi les médicaments utilisés dans le
traitement des MICI, ce sont les corticoïdes qui constituent le principal facteur de risque d’infection. Le
registre prospectif TREAT, qui regroupe plus de 6000 malades MICI, a mis en évidence que parmi les
médicaments utilisés pour traiter la maladie, seuls les corticoïdes augmentent significativement le risque
d’infections (OR, 2.21; 95% CI, 1.46-3.34; P<.001). Ce sur-risque n’est pas retrouvé pour les TP ou les
anti-TNF.
e. Les néoplasies
Les lymphomes
Les patients transplantés traités entre autres par TP ont un risque augmenté de développer une
pathologie lymphoproliférative (153), souvent associée à une infection à EBV (154).
Dans le cas de MICI, des études de population n’ont pas révélé de sur-risque de lymphome par rapport
à la population générale. Par contre, des données contradictoires existent en ce qui concerne
l’utilisation de TP en cas de MICI et une incidence augmentée de désordres lymphoprolifératifs. Les
données les plus consistantes proviennent de l’étude CESAME. Beaugerie et coll. ont démontré, sur
une cohorte nationale française de plus de 19000 patients, qu’il existait bel et bien un risque augmenté
de lymphome en cas de traitement d’une MICI par TP(155). En analyse multivariée, le Hazard ratio était
de 5,26 (IC 95% : 2,20-12,6. P=0,0002) pour les patients traités par TP versus ceux qui ne l’avaient
jamais été. Par ailleurs, il a été suggéré que le sur-risque de lymphome en cas de MICI serait
directement lié à l’activité inflammatoire de la maladie et que l’utilisation de TP ne serait que le reflet de
cette inflammation tout comme cela été observé en cas de polyarthrite rhumatoïde (156). De même,
dans l’étude CESAME, la durée d’évolution de la maladie était également un facteur de risque
52
indépendant lié au développement d’un désordre lymphoprolifératif. Cependant, les patients qui ont
interrompu leur traitement par TP retrouvaient un risque similaire à celui des patients n’ayant jamais été
traités par TP. Enfin, dans un sous-groupe de patients de la cohorte, l’activité de la maladie a été suivie
et n’est pas apparue différente dans les groupes traités ou non par TP. L’activité clinique de la MICI
était augmentée et le risque de lymphome diminué chez les patients qui avaient stoppé le traitement par
TP par rapport aux patients toujours sous TP. Ces données suggèrent donc fortement que le risque
lymphoprolifératif rencontré en cas de traitement par TP est bel et bien lié à l’effet immunosuppresseur
de la TP plutôt qu’à l’activité de la MICI.
Ces dernières années, l’attention a été attirée sur les lymphomes hépatospléniques, entités rares mais
mortelles dans la plus grande majorité des cas. Trente-six cas ont été rapportés dans le monde (157),
dont 20 étaient traités conjointement par anti-TNF et TP et 16 par TP uniquement. Sur les 31 patients
dont le genre était rapporté, on ne retrouvait que 2 femmes, et 27 des 30 patients dont l’âge était connu
avaient moins de 35 ans. Aucun cas de lymphome hépatosplénique n’a été rapporté sous anti-TNF en
monothérapie. Les auteurs concluaient que la prescription de TP et d’anti-TNF ne doit être considérée
chez des jeunes hommes qu’en cas de bénéfice clairement démontré : phase précoce de la maladie
chez des patients non-traités ou pour des situations très sévères.
Cancers cutanés non mélaniques
De la cohorte CESAME, il apparait que les cancers cutanés non-mélaniques sont plus fréquents chez
les patients MICI qui ont été traités par TP (158). Dès lors, il est recommandé d’informer les patients de
ce risque, de les encourager à se protéger des rayons UV et à observer un dépistage dermatologique
tout au long de leur vie.
53
Autres cancers
Il n’y a pas actuellement d’arguments démontrant que les TP augmentent le risque de développer
d’autres cancers chez les patients MICI. L’incidence du cancer n’était pas plus élevée comparée à la
population générale dans 2 grandes cohortes de patients MICI traités par TP (105, 159). Par ailleurs, on
ne retrouve pas de cancers dans les essais randomisés contrôlés repris dans la méta-analyse (136).
Néanmoins, il convient d’encourager les patients à suivre les dépistages organisés dans la population
générale.
54
Chapitre 2 : Relations entre métabolisme et effets secondaires des TP
2.1 : Impact des différentes activités TPMT
2.1.1 : Activité TPMT basse : LM/IM
Si un traitement par TP est débuté chez un patient présentant une activité de la TPMT basse ou
intermédiaire, le métabolisme du médicament va être dévié vers une production accrue de composés
actifs, responsable non seulement de l'effet thérapeutique du médicament mais également de sa
myélotoxicité.
Dans une étude incluant 262 patients souffrant de MICI, un génotype déficient pour la TPMT était
prédictif de la survenue d'une leucopénie avec un odd ratio de 6,32 comparativement au génotype
TPMT homozygote normal (160).
Une méta-analyse de 67 études, pratiquement toutes rétrospectives, s’est intéressée au risque de
développer une myélosuppression en fonction du statut TPMT déficient (LM) ou intermédiaire (IM).
86 % des patients LM ont développé une myélotoxicité. L’augmentation du risque relatif était de 4,19 (IC
95% : 3,2-5,48) pour les IM comparativement aux TPMT « wild-type » (HM) (161).
Il est dès lors généralement admis qu'une adaptation de la dose de TP est nécessaire en cas de
déficience en TPMT. Pour un patient présentant une activité TPMT intermédiaire, une réduction de 33
à 50 % de la dose usuelle est recommandée, soit 1,25 mg/kg pour l'AZA et 0,5 à 0, 75 mg/kg pour la
MP. Cette stratégie a été appliquée dans une étude prospective, où une dose adaptée a permis d'éviter
tout événement de leucopénie (162). Une même adaptation de dose a été efficace dans un travail
prospectif récent chez 75 patients MICI : l'activité TPMT et la mesure des métabolites des TP ont été
utilisés pour prédire la dose de TP nécessaire (163).
En cas de déficience complète de la TPMT (LM), il est habituellement recommandé d'éviter l'utilisation
des TP, ou si son utilisation est indispensable, de diminuer la dose administrée à 10 % de la dose
usuelle et d’assurer un suivi très précautionneux notamment par de très fréquents contrôles sanguins
(164).
55
En 2000, Colombel et al ont publié une série de 41 patients souffrant de maladies de Crohn et traités
par azathioprine qui ont présenté une leuco et/ou thrombocytopénie (165). Ils ont étudié la présence
des mutations TPMT en ciblant les 9 variants alléliques connus à l’époque: *2,*3A,*3B,*3C,*4,*5,*6,*7 et
*10 (nouvelle mutation décrite au cours de l’étude). Dans cette étude, une déficience de la TPMT
(partielle ou complète) ne permettait d’expliquer que 27 % de tous les événements myélotoxiques
observés.
En 2001, une autre équipe a démontré que certains patients présentaient une activité TPMT basse
alors que l'analyse de leur génotypage TPMT ne retrouvait aucune des mutations connues (166). Ce
fait suggérait l'hypothèse que toutes les mutations possibles du gène de la TPMT n’avaient pas encore
été découvertes.
Effectivement, au cours de ces dernières années d’autres mutations de la TPMT ont été décrites pour
aboutir à un total de 30 mutations différentes (voir annexe 1). L'impact clinique de ces différentes
mutations restait encore à déterminer. Dans ce contexte, nous avons réalisés l’étude suivante :
Impact d’un génotypage extensif de la TPMT dans la prise en charge de la myelosuppression
induite par les TP chez des patients MICI (annexe 3)
Nous avons réalisé cette étude rétrospective multicentrique afin d'évaluer l'impact d'un génotypage
extensif de la TPMT dans une population de patients MICI qui ont présenté un épisode de
myélosuppression (MS) alors qu'ils étaient sous traitement par TP (AZA ou MP)(167).
Le but était notamment de comparer les caractéristiques cliniques des épisodes de MS en fonction du
statut TPMT normal ou déficitaire. Enfin, nous avons étudié l'impact d'une ré-administration de TP sur la
survenue éventuelle d’un nouvel épisode de MS.
56
Cohorte de patients
61 patients (âge médian de 39 ans [15–75 ans], souffrant de MICI (48 MC et 13 RC, 33 hommes et 28
femmes) ont été rétrospectivement inclus après approbation du comité d'éthique et obtention du
consentement. Seuls les patients qui avaient développé une MS (définie comme un taux de globules
blancs inférieur à 3000/mm3 et/ou une thrombocytopénie définie comme un taux de plaquettes inférieur
à 100.000/mm3) sous traitement par TP ont été inclus. La dose médiane d’AZA était de 100 mg par
jour (50 – 250) et 2 mg/kg (0,7 - 2,5). Les informations concernant le délai de survenue de la MS, la liste
des médications concomitantes, les caractéristiques de l'épisode de MS et les traitements requis, de
même que la fréquence et la durée des hospitalisations nécessaires ont été collectées. Les données de
chaque patient sont reprises dans le tableau 8 et le résumé des résultats dans le tableau 9.
Méthodes
Pour chaque patient, 30 ml de sang veineux ont été recueillis dans des tubes EDTA, au minimum
quelques semaines après l'épisode de MS, et ont été envoyés à un laboratoire central pour une
analyse. Un génotypage extensif à la recherche des mutations de TPMT ( *2,*3A,*3B,*3C,*3D,*4,
*5,*6,*7,*8,*9,*10,*11,*12,*13,*14,*15,*16,*17,*18,*19,*20,¨21,*22,*23,*24,*25) a été réalisé entre les
exons 4 et 10 (51).
Tableau 8 ; résultats détaillés pour chaque patient : légende
LM: methylateur bas, IM: méthylateur intermédiare, HM: haut méthylateur, delay: durée du
R/ par AZA au moment de l’épisode de MS, WBC: white blood cells count, Hb: hemoglobin,
5ASA: mesalazine, SZP: sulphasalazine, CS: methylprednisolone, Hospit: hospitalisation et
durée en jours, [RC]: transfusion de globules rouges concentrés, [P]: transfusion de
plaquettes, AB: antibiotique, M.puncture: ponction médullaire, ↕ : AZA définitivement stoppé;
↓ : dose d’ AZA diminuée ; ↕ and → : AZA stoppé et réintroduit. 50 mg: dose d’AZA atteinte.
57
Pt
Sex
Age
(Ys)
IBD
TPMT alleles
(predicted
phenotypes)
(mg/d)
(mg/
kg)
*3A/*3C (LM)
100
AZA
dose
AZA
Delay
(mo)
WBC
/mm³
Platelets
X103/mm³
Hb
(g/dl)
Concomittant
medications
1
1,25
680
5000
6
NSAID
100
2
2
3100
3000
5,3
5ASA 3 g/d, CS 12 mg
Complications
Fever, Bleeding,
purpura
Fever, Bleeding,
purpura
Upper respiratory
infection
Hospit.
(days)
Medical
intervention
Aza outcome
15
AB, [RC], [P]
↕
31
AB, [RC]
↕
10
AB, [RC]
↕ and → 50 mg
1
F
50
CD
2
F
28
UC
3
M
19
UC
*3A/*3C (LM)
125
2
2
2600
362000
7,5
5ASA 500 mg/d
4
M
17
CD
*3A/*3A (LM)
75
1
5
2250
114000
5,9
5ASA 3g/d
No
No
No
↕
5
6
7
8
9
F
F
F
F
F
49
18
18
38
15
CD
CD
CD
CD
CD
*2*/*3A (IM)
*1/*3A (IM)
*1/*3A (IM)
*1/*3A (IM)
*1/*3A (IM)
100
75
100
100
90
1
1,5
2
2
2,5
1
1
1,5
2
2,75
640
2610
2600
2400
2600
79000
233000
344000
204000
228000
7,5
11,4
9,7
8.7
8,6
Sepsis Staph.aureus
No
No
No
No
42
No
No
No
No
AB, [RC]
No
[RC]
[RC]
No
↕
↕ and → lower dose
↕
↓ to 50 mg
↓ to 20 mg 6MP
10
M
65
CD
*1/*3A (IM)
150
1,9
2,75
1860
234000
9,5
No
No
No
↕ and → 150 mg
11
12
13
M
M
F
55
42
17
UC
UC
CD
*1/*3A (IM)
*1/*3A (IM)
*1/*3A (IM)
150
125
75
2
2,3
1,2
3
5,5
5
2200
2180
2400
131000
266000
201000
5,7
10,4
10,5
5ASA 3 g/d, CS
5ASA 2 g/d
No
5ASA 1 g/d
5ASA
Cholestyramine,
5ASA 3g, Loperamide
5ASA 3 g/d
5ASA3 g/d
5ASA 3 g/d
No
Pneumonia
No
4
17
No
↕
↕ and → 50 mg
↓ to 25 mg → 75 mg
14
M
42
UC
*1/*3A (IM)
150
1,9
6
1580
79000
5,1
5ASA 3 g/d,
Allopurinol (5 wk)
asthenia, tinnitus
2
15
16
17
18
F
M
F
M
50
43
45
28
CD
CD
CD
CD
*1/*3A (IM)
*1/*1 (HM)
*1/*1 (HM)
*1/*1 (HM)
50
150
100
100
0,9
1,9
1,5
1,6
60
0,37
1
1
2260
1680
1700
2240
130000
78000
245000
163000
11,4
11,4
10,7
11,4
No
No
budesonide 9 mg
No
No
Fever
No
Fever
No
No
No
No
19
M
51
UC
*1/*1 (HM)
100
1,2
1
1700
212000
10,3
5ASA 4g/d , CS 32 mg
Listeria Meningitis
33
[RC] 4 U
No
No
M. Puncture,
Growth F., AB,
[RC] 6 U
No
No
No
AB,
AB,
granulocytes
No
No
No
↕ and → 75 mg
No
No
No
↕
25
AB, [RC]
↕
No
No
6
No
No
[RC]
↓ to 50 mg
↓ to 100 mg
↕
18
AB, [RC]
↕
8
No
No
No
No
No
↕
↕
↕ and → 100 mg 6MP
*2/*2
(LM)
Valproate, , CS 8 mg/d,
5ASA 3g Levetiracetam
5ASA 3 g/d
20
F
37
UC
*1/*1 (HM)
150
2,5
1,25
2040
302000
8,9
21
M
74
CD
*1/*1 (HM)
150
2
1,25
2560
175000
13,5
22
M
54
CD
*1/*1 (HM)
150
1,9
1,25
2300
291000
6,9
bumetanide, 5ASA,
AAS, spironolactone
Staph Aureus seps.
angor // anemia
23
24
25
M
M
F
43
25
32
CD
CD
CD
*1/*1 (HM)
*1/*1 (HM)
*1/*1 (HM)
175
200
150
1,9
2,4
2,2
0,5
1,5
1,75
4100
2100
2100
91000
167000
97000
13,6
12,7
8,2
5ASA 3 g/d
5ASA 2 g, infliximab
5ASA 3 g/d
26
M
54
CD
*1/*1 (HM)
100
2,2
2
640
20000
7,3
5ASA 3 g, CS 8 mg
27
28
29
M
M
M
34
44
55
CD
CD
CD
*1/*1 (HM)
*1/*1 (HM)
*1/*1 (HM)
150
100
150
2,4
1,3
2,4
2,5
2,5
2,75
2240
2600
2500
163000
254000
200000
10,1
12,7
10
5ASA 3 g/d, CS 16 mg
SZP 3 g/day
5ASA 3 g/d
No
No
No
Fever, asthenia,
dyspnea, anorexia
Fever, sore throat
No
No
58
↕
↕
↕
↕ and → 50 mg
↕
↕
30
31
32
33
34
35
36
F
F
M
M
F
M
M
34
34
58
60
75
29
65
CD
CD
UC
CD
CD
UC
CD
TPMT alleles
(predicted
phenotypes)
*1/*1 (HM)
*1/*1 (HM)
*1/*1 (HM)
*1/*1 (HM)
*1/*1 (HM)
*1/*1 (HM)
*1/*1 (HM)
37
F
22
CD
*1/*1 (HM)
100
2
4,5
2020
159000
6,8
5ASA 3g/d
38
39
40
41
M
M
M
M
45
31
46
39
UC
CD
CD
CD
*1/*1
*1/*1
*1/*1
*1/*1
(HM)
(HM)
(HM)
(HM)
150
100
150
200
2,4
1,7
2,3
2,5
6
6
6,5
8
2590
2510
2250
3230
273000
279000
250000
86000
12,9
11,2
12.5
13
42
M
45
UC
*1/*1 (HM)
100
1,5
9
1700
66000
8,5
43
M
69
CD
*1/*1 (HM)
150
2
9
1100
143000
5,7
44
45
46
M
F
F
29
21
33
CD
CD
UC
*1/*1 (HM)
*1/*1 (HM)
*1/*1 (HM)
150
150
100
1,5
2,2
1,5
9
10
11
1200
2980
2900
80000
203000
113000
5
12,2
16,8
5ASA 3g/d
5ASA 3g, sulpiride
5ASA, CS
No
Spironolactone,
Levetiracetam
acenocoumarol,
citalopram, tilidine
alprazolam,valtran
Allopurinol 300 (3 wk)
5ASA ↕ 2 wk ago
5ASA 4g/d, CS 16 mg/d
47
F
77
CD
*1/*1 (HM)
150
2,3
14
2510
213000
14
No
No
No
No
↓75 mg →100 mg
48
F
17
CD
*1/*1 (HM)
125
2
15
2600
247000
13,3
SZP 2 g/day
infection
No
No
↓ to 25 mg → 100 mg
49
M
67
CD
*1/*1 (HM)
100
1,6
26
1800
201000
6,9
Asthenia, dyspnea
5
AB , [RC]
↕ and → 50 mg
50
51
52
F
M
M
25
40
21
CD
CD
CD
*1/*1 (HM)
*1/*1 (HM)
*1/*1 (HM)
100
100
150
1,5
1,6
2,4
30
30
30
2500
2950
2860
159000
240000
315000
13,9
12,6
13
No
No
No
No
No
No
No
No
No
↕ and → 50 mg
↕ and → 50 →100 mg
↕ and → 100 mg
53
F
16
CD
*1/*1 (HM)
100
2
30
2380
143000
10,4
No
No
No
↕
54
F
34
CD
*1/*1 (HM)
100
2,5
30
820
46000
8,9
flu syndrom
No
AB , [RC]
↕ and → 50 mg
55
F
24
CD
*1/*1 (HM)
150
2,1
36
1970
150000
12,2
EBV infection
No
No
↕ and → 100 mg
56
F
27
CD
*1/*1 (HM)
100
2,3
36
2900
312000
13,7
No
No
No
↕ and → 100 mg
57
58
59
60
61
F
M
F
M
F
30
59
65
43
28
CD
UC
CD
CD
CD
*1/*1
*1/*1
*1/*1
*1/*1
*1/*1
50
150
50
200
100
0,7
2
0,9
2
2,4
36
40
42
63
84
2400
2870
2900
2860
980
330000
216000
NL
216000
269000
12,5
14,3
NL
15,3
7,4
Fever, abdominal pain
No
No
No
Neutropenic fever
5
No
No
No
18
AB and CS
No
No
No
AB, [RC]
↕ and →50 mg
↓ to 100 mg
↓ to 50 mg 6MP/3d
↓ to 150 mg
↕
Pt
Sex
Age
(Ys)
IBD
(HM)
(HM)
(HM)
(HM)
(HM)
AZA
dose
AZA
(mo)
WBC
/mm³
Platelets
X103/mm³
Hb
(g/dl)
Concomittant
medications
2
2
1
1,6
1,5
1,5
1,4
3
3
3,25
3,5
3,75
4
4
2500
2800
2350
1950
2630
2800
1600
338000
243000
272000
264000
179000
205000
248000
11,4
9,3
12,5
9,8
9,6
7,8
6,4
No
5ASA 3 g/d
5ASA 3g/d
budesonide 6mg/d
No
Budesonide 9 mg/d
SZP 3 g/day for 4 wk
(mg/d)
(mg/k
g)
125
100
50
250
75
150
100
Delay
59
Allopurinol 300 (10 wk)
5ASA 2g (12 years)
Lansoprazole 15 mg
5ASA, CS and AB
5ASA 1,5 g/d
1st Inflix. 2 wk before
5ASA 2 g/d, infliximab
CS 2,5-5 mg,
antiepileptic drugs
5ASA 3 g/d
5ASA 3 g/d,
Budesonide 3 mg/d
No
5ASA 3g/d
No
No
Infliximab
Hospit.
(days)
Medical
intervention
No
Asthenia
No
No
No
No
Fever
CMV infection,
pneumonia
No
No
Bronchitis, angina
Gingivorragies
Campylobacter
jejunitis
No
No
No
No
No
No
20
↓ to 75 mg
↕
↓ to 25 mg
↕
↕
↕ and → 100 mg 6MP
↕
No
No
No
No
No
[RC]
No
No
No
No
AB, [RC] 2 U
cymevene, AB,
[RC], M. punct.
No
No
No
No
22
AB, [RC] 2 U
↕
Asthenia
10
[RC]
↕
No
No
No
No
No
No
No
No
No
↕ and → 75 mg
↓ to 100 mg
↕ and → 100 mg
Complications
15
Aza outcome
↕ and → 100 mg
↓ to 100 mg
↓ to 75 mg
↕ and → 25 mg
↕ and → 50 mg 6MP
Tableau 9 : résumé des résultats
60
Résultats
Quarante-six patients (75 %) présentaient le génotypage TPMT normal ou « wild type » (méthylateur
élevé ou high methylator : HM), 11 étaient hétérozygotes pour au moins une mutation non fonctionnelle
(méthylateur intermédiaire : IM) et quatre étaient homozygotes pour un allèle non fonctionnel
(méthylateur bas ou low methylator : LM). Les mutations TPMT identifiées étaient TPMT*2, *3A et*3C.
Les patients homozygotes déficients présentaient les mutations suivantes :*2/*2 chez un patient,
*3A/*3A chez un patient et *3C/*3C chez 2 patients. Parmi les patients hétérozygote, 10 présentaient le
génotype*3A/*1 et un le génotype *2/*1.
Le délai médian entre le début du traitement par TP et la survenue de la MS était de 2 mois (5
semaines à 5 mois) chez les patients LM (génotype méthylateur bas), de 2,75 mois (4 semaines à 6
ans) chez les patients IM (génotype méthylateur intermédiaire) et de 6 mois (11 jours à 7 ans) chez les
patients HM (génotype méthylateur élevé) (figure 8).
Figure 8 : délai entre l’administration de l’azathioprine et la survenue de la myélosuppression
Patient
5
4
3
2
HM
IM
1
0
0,5 1,5 2,5
//
7
9
11
61
/
15
21
//
30
42
//
60
LM
84 Mois
Une leucopénie a été retrouvée chez 58/61 patients (incluant 14 des 15 patients LM+IM), une
thrombocytopénie chez 12 patients (incluant 4/15 patients LM+IM) et une leucothrombocytopénie chez
9 patients (incluant 3/15 patients LM+IM). Une anémie, définie comme un taux d'hémoglobine inférieure
à 10 g/dl a été retrouvé chez 27 patients. Une pancytopénie est survenue chez 8 patients (incluant 3/15
LM+IM).
Les médicaments concomitants au moment de la MS étaient : aminosalicylés (n=40),
méthylprednisolone (n= 10) ; budesonide (n=4) ; infliximab (N=4) ; allopurinol (n=3) ; bumetanide (n=1);
spironolactone (n=2) et AINS (n=4). Aucune médication concomitante n’était administrée chez 11/61
patients.
La complication la plus fréquente était la survenue d'un syndrome infectieux (20/61 patients).
L’infection a été considérée comme sévère chez cinq patients, incluant 2 patients avec pneumonie, 2
avec septicémie à staphylocoques dorés, et une méningite à Listeria. Aucun décès n'est survenu.
Trois patients ont développé des épisodes hémorragiques liés à la thrombocytopénie. Des transfusions
sanguines ont été administrées à 17 patients.
Une hospitalisation a été nécessaire chez 19/61 patients (durée médiane = 15 jours [2 à 42 jours]. Ces
hospitalisations étaient plus fréquentes (7/15 vs 12/46) chez les patients LM+IM, et ceux-ci
nécessitaient proportionnellement plus d'interventions médicales (transfusions et antibiotiques) (8/15 vs
14/46) que les patients HM.
Le résumé des résultats est décrit dans le tableau 9.
62
AZA a été définitivement stoppé chez 25 patients, stoppé et réintroduit progressivement à une dose
similaire chez 9 patients (2 IM, 7 HM) ou à une plus faible dose chez 27 patients (1 LM, 4 IM, 22 HM)
(figure 9).
Six des neuf patients chez lesquels la TP a été réintroduite à une dose similaire ont développé un
deuxième épisode de MS qui a ensuite conduit à un arrêt définitif du traitement. Parmi ces six patients,
2 étaient IM alors que les 4 autres étaient HM.
Sept des 27 patients qui ont reçu une dose diminuée de TP ont développé un deuxième épisode de
leucopénie. Seul un était IM, les 6 autres étaient HM (tableau 8).
Figure 9
Devenir du traitement par AZA
N= 61
AZA définitivement stoppé
N=25
LM N= 3
IM N= 5
TPMT
HM TPMT
N=17
AZA réintroduit pour atteindre la
même dose N=9
IM TPMT
N= 2
HM TPMT
N=7
Nouvel épisode de MS
N= 6/9
IM TPMT
N= 2
HM TPMT
N= 4
63
AZA réintroduit pour atteindre
une dose plus faible N=27
LM N= 1
IM N= 4
TPMT
HM TPMT
N=22
Nouvel épisode de MS
N= 7/27
IM TPMT
N= 1
HM TPMT
N= 6
Tableau 10 : second épisode de myélosuppression chez 13/36 patients
Second épisode de MS lorsque une TP est réintroduite pour atteindre
la même dose ( 6/9 patients)
Pat.
10
13
29
35
39
46
TPMT
*1/*3A
(IM)
*1/*3A
(IM)
WT
(HM)
WT
(HM)
WT
(HM)
WT
(HM)
AZA
Délai 1er
dose /1st
MS (mois)
MS
150 mg
75 mg
150 mg
150 mg
100 mg
100 mg
2.75
5
2.75
4
6
11
ème
AZA dose/
2ème MS
Délai 2
MS
(mois)
Changement des médicaments/ 1er MS
150 mg
1.5
5 ASA stoppé
75 mg
9
5ASA 3g, Infliximab (9 mois)
6
5 ASA stoppé
3
Pas de changement
4ème infusion Infliximab (2,5 mois),
5ASA depuis plus de 10 ans
100 mg
6MP
100 mg
6MP
100 mg
114
100 mg
3
Pas d’autres traitements
Second épisode de MS lorsque une TP est réintroduite pour atteindre
une dose plus faible (7/27 patients)
Pat.
9
30
32
41
45
47
54
TPMT
*1/*3A
(IM)
WT
(HM)
WT
(HM)
WT
(HM)
WT
(HM)
WT
(HM)
WT
(HM)
AZA
Délai 1er
dose /1er
MS (mois)
MS
ème
AZA dose/
2ème MS
Délai 2
MS
(mois)
Changement des médicaments/ 1er MS
90 mg
2.75
10 mg 6MP
2
5 ASA stoppé
125 mg
3
75 mg
4
Pas d’autres traitements
50 mg
3.25
25-25-50
mg (3 jours)
6
1er Infliximab 2 semaine avant,
5ASA 3g depuis des années
50 mg 6MP
40
1 er Infliximab 2 semaines avant
200 mg
8
150 mg
10
100 mg
16
Pas d’autres traitements
150 mg
14
100 mg
2
Pas d’autres traitements
50 mg
21
Pas de changement
100 mg
30
Pat :numéro du patient, AZA : azathioprine, 6MP : 6-mercaptopurine, MS : myelosuppression, (mois)
durée d’exposition au traitement par TP.
Chez tous les patients, la TP a été progressivement augmentée et le délai est lié au dernier
changement de dose.
64
Notre étude montre que les patients MICI qui développent une MS sous AZA présentent plus
fréquemment des mutations de la TPMT, sans que toutefois ces mutations n’expliquent la majorité des
cas de leucopénies observées. Ces résultats concordent avec les observations de Colombel (165). Un
génotypage extensif de la TPMT n'a pas révélé de mutations additionnelles significatives comparées au
génotypage s’intéressant exclusivement aux mutations TPMT*2,*3A,*3B ;*3C et *3D. La population
étudiée était essentiellement caucasienne et les mutations TPMT identifiées étaient *3A,*3C et *2, ce
qui correspond aux résultats obtenus dans d'autres études (56). Nos résultats confirment qu’un
génotypage centré sur la présence de mutations TPMT3A/3C/2 peut s’avérer suffisant dans une
population caucasienne. Ces résultats permettent également d'insister sur le caractère limité du
génotypage TPMT dans l’explication et la prise en charge des myélosuppressions induites par l’AZA.
Le délai médian avant la survenue d'une myélosuppression était plus court dans le groupe TPMT
déficient (LM plus IM, deux et 2,75 mois) que dans le groupe TPMT «wild–type » (HM). Les différences
ainsi retrouvées se sont révélées plus importantes que dans l'étude de Colombel, où les délais médians
de MS étaient de 1 mois chez les LM, 4 mois chez les IM et 3 mois chez les HM (165). Le plus long
délai avant la survenue d'une myélosuppression observé chez les patients HM amène à l’hypothèse
que d'autres facteurs, extra-génétiques peuvent être impliqués.
Dans notre cohorte, la dose médiane d'AZA était légèrement plus basse que la dose habituellement
recommandée de 2 à 2,5 mg/kg (1,5 chez les LM, 1,9 chez les IM et 2 chez les HM). Ceci reflète
l'observation familière que tous les patients ne sont pas traités avec la dose optimale d'AZA et qu'il
existe un décalage entre les recommandations et la pratique quotidienne.
Un syndrome infectieux était observé chez 20/61 (33 %) patients, soit 5/15 dans le groupe LM+IM et
15/46 dans le groupe HM. Ceci est plus élevé que le taux de 6,5 % d'infections rapporté dans la
littérature (137). Les infections étaient sévères mais non mortelles chez 5/20 (25 %) des patients, dont 2
dans le groupe LM+IM et 3 dans le groupe HM. Le caractère rétrospectif de l'étude et l'influence
65
potentielle de l'administration de corticoïdes dans certains cas rendent plus difficile l’identification d'un
lien de causalité entre le traitement par AZA, la myélosuppression et la survenue d'une infection.
Vingt-sept (27/61) patients ont présenté de l'anémie avec ou sans symptômes liés à celle-ci comme de
l'asthénie, de la dyspnée et /ou de l'angor. Etant donné que l'anémie est fréquemment retrouvée chez
un patient souffrant de MICI (due à la déficience en fer et/ou à l’inflammation), il n'est pas possible
d'identifier l'impact réel de l'épisode de myélosuppression sur la valeur de l'hémoglobine dans tous les
cas rencontrés.
Un saignement a été peu fréquemment observé (3/61 patients). Ce résultat concorde avec l'incidence
faible de la thrombocytopénie (12/61 patients), ainsi qu'avec les données de la littérature (137).
Contrairement à l'étude de Colombel, où une TP n'a été réintroduite que chez 7/41 (17 %) des patients
après l'épisode de MS, dans notre étude, une TP a été ré-administrée chez 36/61 (59 %) des patients.
Une dose similaire à la dose prescrite lors du premier épisode de MS a été progressivement atteinte
chez 9/36 des patients et une dose plus faible chez 27/36 des patients. Il est important de souligner que
cette ré-administration de TP après le premier épisode de MS a été effectuée sans connaître le
génotypage de la TPMT qui n'a été réalisé que plusieurs mois après l'événement (c'est-à-dire au
moment du démarrage de cette étude rétrospective). Puisque seulement 13/36 (36 %) des patients ont
vécu un deuxième épisode de myélosuppression, nous pouvons conclure qu'une ré-administration d'un
traitement par TP peut raisonnablement être tenté chez des patients ayant présenté un premier épisode
de MS. Par ailleurs, le fait que 23/36 patients n'ont représenté aucun autre épisode de MS plaide contre
un mécanisme génétique sous-jacent pouvant expliquer l’épisode de MS.
Cependant, lorsque l'on considère la réintroduction de TP après un premier épisode MS, on doit le faire
avec précaution. Par les résultats de cette étude, nous suggérons de retraiter le patient avec une plus
faible dose que celle initialement administrée. En effet, 7/9 patients traités avec la même dose de TP
ont présenté un deuxième épisode de MS, alors qu'à l'opposé seulement 7/27 des patients qui avaient
été traités avec une plus faible dose ont à nouveau représenté un épisode de MS. De plus, le délai de
66
survenue du deuxième épisode MS était plus court chez 5 patients et plus long chez 6 autres patients
suggérant que le monitoring des globules blancs doit être maintenu.
Il est intéressant de noter que la dose d’AZA au moment du deuxième épisode de MS était similaire à
celle utilisée lors du premier épisode chez deux des trois patients LM+IM ; ce qui souligne une relation
directe entre le dosage d'AZA et le statut TPMT déficient. Dans le troisième cas, le deuxième épisode
de MS est survenu pour une plus faible dose de TP.
La survenue du deuxième épisode MS chez des patients HM soulève l'hypothèse que d'autres
polymorphismes enzymatiques ou déficiences peuvent également interférer et contribuer à augmenter
la toxicité des TP.
Conclusion
La conclusion de cette étude est qu’un génotypage extensif de la TMPT n'explique que seulement 25
% de tous les épisodes de MS survenant chez un patient MICI traité par des analogues des purines.
Les mutations TPMT retrouvées chez ces patients étaient les plus communes (*3A,*3C,*2). Une
détermination génétique de la TPMT, si elle est prescrite dans une population caucasienne, peut se
concentrer sur ces 3 mutations puisque les autres mutations n'apparaissent pas cliniquement
importantes. Un génotypage de la TPMT est certainement un outil utile, mais n'apparaît pas comme
suffisant pour diriger à lui seul le traitement par TP. Aucune différence n'a été retrouvée entre les
groupes TPMT déficient et TPMT normal en ce qui concerne la sévérité, la fréquence et les
complications de la MS. Redémarrer un traitement par TP après un premier épisode de MS peut être
considéré, même sans détermination préalable de la TPMT. Cependant, dans cette circonstance, une
administration d'une plus faible dose de TP doit être conseillée de même qu’un suivi biologique
renforcé.
67
2.1.2 : Activité TPMT haute
À l'opposé, à peu près 15 % des patients peuvent présenter une activité TPMT plus élevée que la
normale (59) et vont, dès lors, dévier le métabolisme des TP vers la production de composés inactifs
comme les 6-MMP. Il y aura une plus faible production de composés actifs comme les 6-TGN et ces
patients présenteront un risque accru de « résistance au traitement ». De plus ils vont produire
davantage de dérivés méthylés potentiellement responsables de toxicité hépatique (cfr chapitre 3).
Une activité TMPT ultra-élevée est retrouvée chez 1 à 2 % de la population et est facilement détectée
par un test phénotypique. Récemment, un polymorphisme d'un trinucléotide (GCC) dans le gène
promoteur de la TPMT a été associé à une activité TPMT ultra élevée (168). Ce polymorphisme
trinucléotide GCC peut expliquer, en partie, l'activité TPMT ultra élevée chez certains patients, mais il
est probable que d'autres polymorphismes seront découverts dans le futur, comme nous avons pu
l’observer dans le cas des polymorphismes responsables de déficience enzymatique.
Différentes équipes se sont intéressées à l’impact d’une détermination de l'activité de la TPMT (avant
mise en route du traitement) sur l’efficacité de la TP sur la MICI. Ansari et al (59) ont montré qu’une
activité TPMT > 14 U/ml était associée avec une haute probabilité de résistance à l’AZA/MP (OR 0,21 ;
CI95% : 0,07-0,68). Cuffari et al (169) ont également évalué chez 41 patients la réponse clinique aux
TP en fonction de l'activité TPMT. La présence d'une activité TPMT inférieure à 15,3 U/ml multipliait par
6 le taux de réponse à l’AZA (OR:6).
En conclusion, une détermination de la TPMT (géno - ou phénotypage) peut être corrélée dans une
certaine mesure avec :
-
la réponse au traitement,
-
la survenue d'effets secondaires comme la myélotoxicité et l’hépatotoxicité.
68
2.2 : Impact des différentes activités XOD et AO
Smith et al, ont rapporté récemment leur étude sur différents polymorphismes de XOD et leur impact sur
le traitement par AZA chez des patients souffrant de MICI (80). Ils ont étudié l’aldéhyde oxydase (AO),
la xanthine oxydase (XOD) et le molybdenum cofactor sulfurase (MOCOS). Pour exercer leur action AO
et XOD nécessitent un cofacteur essentiel, le molybdène fourni par MOCOS. En cas de déficience de
ce cofacteur, l'activité enzymatique est diminuée. L'étude a identifié un effet protecteur faible contre des
effets secondaires des TP chez les patients porteurs de polymorphisme d'un seul nucléotide de XOD
(XDH c.837C>T, p=0,048) et MOCOS (MOCOS c.2107A<C, p=0,058). Cet effet protecteur a été
observé sans que les taux de métabolites habituellement dosés soient modifiés, empêchant dès lors de
tirer des conclusions sur le mécanisme expliquant cette association. Les patients qui présentaient les
deux types de polymorphisme ci-dessus ne subissaient pas d'effets secondaires des TP (p=0,019). Par
ailleurs, le polymorphisme d'un seul nucléotide de AOX1 (c.3404A>G) était prédictif d'un manque de
réponse au traitement par AZA (p=0,035), bien que la signification fonctionnelle des métabolites
produits par AO est inconnue. Enfin, lorsque les patients présentaient deux marqueurs prédictifs d’effets
secondaires (TPMT >35 pmol/h.ml.Hb et AOX1 c.3404A>G), la probabilité d'obtenir une réponse
complète à l’AZA était significativement diminuée.
2.3 : Impact des différentes activités ITPA
Dans l’étude de Marinaki (170), 62 patients MICI ont été répertoriés comme ayant subi un effet
secondaire de l’AZA : neutropénie(11), nausées et vomissements (13), hépatite (4), rash (6), syndrome
grippal (16), et pancréatite (8). Ils ont été testés pour les mutations 3A+C de la TPMT et ITPA94C>A et
IVS2+21A>C, de même que 68 patients MICI contrôles n’ayant subi aucun effet secondaire malgré une
prise d’AZA depuis au moins 3 mois. Seule la mutation ITPA94C>A a été associée à la survenue de
significativement plus d’effets secondaires lors de la prise d’AZA (p=0,0034). Les effets secondaires
incriminés étaient plus particulièrement de type immuno-allergique : rash, syndrome grippal et
69
pancréatite. Un statut hétérozygote pour la TPMT ne prédisposait pas à la survenue de ces effets
secondaires immuno-allergiques mais bien aux nausées et vomissements fréquemment rencontrés lors
de ce traitement (p= 0,0206).
L’association significative (p=0.014) d’une mutation ITPA et la survenue d’un syndrome grippal est
également retrouvée par Ansari (171).
Une étude prospective allemande incluant 71 patients souffrant de MC et traités pour la première fois
par AZA a évalué l’intérêt de déterminer ces mutations ITPA et TPMT. La présence d’une mutation
ITPA94C>A était significativement associée au retrait de l’AZA suite à la survenue d’effets secondaires
(p=0,002) (172).
Une étude rétrospective de 262 patients MICI a également retrouvé une association de la présence
d’une mutation ITPA et de la survenue d’une leucopénie sous TP (p= 0,046)(160).
Ces résultats n'ont pas été confirmés par Gearry et coll, qui n'ont retrouvé aucune association entre
cette mutation 94C>A et tout type d’effets secondaires de l’AZA dans une série de 73 patients MICI
intolérants à l’AZA (173). Seuls 8/73 patients étudiés présentaient cette mutation et tous étaient
hétérozygotes.
Lorsque l'on se concentre sur la survenue de myélotoxicité induite par azathioprine, les mutations de
l'ITPA n'apparaissent pas non plus jouer un rôle. Ceci est retrouvé dans plusieurs études, sauf une
(160), incluant des séries de patients MICI et transplantés rénaux (170, 173-175).
Enfin, une méta-analyse s’est intéressée à cette association entre les polymorphismes de l’ITPA et la
toxicité des TP (176). Six études englobant 751 patients ont été incluses dans l’analyse. La conclusion
était que les mutations de l’ITPA ne sont pas associées significativement avec aucun des effets
secondaires des TP.
Devant ces résultats discordants, on ne peut, à l’heure actuelle, recommander l’analyse de l’ITPA chez
les patients traités par TP. D'autres études sont nécessaires, incluant un plus grand nombre de patients
pour apporter une réponse définitive.
70
2.4 : Impact des différentes activités GST
Stocco et al ont étudié l'influence des polymorphismes de GST (M1, P1, T1) et de TPMT
(*2,*3A,*3B,*3C) chez 70 jeunes patients MICI traités par AZA dont 15 ont développé des effets
secondaires (177). Une corrélation était retrouvée entre le génotype GST-M1 (considéré comme normal
ou « wild-type ») responsable d’une haute activité enzymatique et la probabilité accrue de développer
des effets secondaires sous AZA. Les individus avec une haute activité GST sont apparemment
prédisposés à développer des effets secondaires de l'AZA (pancréatite, hépatite, myélotoxicité, et
arthralgies). Cette situation peut être expliquée par deux facteurs. Premièrement, de grandes quantités
de MP sont formées amenant à une accumulation de métabolites actifs mais également toxiques.
Deuxièmement, une haute activité de GST favorise une déplétion en glutathion qui peut entrainer des
dommages cellulaires.
Ces résultats intéressants doivent toutefois être confirmés avant de pouvoir généraliser la détermination
de GST en pratique clinique en vue de prédire la survenue de ce type d'effets secondaires sous AZA.
Enfin, l'intolérance digestive sous AZA pourrait être due au composé imidazolé libéré par la
transformation de l'AZA en MP. En effet, ce type d'effets secondaires peut être évité dans 1/2 voire 2/3
des cas en remplaçant l'azathioprine par l’administration de mercaptopurine (126, 130, 134). Il serait
donc intéressant de vérifier si l'activité GST joue un rôle dans la survenue de ce type d'effets
secondaires.
2.5 : Impact des différentes activités MTHFR
Une étude reprenant une cohorte de 92 patients MICI pédiatriques et un groupe contrôle de 130
individus sains, s’est intéressée à la présence de mutations du gène MTHFR (178). Leur but était de
déceler si ces mutations MTHFR étaient plus souvent retrouvées dans une population MICI ou
associées avec davantage de risque de survenue d’effets secondaires des TP. Soixante-trois des 92
patients étaient traités par AZA ou MP. La présence de mutations du gène MTHFR a été décelée avec
71
une même incidence chez les patients MICI et le groupe contrôle. De même, le génotype MTHFR muté
n’était pas associé avec une augmentation de la toxicité des TP.
Une seule étude appuie l’hypothèse d’un impact des mutations de MTHFR sur le métabolisme des TP.
Les polymorphismes C677T et A1896C du gène MTHFR entrainent une activité diminuée de l’enzyme.
Arenas et al ont retrouvé chez des individus prédits TPMT HM par génotypage, une activité TPMT
basse (179). Chez ces individus, une fréquence significativement plus élevée (23%) de porteurs
homozygotes pour la mutation C677T de MTHFR était retrouvée, par rapport aux personnes également
prédites HM mais qui présentaient une activité TPMT normale. Cette constatation concorde avec
l’hypothèse selon laquelle des perturbations dans le recyclage du métabolisme de la SAM (considéré à
fois comme cofacteur et protecteur de la dégradation de la TPMT) pourraient avoir comme
conséquence une diminution de l’activité TPMT.
Figure Impact MTHFR sur TPMT via SAM
B12
METHIONINE
S-adénosylméthionine
synthase
Méthionine
synthase
MTHFR
MTHFR
5-CH3FH4
5-10-CH2FH4
Folates
SAM
SAH
S-adénosylhomocystéine
hydrolase
HOMOCYSTEINE
Cystathionine
α-cétobutarate
Cystéine
72
TPMT
Chapitre 3 : Relations entre métabolites et efficacité/effets secondaires des TP
3.1 : les 6-thioguanine nucléotides ( 6-TGN)
L’AZA et MP sont deux pro-drogues inactives qui sont métabolisées via différentes voies enzymatiques
produisant les métabolites nucléotides 6-thioguanine (6TGN), 6-methylmercaptopurine (6-MMP) et 6thiouracile (6TU) (figure 1). Les 6-TGN apparaissent comme les principaux métabolites actifs des TP et
des travaux récents ont amélioré notre compréhension du rôle des métabolites 6TGN dans l'obtention
d’une efficacité thérapeutique. Il avait été précédemment supposé que l'action immunosuppressive des
TP était obtenue via l'incorporation des 6TGN dans l'ADN lymphocytaire, empêchant ainsi la
prolifération cellulaire. Cependant, Tiede et al (180) ont suggéré l’existence d’un mécanisme d'action
alternatif de ces médicaments en montrant que les métabolites 6-thioguanine tri-phosphate (6-TGTP)
stimulent l'apoptose des lymphocytes T de la lamina propria en se liant à Rac1, enzyme intracellulaire
dont il supprime l'action. Cette enzyme est, notamment, impliquée dans l'activation des voies du facteur
nucléaire NFκB et des STAT-3. Ce mécanisme d'action pro-apoptotique joue un rôle majeur dans l'effet
thérapeutique des TP dans les MICI : les lymphocytes T activés subissent une importante apoptose due
à l'accumulation des métabolites actifs, ce qui entraine une diminution de l'inflammation.
Trois nucléotides thioguanines sont connus : 6-thioguanine mono-phosphate (6-TGMP), 6-thioguanine
di-phosphate (6-TGDP) et 6-thioguanine tri-phosphate (6-TGTP). Ils se distinguent par le nombre de
résidus phosphates accrochés durant la conversion anabolique de la 6-thioxanthosine monophosphate
(6-TXMP)(figure 10). Neurath et al (181) ont quantifié les taux de 6-TGTP chez 50 patients souffrant de
maladies de Crohn traités par TP. Le sous- groupe des patients avec des taux élevés de 6-TGN à
prédominance de 6-TGDP présentait un moins bon pronostic de réponse aux TP que le sous-groupe
présentant des taux élevés de 6-TGN à prédominance de 6-TGTP. Ces données suggéraient que des
taux de 6TGDP de plus de 15 % du taux total de 6-TGN étaient prédictifs d’une mauvaise réponse à
l’AZA. La conversion de 6-TGDP en 6-TGTP est supposée être catalysée par la nucléoside diphosphate
73
kinase (NDPK), enzyme qui présente une variabilité inter-individu sans qu'on ne connaisse l'impact sur
les taux de 6-thioguanine phosphates (182).
Figure 10 : focus sur 6TGN
6-TIMP
6-MTG
IMPDH
TPMT
6-MTGMP
6-TXMP
6TG
TPMT
GMPS
HGPRT
6-TGMP
MPK
6-TGN
6-TGDP
DPK
Rac-1 inhibition,
False nucleotide incorporation and
DNA/RNA strand breakage.
6-TGTP
Chez 92 patients pédiatriques souffrant de MICI, Dubinsky et al. ont étudié la relation entre la réponse
thérapeutique, les taux de 6 TGN et le génotype TPMT (183). Ils ont également corrélé ces taux avec
les paramètres biologiques, hématologiques, pancréatiques, et hépatiques. Des taux de 6- TGN > à 235
pmol /8 x108 érythrocytes étaient associés à une bonne réponse clinique. Dans une étude comparable,
Cuffari a rapporté une bonne corrélation entre la réponse clinique au traitement et des taux de 6-TGN >
à 250 pmol /8 x108 érythrocytes (169). Inversement, Lowry et al n’ont pas retrouvé un taux-seuil de 6TGN prédictif de bonne réponse clinique (184).
74
De plus, une méta-analyse a montré que la sensibilité d'un taux seuil de 6-TGN pour la prédiction d’une
réponse clinique n'est que de 62 % et avec une spécificité de seulement 72 % (185). Cependant, cette
méta-analyse présentait une hétérogénéité statistiquement significative (p= 0,003). Une mise à jour de
cette méta-analyse en 2009, après avoir exclu l'étude de Lowry, ne montrait plus d'hétérogénéité
significative (p= 0,09). La nouvelle analyse a montré que 62 % des patients qui se situaient au-dessus
de la valeur seuil de 6-TGN étaient en rémission comparé à seulement 36 % des patients qui
présentent les taux de 6-TGN inférieurs à la valeur seuil. Les patients en rémission avaient plus de
probabilité de présenter les taux de 6-TGN au-dessus de la valeur seuil, avec un pooled OR de 3,27 (IC
95 %, 1,71- 6,27 ; p=0,001).
Un tableau reprenant les différentes études ayant mesuré des seuils thérapeutiques de 6-TGN est
repris ci-dessous (tableau 11).
Une étude randomisée prospective menée par Reinhagen a comparé la réponse clinique chez 71
patients traités soit par une dose azathioprine ajustée par les taux de 6-TGN, soit par une dose
standard d'azathioprine de 2,5 mg/kg par jour (186). Après 24 semaines de traitement par AZA, les
deux groupes de patients ont montré des concentrations en 6-TGN et des taux de rémission clinique
identiques. Les auteurs ont conclu qu’adapter la dose d’azathioprine aux taux de 6-TGN n'a pas de
bénéfice clinique apparent dans leur population de patients présentant une activité TPMT habituelle (820 nmol/ml érythrocyte x h).
L'absence de concordance entre les études et les résultats de l'intérêt clinique des taux de 6-TGN peut
être expliquée notamment par les différents tests biochimiques utilisés qui modifient profondément les
mesures 6-TGN.
75
Tableau 11 : seuils thérapeutiques de 6-TGN (* exprimé en pmol/ 8 x108 GR)
Délai entre
Récolte des nombre
mesure des 6Auteur, année
données de patients TGN et début du
Tt par TP (mois)
Etudes en
faveur d'un
seuil
thérapeutique
Pas de seuil
thérapeutique
Taux de
Taux de 6-TGN
6-TGN chez chez patient
Significativité
patient en avec maladie
rémission*
active *
Dubinsky, 2000
prospective
92
4
312
209
P<0.01
Cuffari, 2001
prospective
82
3
316
176
P<0.01
Wright,2004
prospective
131
_
236
175
P<0.04
Achkar, 2004
rétrospective
60
3
320*
215*
P<0.003
Andoh, 2008
rétrospective
83
4
343
233
P<0.05
Hanai, 2010
prospective
170
12
322
204
P<0.001
Lowry,2001
rétrospective
170
3,5
131
139
NS
Belaiche,2001
rétrospective
22
3
166
160
NS
Gupta,2001
rétrospective
101
4
217
173
NS
Goldenberg,2004 rétrospective
74
2.5
325*
223*
NS
Hindorf,2006
prospective
27
5
176
163
NS
Reinshagen,2007
prospective
39
4
222
222
NS
Kwan,2008
rétrospective
39
1
236
202
NS
GonzalesLama,2011
prospective
70
6
427
318
NS
Néanmoins des majorations de doses de TP guidées par la mesure des métabolites augmentent
significativement la probabilité d'atteindre une rémission clinique notamment définie par l'arrêt des
corticoïdes. Dans une étude récente de 106 patients MICI corticodépendants, une augmentation de la
dose d’AZA guidée par le monitoring des métabolites a été réalisée pendant 12 mois et a permis
d'obtenir la rémission clinique sans corticoïdes chez 59 % des patients (187). Parmi les patients qui
présentaient un taux de 6-TGN > à 250 pmol /8 x108 érythrocytes, 69 % ont atteint une rémission
(p=0,05), alors qu’aucun patient avec un taux de 6-TGN < à 250 pmol /8 x108 érythrocytes ne l’a
atteinte (p<0,01).
76
3.2 : la 6-Methylmercaptopurine (6-MMP) et les méthylmercaptopurineribonucleotides (6MMPR)
La MP est soit dégradée en intracellulaire par la TPMT en 6-méthylmercaptopurine (6-MMP),
métabolite inactif, soit transformée par la XO en acide 6-thiourique (6-TUA), soit elle emprunte la voie
qui mène aux dérivés 6-thioguanine nucléotides (6-TGN) ou celle qui mène aux 6-méthylmercaptopurineribonucleotides (6-MMPR). Il faut souligner que les techniques utilisées pour les dosages des
6MMP et 6MMPR peuvent varier. Ainsi dans certaines études, le résultat rapporté de la mesure des 6MMP(R) peut regrouper à la fois les 6-MMPR et la 6-MMP.
Une surproduction de 6-MMP peut être responsable de l’apparition d’effets secondaires. Dubinsky et al
ont rapporté que des taux de 6MMP > à 5700 pmol /8 x10 8 érythrocytes étaient associés à la présence
d'une hépatotoxicité (183). Hande et al ont également montré une corrélation (p<0,001) entre des taux
élevés de 6MMP(R) et des taux de transaminases élevés (188).
A l’opposé, dans une étude prospective regroupant 74 patients MICI, aucun n’a développé de
perturbations hépatiques alors que 12 % d’entre eux avaient des taux de 6-MMP(R) > à 5700 pmol/8
x108 érythrocytes (189). Parallèlement, un groupe de 60 patients MICI consécutifs traités par TP ont été
inclus dans une étude prospective de 20 semaines et aucune toxicité hépatique et/ou de corrélation
avec les métabolites méthylés n’a été retrouvée. Par contre, les patients avec des concentrations de 6MMP(R) > à 11450 pmol/8 x108 érythrocytes à la cinquième semaine de traitement avaient un risque
augmenté de développer une myélotoxicité (odd ratio = 45,0 ; p= 0,015)(39).
Une autre étude ne révèle pas d’impact évident du dosage des 6MMP(R). Elle a évalué les taux de
6TGN et de 6MMP(R) chez 131 patients adultes sur une période de 2 ans. Les 6MMP(R) n’étaient pas
corrélés avec l’efficacité ou une quelconque toxicité (190). Dans l’essai randomisé contrôlé de
Reinhagen déjà cité, la présence de 6MMP(R) > à 5700 pmol /8 x108 érythrocytes n’était pas non plus
associé avec la survenue d’une hépatotoxicité (186).
77
On peut donc supposer, au vu des résultats discordants des différentes études, que d’autres facteurs
que le taux absolu de 6-MMP(R) interviennent dans la survenue des effets secondaires. La durée
d’exposition à ces taux élevés de 6-MMP(R) pourrait être un de ces facteurs.
Pourquoi paradoxalement certains patients développent une hépatotoxicité alors que d'autres
développent une myélotoxicité ? Le seul paramètre différent est l’élévation plus importante des 6MMPR
(> 11450) en cas de myélotoxicité plutôt qu’en cas d’hépatotoxicité (>à 5700). Une hypothèse logique
pourrait être la différence de métabolites concernés (6MMP pour l’hépatotoxicité et 6MMPR pour la
myélotoxicité). Il faut également tenir compte du fait que les techniques de dosage des métabolites
diffèrent selon les études. Les auteurs n'analysent pas toujours le même métabolite et il est concevable
que ces métabolites puissent avoir des profils toxiques différents.
Certains auteurs suggèrent de calculer le rapport entre les 6MMPR et 6TGN, plutôt que d’exprimer
leurs valeurs isolées. Un rapport 6MMPR/6TGN < à 11 serait ainsi prédictif d’une réponse au traitement
(191) tandis qu’un rapport de 6MMP/6TGN > à 30 serait prédictif d’une résistance aux TP (192).
Une étude très récente s’est intéressée aux patients chez qui la métabolisation conduit
préférentiellement à la formation de 6MMP plutôt que à celle de dérivés 6TGN (193). Le rapport
6MMP/6TGN était supérieur à 20 chez 349 des 1879 patients analysés soit près de 1 patient sur 5. Ils
ont démontré que l’activité TPMT était significativement légèrement plus basse chez les patients dont le
rapport 6MMP/6TGN était < à 20 comparée aux patients dont le rapport était > à 20 (12.2 vs. 13.2; p<
0.001).Ce résultat était attendu puisqu’une activité TPMT basse amène à la formation de davantage de
dérivés 6TGN. Cependant, la distribution de l’activité TPMT était similaire dans les 2 groupes : 97 %
des patients se retrouvaient avec des activités TPMT comprises entre 5 et 17,6 UI/ml dans chaque
groupe. Dès lors, les auteurs concluaient qu’une haute activité TPMT n’est probablement pas la seule et
plus importante raison de produire préférentiellement des 6MMP.
78
Figure 11: focus sur 6MMP(R)
AZA
AO
AO
GST
TPMT
8-OHAZA
Hepatotoxicité
6-MMP
DPK
MP
XOD
6-MTITP
6-MTIDP
MPK
HGPRT
TPMT
6-TUA
Inhibition de novo
synthèse nucleotide
8-OH-6MMP
6-MTIMP
6-TIMP
79
6-MMPR
Chapitre 4 : TP et interactions médicamenteuses
Toutes les interactions médicamenteuses sont reprises dans la figure ci-dessous et vont être discutées.
Drug-Drug interactions
Infliximab
Aminosalicylés
AINS
Diurétiques
AZA
Méthotrexate
Warfarine
Allopurinol
4.1 : Allopurinol
L’allopurinol (Zyloric®) bloque la xanthine oxydase, et si ce traitement est prescrit en même temps que
l’AZA ou MP, le métabolisme de la TP est dévié vers une production augmentée de métabolites actifs
mais également toxiques qui sont notamment responsables de la myélotoxicité. Cette interaction
médicamenteuse potentiellement toxique a été démontrée dans plusieurs études où la myélotoxicité
survient dans les semaines qui suivent l'adjonction d'allopurinol (194-196). Par conséquent, si cette
association médicamenteuse est nécessaire, une réduction de la dose de TP est recommandée à 2533% de la dose normale. En effet, à peu près deux tiers de la dose de TP absorbée est inactivée par la
voie enzymatique de la XOD (196).
80
Dans notre étude sur l'impact d'un génotypage extensif de la TPMT dans la prise en charge de la
myelosuppression induite par les TP chez des patients MICI (167), nous avons retrouvé 3 patients pour
lesquels de l'allopurinol a été prescrit alors qu'ils étaient sous traitement par AZA. Les 3 patients ont
développé une myélosuppression : 1 présentait un génotypage TPMT hétérozygote déficient et 2 un
génotypage TPMT normal. La myélosuppression est apparue 4,5 et 10 semaines, respectivement,
après que l'allopurinol ait été débuté à une dose de 300 mg/j.
Ces cas mettent en évidence la toxicité de cette association médicamenteuse ainsi que la nécessité de
rappeler les risques liés à cette association aux professionnels de santé et aux patients.
Certains auteurs tirent, par contre, un avantage de cette interaction médicamenteuse car elle
permettrait d'éviter certaines résistances à la TP ou des effets secondaires de type hépatotoxicité.
Selon Ansari, Elion avait conçu au départ l’allopurinol pour l’utiliser en co-traitement avec la MP et
notamment accroitre sa biodisponibilité en inhibant la xanthine oxydase intestinale. Les premiers essais
de co-thérapie ont démontré une toxicité accrue et l’allopurinol a finalement trouvé son utilisation dans
le traitement de la goutte (197, 198).
Cette association a de nouveau été utilisée en transplantation rénale en 1993 (199). Des patients sous
triple immunosuppression (ciclosporine, corticoïdes et azathioprine) ont été traités par de petites doses
d’allopurinol (25 mg 1j/2) dans le but de diminuer le rejet. Douze patients traités par allopurinol ont été
comparés à 15 patients sans allopurinol. Un épisode de rejet a été observé dans le groupe allopurinol
contre 11 dans le groupe contrôle. Les doses d’AZA ont du être diminuées dans le groupe allopurinol.
Différentes études ont ensuite été menées dans la population MICI et se sont intéressées à l’efficacité
et la sécurité d’une combinaison d’allopurinol à une petite dose de TP.
La première étude a rapporté les résultats biochimiques de cette combinaison thérapeutique :
quinze patients MICI ne répondant pas aux TP et produisant préférentiellement des 6-MMP ont été
sélectionnés dans deux centres de référence (200). Une dose de 100 mg d’allopurinol a été débutée
alors que la dose de TP était réduite à 25-50 % de la dose initiale (diminution de la dose moyenne
81
d’AZA de 188 à 88 mg/j et de MP de 92 à 51 mg/j). Cette diminution de dose des deux classes de
médicaments (l’allopurinol étant généralement prescrit à 300 mg/jour par les rhumatologues en cas de
goutte) était justifiée par le fait que la plupart des cas de myélosuppression retrouvés dans la littérature
survenait lorsque les 2 traitements étaient pris aux doses usuelles. Après avoir débuté l’allopurinol, les
taux moyen de 6-TGN ont augmenté de 186 à 385 pmol/ 8 x 108 érythrocytes, alors que les taux
moyens de 6-MMP ont diminué de 10.380 à 1732 pmol/ 8 x 108 érythrocytes. Une diminution du taux
moyen de leucocytes a également été observée (de 8300 à 6100/mm3) ainsi qu’une leucopénie chez 5
patients (résolue par diminution de la dose de TP), sans complication infectieuse. Cette modification
des métabolites était attendue pour les 6TGN mais pas vraiment pour les 6-MMP. En effet, du fait de
l’inhibition de l’allopurinol par la XO, on s’attend à un accroissement à la fois des métabolites 6TGN
mais également des 6-MMP.
Néanmoins, cette modification impressionnante du métabolisme des TP (chez des patients considérés
comme résistants) en faveur d’un profil idéal (6-TGN hauts et 6-MMP bas) a considérablement accru
l’intérêt pour cette association médicamenteuse ; cette fois-ci considérée comme potentiellement
bénéfique. La réduction des 6-MMP observée donnait l’opportunité de pouvoir traiter par cette cothérapie des patients ayant présenté une hépatotoxicité liée à une accumulation de 6-MMP. Les mêmes
auteurs ont poursuivi leurs travaux et ont publié une étude incluant 20 patients MICI, qui présentaient
des taux élevés de 6-MMP et qui ne répondaient pas au traitement par TP (201). A nouveau, 100
mg/jour d'allopurinol ont été administrés et la dose de MP/AZA a été diminuée à 25-50 % de la dose
initiale. Ils ont observé une augmentation des taux de 6TGN, une diminution des 6MMP et une
amélioration de la maladie comme démontré par l'évolution des scores d'activité et la diminution des
besoins en corticoïdes. En cas d'hépatotoxicité, ils ont observé une normalisation des enzymes
hépatiques durant une période de suivi de 36 mois (202). Treize patients sur les 20 inclus dans l’étude
présentaient un taux élevé de transaminases lors de la prise de TP. Après l’ajout de l’allopurinol, une
normalisation d’une ou des deux transaminases a été observée chez 11/13 patients (ALT diminuent de
82
102 à 40 UI /L (p=0,01) et AST de 43 à 24 UI/L (p=0,12)). Le suivi de ces patients sur une période de 3
ans amena 5/20 patients à un autre traitement suite à l’évolution de la maladie : 3 ont été traités par
Anti-TNF et 2 opérés. Les 15 autres ont continué la co-thérapie sans présenter d’effets secondaires et
ont conservé une rémission clinique.
En complément, une étude récente par Ansari et al (198) a confirmé le bénéfice d'une association
d'une faible dose de MP/AZA et d'allopurinol chez des patients présentant des effets secondaires aux
TP. Dans cette étude, 14/16 patients présentant une hépatotoxicité et 18/25 patients présentant des
myalgies, nausées ou des symptômes de fatigue ont atteint une rémission clinique suite à
l’administration de cette association médicamenteuse.
Logiquement, l’inhibition de XOD par l'Allopurinol devrait aboutir à une augmentation à la fois des taux
de 6TGN et de 6MMP (considéré comme responsable de l'hépatotoxicité). A nouveau de façon
surprenante, alors qu'effectivement les taux de 6TGN augmentaient, les taux de 6MMP diminuaient.
Puisque l'allopurinol n'inhibe pas la TPMT, des hypothèses alternatives doivent être soulevées (203).
Une d’entre elles serait que la voie de la TPMT pourrait être moins compétitive lorsqu’une faible dose
de TP est administrée. Une autre possibilité serait que l’allopurinol inhiberait un cofacteur d’une enzyme
impliquée dans le métabolisme des TP. Or, le phosphoribosylpyrophosphate (PRPP) est un substrat
nécessaire à la synthèse des 6MMP, et il a été démontré que l’allopurinol entraine une diminution des
concentrations en PRPP tant in vitro qu’ in vivo (204). Cette déplétion en PRPP, secondaire à la
présence d’allopurinol, pourrait ainsi expliquer la diminution des 6MMP.
Une autre hypothèse fait intervenir cette fois-ci les transporteurs membranaires des métabolites des TP.
L’allopurinol altèrerait le transport des métabolites plutôt que leur production. Cette hypothèse est
renforcée par le fait que l’allopurinol et les purines partagent les mêmes systèmes de transport
membranaires, et cela de façon compétitive (205).
Une des dernières explications est donnée par Blaker et repose sur un métabolite de la mercaptopurine:
la thioxanthine. Cette substance issue de la voie de dégradation de la MP vers l’acide urique est
83
accumulée suite à la présence d’allopurinol. Or, elle exercerait un effet inhibiteur puissant sur la TPMT,
et dès lors empêcherait la formation de dérivés méthyl-mercaptopurines (responsables de
l’hépatotoxicité) tout en favorisant la formation de 6-TGN (206).
Quels que soient les mécanismes sous-jacents, cette association ne doit être considérée que dans des
cas bien sélectionnés ; et si la co-thérapie est décidée, un suivi strict de l’hémogramme et des
métabolites des TP est nécessaire étant donné le risque accru de leucopénie (43).
Les critères nécessaires pour envisager une co-thérapie allopurinol-TP (207) chez un patient donné
sont :
1. être corticodépendant malgré une dose et durée adéquate de traitement par TP ;
2. présenter des taux de 6TGN bas (< 235 pmol/ 8 x108 GR ) alors que les taux de 6-MMP sont élevés (>
à 5700 pmol/ 8 x108 GR) et donc être « pharmacologiquement résistant » aux TP (groupe 3 défini dans le
chapitre 5), qu’il y ait ou non une hépatotoxicité. Un monitoring des métabolites doit donc pouvoir être
réalisé et répété 4 semaines après le début de la co-thérapie pour s’assurer que les taux
«thérapeutiques» de 6-TGN ont été obtenus ;
3. présenter un taux de leucocytes suffisamment élevé (>4500/mm3) pour tolérer la diminution inévitable
des globules blancs lors de la co-thérapie. Une surveillance des leucocytes est recommandée toutes les
semaines le premier mois puis toutes les deux semaines le mois suivant. Par la suite, le suivi habituel
peut être poursuivi.
4.2 : Aminosalicylés
Sous le terme d’aminosalicylés ou dérivés 5-ASA, on regroupe la Sulphasalazine (Salazopyrine®) et la
Mésalazine (Pentasa®, Colitofalk®, Claversal®,...). Ces 2 médicaments sont très souvent prescrits
dans les maladies inflammatoires chroniques intestinales. Elles constituent la première ligne de
traitement dans la rectocolite et sont également prescrites dans la maladie de Crohn notamment en cas
84
d'atteinte colique pour leur possible effet chimiopréventif. Ces traitements sont, par ailleurs,
couramment maintenus chez des patients dont la RC est réfractaire et nécessite l'initiation de TP.
Or, une interaction médicamenteuse a été décrite entre les aminosalicylés et l’AZA/MP.
En effet, Szumlanski et al ont démontré qu'il existait une inhibition in vitro de la TPMT par la
sulphasalazine et ses dérivés 5-aminosalicylés (208). La conséquence clinique potentielle est un plus
haut risque de myélotoxicité lorsque l'on utilise un traitement combinant AZA/MP et dérivés 5-ASA.
Cette complication a effectivement été observée en clinique. Dans un des rapports publiés, un patient a
développé deux épisodes de myélosuppression sévère alors qu'il était traité par olsalazine (un dérivé 5ASA) et MP (209). Un phénomène similaire a également été observé chez un adulte souffrant de
maladie de Still, chez qui une leucopénie est survenue après que l'on ait ajouté de la sulphasalazine à
son traitement chronique par AZA. Chez ce patient, cette association médicamenteuse a induit une
agranulocytose (210).
Pour étudier l’impact des 5-ASA sur le métabolisme des TP in vivo, 2 approches pratiques sont
possibles :
-
étudier la modification des activités enzymatiques et des métabolites avant et après retrait du 5-
ASA chez un patient sous bithérapie,
-
étudier ces mêmes facteurs chez un patient sous TP en monothérapie avant et après que l’on ait
ajouté un 5-ASA.
Dans ce contexte, nous avons réalisé une étude in vivo pour évaluer cette possible interaction
médicamenteuse entre AZA et dérivés 5-ASA (sulphazalasine ou mésalazine) chez des patients
souffrant de maladies de Crohn (211).
85
« Interaction entre azathioprine et aminosalicylés : étude in vivo chez des patients
souffrant de maladie de Crohn »
Le protocole d'étude a été approuvé par le comité d'éthique et tous les patients ont signé un
consentement éclairé avant d'être enrôlé dans l'étude.
Patients et méthode
Seize patients (neuf femmes et 7 hommes) présentant une maladie de Crohn inactive (index d'activité
de la maladie de Crohn ou CDAI < à 150) sous azathioprine et sulphasalazine (8 patients) ou
azathioprine et mésalazine (8 patients) ont participé à l'étude. Les patients étaient âgés d’au moins 18
ans et leur traitement était stable depuis au moins trois mois. L’âge moyen était de 43 ans (23 - 66 ans)
et la durée moyenne de traitement par AZA était de 6,4 années (2-11 ans). La dose moyenne
quotidienne d'AZA était de 1,46 mg/kg (0,85 - 2,36). Les médicaments présentant une possible
interaction médicamenteuse avec le métabolisme de l'AZA n'étaient pas autorisés ainsi que toute
modification du traitement par AZA durant toute la durée de l’étude. Tous les autres médicaments pris
ont été soigneusement répertoriés. Une faible dose de corticoïdes (moins de 20 de 15 mg d’équivalent
prednisolone par jour) était autorisée durant la période de l'étude pour autant que cette dose reste
stable. Les données cliniques des patients sont reprises dans le tableau 12.
La durée de l'étude était de trois mois. Chaque patient a été vu quatre fois à quatre semaines
d'intervalle. A chaque visite un examen clinique, un index d'activité de la maladie de Crohn et une prise
de sang ont été réalisés. Dans l'échantillon sanguin, l'hémogramme, les paramètres inflammatoires, les
taux de 6TGN (métabolites actifs des TP) et les taux plasmatiques d'acide 5- aminosalicylique et de son
métabolite acétylé ainsi que l’activité de la TPMT ont été analysés à chaque visite.
86
Tableau 11 : données cliniques des patients étudiés
Pat. Age Genre
AZA
AS
(mg/d) (g/d)
Poids AZA
Durée Durée
(kg) (mg/kg)
AZA maladie
6 ans
Localisation
1
25
femme
75
1.5
55
1.36
18 mois
colon & périanal
2
47
femme
100
1
53
1.89
8 ans
20 ans Ileon/colon/périanal
3
38
femme
100
2
65
1.54
4 ans
12 ans
4
42 homme
100
1.5
55
1.82
10 ans
20 ans Ileon/colon/périanal
5
66 homme
150
1
115
1.30
4 ans
6 ans
colon & périanal
6
41 homme
100
2
94
1.06
5 ans
14 ans
colon & périanal
7
74
femme
50
2
59
0.85
11 ans
22 ans Ileon/colon/périanal
8
64
femme
100
2
70
1.43
10 ans
20 ans
colon & périanal
9
50 homme
100
1
80
1.25
5 ans
10 ans
Iléon & périanal
10
39 homme
75
1.5
65
1.15
11 ans
18 ans
colon & périanal
11
50
femme
150
1
64
2.34
8 ans
12 ans
colon & périanal
12
23 homme
100
3
58
1.72
2 ans
12 ans
colon & périanal
13
23 homme
150
1.5
75
2.00
3 ans
8 ans
colon & périanal
14
29
femme
100
1
79
1.27
2 ans
8 ans
colon & périanal
15
41
femme
75
1
78
0.96
10 ans
10 ans
colon & périanal
16
37
femme
75
2
54
1.39
7 ans
13 ans
colon & périanal
Iléon & colon.
Après la visite 2 (un mois après l’inclusion dans l'étude), l’aminosalicylé (sulfasalazine ou mésalazine) a
été interrompu. Ceci a divisé notre étude en deux phases où chaque patient est son propre contrôle :
phase 1, azathioprine + aminosalicylé ; phase 2, azathioprine seul.
Le design de cette étude, consistant en un retrait des aminosalicylés chez des patients déjà sous
azathioprine, a été inspiré par la pratique clinique quotidienne où il est habituel d'envisager d'arrêter les
aminosalicylés chez un patient déjà sous AZA, en particulier dans la maladie de Crohn.
87
Figure 11: design de l’ étude interaction 5-ASA/AZA
Phase 1:
5-ASA + AZA
Phase 2:
AZA seul
5-ASA
W0
W4
W8
CDAI, CRP,
NFS, 5-ASA
Activité TPMT
6TGN
CDAI, CRP,
NFS, 5-ASA
Activité TPMT
6TGN
CDAI, CRP,
NFS, 5-ASA
Activité TPMT
6TGN
W12
CDAI, CRP,
NFS, 5-ASA
Activité TPMT
6TGN
La concentration totale en 6TGN dans les globules rouges, basée sur la conversion de 6 thioguanine
nucléotide en 6thioguanine base libre, a été réalisée en chromatographie en phase liquide à haute
performance selon la méthode de Lennard et Singleton (212). L'activité de la TPMT a été déterminée
selon la méthode décrite par Weinshilboum et al (213). Une unité correspond à la formation de
methylmercaptopurine à une vitesse de 1pmol/h par millilitre de [GR]. La méthode de chromatographie
en phase liquide à haute performance décrite par Bystrowska et al a été utilisée pour mesurer les
concentrations d’acide 5-aminosalicylique et de son métabolite acétylé (214). Ceci pour s’assurer que le
patient prenait bien son traitement de 5-ASA durant la phase 1, et que ce traitement avait bel et bien été
stoppé durant la phase 2.
Les taux de 6TGN, d’acide 5-aminosalicylique et de son métabolite acétylé ainsi que l’activité TPMT des
4 échantillons ont été analysés au même moment à la fin de l’étude. Les techniciens de laboratoire ne
connaissaient pas les traitements pris par les patients.
88
Pour chaque patient, les valeurs moyennes des deux premières visites (phase 1 : W0 et W4) ont été
comparées aux valeurs moyennes des deux dernières visites (phase 2 : W8 et 12). Un test statistique
de Wilcoxon apparié a été utilisé pour comparer les données moyennes obtenues durant la phase 1 et
la phase 2.
Un p < 0,05 était considéré comme statistiquement significatif.
Résultats
Du point de vue clinique, en considérant tous les patients, aucun changement n'a été observé durant
les deux phases de l'étude. L'examen clinique, l'index d'activité de la maladie de Crohn, les paramètres
inflammatoires et l’hémogramme n'étaient pas modifiés.
Le monitoring des concentrations en métabolite acétylé des acides 5-aminosalicylique a bel et bien
confirmé que tous les patients prenaient un traitement 5-ASA durant la phase 1 et que tous les patients
avaient effectivement stoppé ce traitement durant la phase 2.
Le taux moyen de 6TGN en phase 1 était de 148 pmol/8 x108 érythrocytes et a diminué
significativement (p=0,027) à 132 pmol/8 x108 érythrocytes durant la phase 2. Lorsque l’on a analysé
cet effet pour chaque sous-groupe de patients (sulphasalazine et mésalazine) spécifiquement, les taux
de 6TGN en phase 2 ont diminué respectivement à 130 et 136 pmol/8 x108 érythrocytes, sans
différence significative. Lorsqu’on a considéré les résultats individuels, les 6TGN ont diminué chez 12
patients, sont restés stables chez 2 patients et ont augmenté chez 2 patients (un dans chaque sousgroupe).
En phase 1, l'activité TPMT mesurée chez les 16 patients a révélé des valeurs normales (moyenne à
12,29 U, 8,25-16,85) et comparables dans les 2 sous-groupes (12,14 vs 12,43). En phase 2, après
retrait de l’aminosalicylé, l’activité TPMT n’a pas changé significativement (p=0,245) et a diminué
légèrement à 11,41 U de façon comparable dans les 2 sous-groupes (11,43 vs 11,39). Les résultats des
évolutions des 6-TGN, de l’activité TPMT sont retrouvés dans les figures 12 à 14 et dans le tableau 13.
89
Tableau 13 : évolution des 6-TGN & activité TPMT
patient
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
moyenne
Taux moyen 6TGN Activité moyenne TPMT
pmol/8x108 RBC
pmol/h/ml RBC
phase 1 phase 2
phase 1
phase 2
139.5
129.5
10.6
9.6
94.5
93
10.9
10.85
132
165
13.3
11.15
57
56.5
16.85
11.05
128.5
96.5
13.15
11.9
132.5
101
10.4
13.15
181.5
172.5
11.25
13
315.5
220.5
10.7
10.75
73
97.5
13.75
12.8
209.5
158
9.95
10.45
116
101.5
11.75
11.6
140.5
127
15.85
10
186.5
180.5
13.3
13.75
132
116
13.8
11.15
116
96
12.8
14.05
219
211
8.25
7.3
148
132
12.29
p = 0.027
11.41
p = 0.245
90
350
Taux moyen de 6-TGN pmol /8 x108 érythrocytes
Figure 12 : évolution des 6-TGN
Patient 1
300
Patient 2
Patient 3
250
Patient 4
Patient 5
Patient 6
200
Patient 7
Patient 8
Patient 9
150
Patient 10
Patient 11
Patient 12
100
Patient 13
Patient 14
Patient 15
50
Patient 16
0
1
Phase
91
2
Moyenne Activité TPMT (pmol/h/ml RBC)
Figure 13 : évolution activité TPMT
17
patient 1
16
patient 2
patient 3
15
patient 4
14
patient 5
patient 6
13
patient 7
patient 8
12
patient 9
11
patient 10
patient 11
10
patient 12
9
patient 13
patient 14
8
patient 15
patient 16
7
1
Phases
92
2
Figure 14 : évolution 6TGN et activité TPMT
150
146
6tgn
148
tpmt activity
13,5
6-TGN
p=0,027
Mean 6TGN (pmol/8x108 RBC)
13
144
142
12,5
12,29
140
138
12
Activité TPMT
p=0,249
11,41
11,5
136
11
132
134
132
10,5
Phase 1:
5-ASA + AZA
Phase 2:
AZA seul
130
phase 1
phase 2
93
10
Mean TPMT activity (pmol/h/ml RBC)
148
14
Discussion
Cette étude, réalisée chez des patients souffrant de maladie de Crohn en phase quiescente, démontre
une interaction in vivo entre AZA et les 5-ASA en l’absence d’une inhibition de l’activité de la TPMT. En
effet, les taux moyens de 6-TGN ont diminué significativement lorsque l'aminosalicylé a été stoppé.
Cependant, cette diminution était relativement faible (autour des 10 %) et n’a pas donné lieu à des
modifications de l’état clinique de notre groupe de 16 patients compliants. Cette petite diminution a été
observée chez la majorité des patients, mais pas chez tous. De plus, cet effet statistiquement significatif
disparaît lorsque les données d'un seul patient présentant une diminution des taux de 6TGN sont
retirées. Ceci pourrait être expliqué par les faibles doses d'AZA utilisées. La différence est apparue plus
importante pour les patients qui présentaient un taux initial élevé de 6TGN (patients 8 et 10). A
contrario, les deux patients pour lesquels les 6TGN sont restés stables durant les deux phases
présentaient de faibles taux (patients 2 et 4), suggérant que l'interaction est plus prononcée pour de
plus hautes doses d'AZA. Une autre explication de cette diminution observée des 6TGN pourrait être la
longue durée de la thérapie combinée chez nos patients, et un possible effet d'accommodation de cette
interaction médicamenteuse.
Les taux plasmatiques d'acide 5-aminosalicylique observés chez nos patients étaient de 225 à 3900 fois
plus faibles que les concentrations utilisées (IC50) dans l'étude in vitro qui avait démontré l’inhibition de
la TPMT par les 5-ASA (208). Ces taux plasmatiques moyens de 5-aminoacides relativement faibles
(mais similaires aux données de la littérature concernant des patients traités par des doses de 5-ASA
allant de 750 à 1500 mg (215)) pourraient expliquer l’absence d’inhibition de la TPMT observée chez
nos patients.
Or, puisque l’interaction est observée, un autre mécanisme doit être suggéré pour expliquer la
diminution observée des 6TGN après le retrait des aminosalicylés. L'aminosalicylé pourrait interagir
avec une autre voie métabolique de l'AZA, modulant par exemple l’hypoxanthine
phosphoribosyltransférase ou la xanthine oxydase mais ceci n’a pas été démontré.
94
Tous nos patients présentaient un phénotype TPMT normal, et l'on ne peut exclure qu’un effet inhibiteur
de la TPMT par les 5-ASA serait retrouvé chez les patients présentant une activité plus faible de cette
enzyme.
Par ailleurs, après absorption, la plus grande partie de l'aminosalicylé est acétylée. Le phénotype
acétylateur des patients n'a pas été déterminé, et ceci pourrait être un facteur influençant la demi-vie du
5-ASA, sa concentration et la durée d'une possible interaction. On peut également émettre l'hypothèse
que l’effet inhibiteur du métabolite acétylé sur différentes enzymes (incluant la TPMT) puisse être
différent de l'effet inhibiteur de l'aminosalicylé lui-même. De plus, les individus acétylateurs lents
présentent une plus grande incidence d'effets secondaires doses-dépendant liés aux aminosalicylés
(216). Chez ces personnes, il a été suggéré qu'une haute concentration de sulphapyridine puisse
induire une toxicité hématologique (217).
La conclusion de notre étude est que dans un groupe de 16 patients avec MC quiescente, une
interaction entre AZA et dérivés 5-ASA a été observée et semble indépendante d’un effet inhibiteur de
la TPMT. Cette interaction peut être cliniquement importante chez les patients MICI, plus
particulièrement quand des hautes doses d'AZA sont données. Le clinicien doit être conscient de cette
possible interaction lorsqu'il traite des patients par un traitement combiné.
Une surveillance accrue de l’hémogramme devrait donc être proposée en cas d’ajout de 5-ASA à un
traitement par TP.
Une étude réalisée par Gilissen et al (218) a suivi un design comparable à la nôtre. Les 27 patients
inclus présentaient une MICI en phase quiescente et étaient traités par MP et 5-ASA. Différents
paramètres cliniques et sanguins (dont l’activité TPMT, les 6-TGN et les 6-MMPR) ont été mesurés
initialement (bithérapie AZA et 5-ASA), 4 semaines après l’arrêt du 5-ASA et ensuite 4 semaines après
la reprise du 5-ASA. Tout comme dans notre étude, l’activité TPMT n’a pas été modifiée au cours des
différentes phases de l’étude, alors que tous les patients présentaient une activité TPMT normale. Les
taux de 6-TGN ont également diminué significativement (de 20 %, p<0,01) après arrêt du 5-ASA pour
95
ré-augmenter ensuite lors de leur réintroduction (6TGN : 209 à la semaine 4 vs 262 et 270 aux
semaines 0 et 8). Les 6MMP(R) ont augmenté après l’arrêt du 5-ASA pour diminuer ensuite lors de leur
réintroduction, mais cette variation n’était pas significative.
L’effet de variation des 6-TGN est plus marqué que dans notre étude, probablement parce que les
doses de TP et 5-ASA utilisées étaient plus importantes (doses médianes de MP : 0,8 mg/kg et de 5ASA : 3g).
Stocco a rapporté le cas d’un enfant qui souffrait d’une RC corticodépendante finalement sevré des
corticoïdes par l’ajout d’AZA (2 mg/kg/j) à son traitement par mésalazine (20 mg/kg) (219). Ce jeune
patient a vécu une récidive de poussée de RC dans les semaines qui ont suivi l’arrêt des 5-ASA alors
que la dose d’AZA était demeurée inchangée. Une analyse des métabolites a révélé que la
concentration de ceux-ci avait chuté sous le seuil thérapeutique après l’arrêt de la mésalazine et, de ce
fait, provoqué une rechute.
Dans une étude prospective incluant 26 patients sous dose stable de TP, les métabolites ont été
mesurés après que 2 g/jour puis 4 g/jour d’aminosalicylés aient été ajoutés, pendant une période de 4
semaines à chaque fois, avant d’être stoppés (220). Les taux de 6-TGN ont augmenté significativement
et parallèlement à l’augmentation de dose de 5-ASA : de 243 pmol /8 x108 érythrocytes (patient sous TP
seule), à 326 (TP +2 g aminosalicylé), puis 396 (TP + 4g aminosalicylé) avant de redescendre à 286
après l’arrêt des aminosalicylés.
Une étude rétrospective menée par Hande et al. chez 126 enfants et adultes souffrant de MICI traités
par TP à doses stables, a montré que les patients qui prenaient des aminosalicylés présentaient des
taux de 6TGN qui étaient plus élevés de 48 pmol/ 8 x 108 érythrocytes que les patients ne prenant que
de l’AZA (188).
La seule étude donnant des résultats contraires est une étude prospective italienne reprenant 183
patients MICI. Elle a étudié l’impact des traitements des MICI sur l’activité de la TPMT (221). 41/183
patients soit 22 % de la cohorte prenaient une bithérapie AZA/5-ASA. Les activités TPMT mesurées
96
n’étaient pas modifiées significativement par les 5-ASA. De plus, les taux de 6-TGN et de 6-MMP
n’étaient pas significativement différents selon que le traitement par TP était ou non associé à un 5ASA. Les auteurs concluaient qu’une co-prescription de 5-ASA et de TP ne pose pas de problème.
Cependant, cette étude n’a réalisé qu’une mesure unique des différents paramètres (6-TGN, activité
TPMT,..) et a comparé des groupes de patients alors que, dans les autres études, un suivi avec
plusieurs mesures des paramètres a été réalisé chez chaque patient, chacun d’entre eux étant son
propre contrôle.
Toutes ces études, sauf la dernière, tendent à démontrer qu’il existe bel et bien un effet des
aminosalicylés sur le métabolisme des TP qui amène à une augmentation des métabolites 6-TGN.
Dans certaines de ces études, des dosages de 6-MMP(R) ont également été réalisés et ne se sont pas
modifiés de façon significative (218, 220). Ceci confirme nos résultats (211) qui tendent à prouver qu’un
mécanisme autre qu’une inhibition de la TPMT est responsable de cette augmentation des 6-TGN.
Les aminosalicylés peuvent donc constituer un outil de manipulation du métabolisme des TP, et leur
ajout pourrait s’avérer bénéfique notamment chez les patients sous TP n’atteignant pas une rémission
clinique sans corticoïdes. Cependant, étant donné que les taux de 6-MMP ne se modifient pas après
adjonction d’aminosalicylés, il est peu probable que ces derniers puissent jouer un rôle chez les patients
pharmacologiquement résistants aux TP qui « sur-produisent » des 6-MMP.
Enfin, une étude récente de la même équipe hollandaise s’est intéressée aux différents composés 6TGN (mono, di et triphosphate) et 6MMP(R) lors de l’ajout de 5-ASA au traitement par TP. Ils ont révélé
que l’adjonction d’une dose de 4 g de 5-ASA permettait d’observer une diminution significative des
6MMP(R) alors que cette diminution n’était pas observée pour une dose de 2 g. A contrario les 6-TGN
augmentaient déjà lorsqu’une dose de 2 g de 5-ASA était ajoutée, mais n’augmentaient plus pour une
dose de 4 g. Aucune différence significative n’était observée en ce qui concerne les différents soustypes de 6-TGN : 6TGMP,6TGDP et 6TGTP (222).
97
Cette action des 5-ASA sur le métabolisme des TP est donc clairement confirmée et semble être une
piste prometteuse, certainement pour augmenter l’efficacité des TP. Leur impact dans la survenue
d’effet secondaire de type leucopénie est également démontré et doit être pris en compte, notamment
lors de l’adjonction de 5-ASA à un traitement d’entretien par TP. Il ne semble pas y avoir d’intérêt à
l’heure actuelle à les prescrire pour éviter la survenue d’autres effets secondaires.
4.3 : Diurétiques
Une étude In vitro a révélé une possible interaction entre la TPMT et différents diurétiques : le
furosémide, le trichlorméthiazide et le bendroflumethiazide (223). Ces 3 substances diminuent l’activité
de la TPMT. Cette inhibition de la TPMT semble être non-compétitive avec la 6MP ou SAM, le cofacteur de la TPMT. Les auteurs soulignaient que cette interaction pouvait se révéler particulièrement
importante chez les individus traités par TP, en particulier s’ils sont TPMT hétérozygote déficients.
De plus, la co-administration d’un diurétique et de TP semble avoir un effet différent sur l’activité TPMT
en fonction de la durée de traitement : au départ l’activité TPMT semble diminuer et, par la suite, une
prise chronique des 2 traitements semble augmenter l’activité TPMT (224, 225).
Une deuxième étude réalisée à partir de globules rouges de 18 patients MICI , présentant une activité
TPMT élevée, normale ou intermédiaire a également révélé une inhibition de la TPMT par le furosémide
(226). Cependant, à ce jour, aucun cas d’effet secondaire de TP induit par un diurétique n’a été
rapporté.
4.4 : Infliximab
Une augmentation des taux de 6-TGN a été observée 1 à 3 semaines après le début d’un traitement par
infliximab, suggérant une interaction entre ces deux traitements sans que le mécanisme ne soit élucidé
(227). Parallèlement à cette augmentation des 6-TGN, une diminution significative (p=0,005) des
leucocytes a été observée, sans conséquence clinique.
98
Dans notre étude sur l'impact d'un génotypage extensif de la TPMT dans la prise en charge de la
myelosuppression induite par les TP chez des patients MICI (167) ; 4 patients ont développé un premier
épisode de myélosupppresion alors qu’ils étaient traités par infliximab et AZA, dont un avait reçu sa
première injection d’infliximab 15 jours auparavant.
Trois des 13 patients qui ont présenté un second épisode de leucopénie après reprise de la TP étaient
également sous infliximab. Deux de ces 3 patients ont présenté l’épisode de leucopénie dans les 15
jours qui ont suivi cette première perfusion, le troisième 2 mois et demi après. Ces données rejoignent
les résultats de l’étude de Roblin (227).
Sachant que l’intérêt d’associer une TP et un anti-TNF a été récemment relancée, notamment par les
résultats de l’étude SONIC (228), il est souhaitable qu’un contrôle de l’hémogramme dans les semaines
qui suivent l’introduction d’un anti-TNF (par exemple avant la seconde perfusion d’infliximab) soit réalisé
afin de dépister une possible leucopénie.
4.5 : AINS
Une interaction entre la TPMT et les dérivés benzoïques a été décrite in vitro par Woodson en 1983
(229). L’acide acétylsalicylique et son dérivé l’acide salicylique se sont révélés capables d’inhiber
l’activité de la TPMT.
Une étude in vitro récente a étudié l’impact d’une douzaine d’AINS différents sur l’activité TPMT (230) et
démontre qu’ils n’ont pas tous le même pouvoir inhibiteur. Le naproxène (Apranax®), l’acide
méfénamique et l’acide tofénamique se sont révélés être les inhibiteurs les plus puissants. L’ibuprofène
et le kétoprofène n’inhibent que faiblement la TPMT et aucune interaction sérieuse avec les TP ne
devrait être observée.
A ce jour, aucun cas clinique d’effet secondaire des TP induit par un AINS n’a été publié. Par ailleurs,
les AINS sont généralement déconseillés en cas de MICI car ils pourraient favoriser une poussée de la
maladie, mais cette dernière affirmation n’est pas unanimement acceptée (231, 232).
99
4. 6 : Methotrexate
Le méthotrexate (MTX) est un agent de la classe des anti-métabolites, utilisé dans le traitement de
certains cancers et dans les maladies auto-immunes. Il a prouvé son efficacité dans la maladie de
Crohn (14). Il inhibe la dihydrofolate réductase (DHFR), une enzyme capitale dans le métabolisme de
l'acide folique. L’adjonction de médicaments anti-folates comme le MTX (ou également le
trimethoprime, Bactrim®) à un traitement par TP va modifier l’activité de la TPMT. En effet, il y aura
moindre production de SAM, agent stabilisateur de la TPMT qui verra donc son activité réduite. Dès
lors, pour une même dose de TP, il y aura production plus importante de 6-TGN (voir figure 15).
L’association de MTX et de TP n’est pas habituelle dans le traitement des MICI et l’existence de cette
interaction ne contribue certainement pas à encourager cette co-prescription.
4.7 : Warfarine
Au moins 7 cas cliniques d’interaction entre TP et warfarine (Marevan®) ont été rapportés (233). D’une
part, une diminution de l’effet anticoagulant de la warfarine lors de l’ajout d’une TP nécessitant un
ajustement de la dose de l’anticoagulant qui doit alors être augmentée jusqu’à 3 à 4 fois par rapport à la
dose initiale (234, 235). Inversement, le retrait de la TP, sans réduction simultanée de la warfarine
entraîne des complications hémorragiques (236-238). Cette interaction n’est pas retrouvée pour
l’acénocoumarol (Sintrom®) ou la phencoproumone (Marcoumar®). Le mécanisme expliquant cette
interaction n’est pas connu.
100
Fig. 15: interaction MTX/TP via SAM
METHIONINE
B12
Méthionine
synthase
MTHFR
MTHFR
SAM
5-CH3FH4
SAH
S-adénosylhomocystéine
hydrolase
5-10-CH2FH4
THF
DHFR
S-adénosylméthionine
synthase
HOMOCYSTEINE
Méthotrexate
Dihydrofolates
Folates
101
TPMT
Chapitre 5 : recommandations pratiques des analyses du métabolisme des TP
Analyses enzymatiques
Comme nous l’avons vu une analyse génotypique ou phénotypique de la TPMT avant traitement ne
prédit pas tous les effets secondaires que pourrait rencontrer un patient donné. Cependant cette
analyse permet de déterminer un groupe à haut risque qui pourrait bénéficier d’une adaptation de la
dose. Ceci est clairement démontré pour la myélotoxicité induite par les TP.
Cette attitude a été proposée par Cara qui se base sur l’activité de la TPMT(239)(tableau14) ; les
patients sont divisés en sous-groupes selon l’activité enzymatique mesurée et une proposition de dose
d’AZA est faite.
Tableau 14 : adaptation des doses de TP selon l’activité TPMT (Dewit, adapté de Cara)(43)
Activité TPMT
Dose d’AZA
recommandée
Métabolite
actif
prédominant
Mécanisme
d’action
Taux de 6TGN
Myélotoxicité
potentielle
Très élevée
(>26.1 U/ml)
3.0 mg/kg/jour
6-MMR
Antimétabolique
Bas
Retardée
élevée
(>18.1-26 U/ml)
2.5 mg/kg/jour
6-MMR
Antimétabolique
Bas
Retardée
Intermédiaire
(13.8-18 U/ml)
1 .25-1.5 mg/kg/jour
Basse
(5.1-13.7 U/ml)
0.5 mg/kg/jour
6-TGN
Apoptose
Elevé
Précoce
Très basse
(<5 U/ml)
0.125 mg/kg/jour
6-TGN
Apoptose
Elevé
Précoce
Une unité d’activité TPMT représente la formation de 1 nmol de méthylmercaptopurine/heure par ml du culot d’hématies.
De la même façon, un génotypage de la TPMT oriente également la dose de TP prescrite :
- Génotypage TPMT, homozygote normal ou « Wild-type » (HM) : dose de 2.5 mg/kg/jour d’ AZA,
1.5 mg/kg/jour de MP.
- Génotypage TPMT hétérozygote (IM) : dose de 1,25 mg/kg/jour d’AZA, 0,75 mg/kg/jour de MP.
- Génotypage TPMT, homozygote déficient (LM) : ne pas prescrire ou 10 % de la dose habituelle.
Comme évoqué dans le chapitre 1, il convient de rappeler que la corrélation génotypage-phénotypage
n’est pas parfaite et qu’il existe un petit chevauchement entre les groupes TPMT homozygote normal
(phénotype prédit HM) et TPMT hétérozygote déficient (phénotype prédit IM). En effet, 1 à 2 % des
102
individus génotypés TPMT normale présentent une activité enzymatique intermédiaire. Dès lors, il
existe un faible risque, peut-être uniquement théorique, qu’en se basant sur le résultat du test génétique
on initie un traitement par TP à dose pleine exposant le patient à un risque accru de toxicité
hématologique. A contrario, 5 % des individus génotypés TPMT hétérozygote présentent une activité
TPMT normale/élevée (46). Dans ce cas-ci, en se basant sur le test génétique il est tentant de prescrire
une dose de TP plus faible et de ce fait éventuellement sous-traiter le patient.
Le dosage de l’activité proposée par Cara dépiste les patients à activité TPMT très élevée qui
présentent un plus haut risque de résistance pharmacologique aux TP et permet d’orienter vers d’autres
options thérapeutiques. Ces patients ne seront pas dépistés par un test de génotypage.
La détermination dans une pratique quotidienne des autres enzymes du métabolisme des TP ne peut
être recommandée actuellement.
5.2. Analyse des métabolites
Le dosage des métabolites des TP ne doit être pas être réalisé chez tous les patients sous antipurine
mais uniquement dans les situations d’échec du traitement par TP.
Afin d'utiliser adéquatement les 6-TGN et les 6-MMP, Sparrow et al (240) ont proposé d'identifier quatre
groupes de patients.
Groupe 1 : les patients non compliants. Ce groupe de patients peut représenter jusqu'à 20 % des
patients traités par TP. Ils ont des taux négligeables de 6-TGN et de 6-MMP.
Groupe 2 : les patients insuffisamment traités. Ils ont des taux infra-thérapeutiques des deux types de
métabolites. Une augmentation de la dose de TP apparaît nécessaire pour atteindre une rémission
clinique.
103
Groupe 3 : les patients pharmacologiquement résistants aux TP. Le profil des métabolites est défini par
des taux bas de 6TGN et des taux élevés de 6-MMP. On estime que ces patients peuvent constituer
jusqu’à 15 % de l’ensemble des patients MICI traités par TP. Ils étaient auparavant considérés comme
résistants aux TP étant donné leur incapacité à produire des taux adéquats de 6TGN malgré une
augmentation des doses de médicament (59). La formation accrue de 6-MMP peut notamment être
expliquée par une activité TPMT ultra élevée, celle-ci pouvant être réduite par l'utilisation de l’allopurinol
comme décrit avant.
Groupe 4 : patients réfractaires au traitement par TP. Des taux dits « thérapeutiques » à la fois de
6TGN et de 6MMP sont obtenus chez ces patients sans atteindre pour autant une efficacité clinique. La
poursuite d'un traitement par TP dans ce cas-là apparaît inutile. Ceci a été démontré dans une étude
prospective de 55 patients (43 MC, 12 RC) présentant une maladie chronique active après six mois de
traitement par AZA. Dans cette étude, la réponse à l'augmentation de la dose était inversement
proportionnelle au taux de 6TGN de départ. Septante-sept pourcent des patients qui présentaient des
taux de 6-TGN entre 100 à 200 au départ ont atteint l'objectif de rémission clinique sans corticoïdes. À
l'opposé aucun patient avec un taux de 6-TGN> 400 n'a pu atteindre cette rémission. Dans ce
quatrième groupe de patients, une autre classe d'agents thérapeutiques est nécessaire. La raison de
cette absence d’efficacité des TP chez ce groupe de patient donné est inconnue (241).
Récemment, Chouchana et al (242), ont ajouté un groupe au tableau ci-dessous : les patients avec un
taux de 6-TGN élevé et des taux bas de 6-MMP(R). Ce groupe sera plus à risque de développer une
myélotoxicité. En cas de développement de celle-ci, l’attitude du clinicien sera de diminuer la dose de
TP. De ce fait, la valeur ajoutée du dosage des métabolites est moindre puisqu’elle ne modifie pas
réellement l’attitude clinique, à moins qu’un doute n’existe concernant l’étiologie de la myélotoxicité.
104
Figure 16: ndications de la mesure des métabolites des Thiopurine dans les MICI.
D’après la présentation de M. Sparrow (UEGW 2009 talk force of Thiopurine) (43)
La mesure des métabolites est indiquée chez les patients ne répondant pas aux doses
adéquates/poids de TP
Group 1
Group 2
Group 3
Group 4
6-TGN & 6-MMP
Absent/Faible
6-TGN bas
&
6-MMP bas
6-TGN bas
&
6-MMP élevé
6-TGN élevé
&
6-MMP élevé
Non-adhérence
Sous-dosage
Résistance à la TP
Réfractaire à la TP
Education
Augmenter la dose
Ajout Allopurinol ?
Changer pour autre R/
Utilisation de ces tests
Ces tests de dosage des métabolites sont largement disponibles aux Etats-Unis depuis 2000. Une
étude menée dans la première année qui a suivi la diffusion des tests a révélé les données résumées
dans le tableau 15. A ce moment, il n’y avait pas de recommandation spécifique pour l’utilisation des
tests. Ils n’ont donc pas été demandés en situation exclusive de suspicion d’échec du traitement par
TP ; même si les auteurs présument, au vu des résultats, que les tests étaient principalement effectués
suite à une réponse clinique inadéquate ou un effet secondaire du traitement. Les auteurs analysent les
données uniquement sur la base des résultats obtenus sans posséder ou analyser la situation clinique.
Une des données intéressantes est que seuls 23 % des patients se situent dans le « range »
thérapeutique et que 49 % sont sous-traités (non compliants et sous-dosés). Ces résultats sont bien
évidemment intéressants pour le clinicien en particulier s’il y a une suspicion d’échec au traitement.
En ce qui concerne l’impact des dosages des métabolites et la vérification de la compliance du patient
au traitement, une étude allemande a détecté 9 % de patients non adhérents à leur traitement par TP
car présentant des taux de 6-TGN et 6-MMPR très bas ou nuls (243).
105
Tableau 15: Résultats de l’analyse des métabolites des TP :
6TGN-6MMPR chez 9187 patients
6-TGN *
6-MMPR *
Interprétation
Patients (n)
%
Indétectable
Indétectable
Non compliants
263
3
< 230
< 5700
Sous-dosage
4260
46
<230
>5700
Métabolisme préf. via TPMT
534
6
230-450
<5700
Dosage « Thérapeutique »
2444
27
230-450
>5700
Hépatoxicité potentielle
552
6
>450
<5700
Déficit TPMT potentiel (IM)
936
10
>1000
Indétectable
Déficit TPMT potentiel (LM)
58
1
>450
>5700
Surdosage
140
2
Total
9187
D’après Bloomfeld, APT, 2003
* : 6-TGN et 6-MMPR exprimés en pmol/ 8 x108 GR
Plus récemment, une étude menée par questionnaire via le WEB et visant les médecins « experts »
dans le domaine des MICI, s’est intéressée à l’utilisation des tests du métabolisme des TP dans leur
pratique quotidienne (244). Sur les 175 réponses obtenues, il apparaît que le test de la TPMT est
remboursé par les autorités de santé dans à peu près 50 % des pays (génotypage 48 %, phénotypage
54 %)(tableau 16). Le test n’est tout simplement pas disponible dans 26 (phénotypage) à 29 %
(génotypage) des pays. Le remboursement du dosage des métabolites est autorisé dans à peu près 40
% des cas (6TGN 44 %, 6MMPR 35 %) et accessible dans à peu près 60 % des cas (6TGN 68 %,
6MMPR 55 %).
Par ailleurs, une détermination de la TPMT avant de débuter un traitement par TP n’est effectuée que
par 30 % (génotypage) à 43 % (phénotypage) des praticiens. Parmi ceux-ci, seuls 27 % attendent le
résultat du test TPMT avant d’initier effectivement le traitement. En cas d’activité TPMT très basse ou
très haute, trois-quarts des praticiens tiennent compte de ces résultats et adaptent la dose en
106
conséquence. Enfin, si les tests étaient facilement disponibles et remboursés, près de 50 % des
médecins interrogés les utiliseraient plus souvent. Cette étude souligne donc la sous utilisation des ces
tests et l’impact de leur disponibilité et surtout de leur remboursement sur leur fréquence d’utilisation.
Tableau 16: Accès et remboursement
des tests de monitoring du métabolisme des Thiopurines
Génotypage TPMT
n
%
6-TGN
n
%
Accès et test remboursé
84
48
Accès et test remboursé
77
44
Accès et test non remboursé
40
23
Accès et test non remboursé
42
24
Pas d’accès
51
29
Pas d’accès
56
32
n
%
6-MMPR
n
%
Accès et test remboursé
95
54
Accès et test remboursé
62
35
Accès et test non remboursé
34
19
Accès et test non remboursé
35
20
Pas d’accès
46
26
Pas d’accès
78
45
Phénotypage TPMT
d’après Roblin, IBD 2011
Il faut, de plus, souligner le fait que les résultats de plusieurs modèles pharmaco-économiques sont en
faveur du pré-test de la TPMT avant d’initier le traitement par TP (245-248).
Dans une étude récente, les coûts de la détermination du statut TPMT, les coûts liés à la survenue
d’une leucopénie et d’infections associées ont été pris en compte (249). La stratégie de détermination
systématique de la TPMT avait un rapport coût-efficacité bénéfique. Dans un deuxième modèle
analytique, la détermination de l’activité TPMT permettait une réduction des coûts par rapport à
l’absence de screening et évitait jusqu’à 10 cas de leucopénie pour 1000 patients (245).
Ces modèles doivent être testés en pratique clinique et 2 essais randomisés contrôlés (TOPIC et
TARGET) sont en cours. Ils comparent les 2 attitudes, avec et sans pré-test TPMT, en terme d’effets
secondaires, efficacité clinique, qualité de vie et coûts. Leurs résultats permettront peut être de clarifier
le débat.
107
Conclusions
Les Thiopurines sont utilisées dans les MICI depuis 50 ans, mais le métabolisme de ces médicaments
n’a jamais été aussi étudié qu’au cours de cette dernière décennie, comme en témoigne l’importante
littérature publiée.
Néanmoins, le bon usage des tests enzymatiques et des dosages des métabolites reste débattu en
pratique clinique quotidienne.
Parmi les enzymes impliquées, seule la TPMT a franchi le cap d’une utilisation courante. Un
génotypage ou un phénotypage de la TPMT avant mise en route d’un traitement par AZA ou MP,
permet d’identifier une proportion de patients (25 %) à risque de développer une myélotoxicité (effet
secondaire potentiellement mortel) et d’orienter la prescription d’une dose adéquate de TP. Le test de
génotypage peut se concentrer sur les mutations TPMT *2,*3A,*3C qui sont les seules retrouvées dans
la population caucasienne de notre étude. Il s’agit du test pré-thérapeutique le plus validé parmi tous les
tests pharmacogénétiques existants (250).
Les données concernant les autres enzymes (XOD, ITPA, GST,..) sont insuffisantes pour implémenter
leur utilisation en dehors d’essais ou d’études cliniques. Les premiers résultats nous incitent à
poursuivre les recherches sur l’impact clinique de la variation d’activité de ces différentes enzymes en
cas de traitement par TP.
Les dosages des métabolites des TP ne doivent pas être réalisés chez tous les patients mais réservés
aux situations où un échec des TP est suspecté.
Une absence d’efficacité peut être expliquée par une mauvaise compliance, une dose de TP
administrée insuffisante, un métabolisme particulier empêchant la formation de métabolites actifs ou
une véritable inefficacité des TP. Ces différentes situations peuvent être rapidement identifiées par la
réalisation des dosages des 6-TGN/6-MMP(R), qui permettent d’adapter la stratégie et d’éviter un arrêt
inapproprié du traitement. Or, les TP demeurent un traitement essentiel des MICI et sont d’ailleurs
utilisés chez un patient sur deux.
108
La réalisation des tests enzymatiques ou la mesure des métabolites ne peuvent pas se substituer au
contrôle régulier des formules sanguines et des tests hépatiques.
Parmi les interactions médicamenteuses des TP, celles impliquant l’allopurinol et les aminosalicylés
sont les plus importantes et les mieux démontrées.
L’effet myélotoxique d’une combinaison d’allopurinol/TP aux doses usuelles est certain et doit être
rappelé à la vigilance des prescripteurs. L’effet bénéfique d’une thérapie combinée (à des doses
adaptées) sur l’hépatotoxicité liée aux TP en cas de 6-MMP élevés est également très intéressant mais
nécessite une sélection appropriée des patients et un monitoring précis des métabolites des TP.
L’impact clinique de l’interaction 5-ASA/AZA est de moindre importance mais cette association
médicamenteuse est très fréquente et peut également entrainer une myélotoxicité par une
augmentation des métabolites actifs et toxiques.
Dès lors, ces associations médicamenteuses peuvent avoir un effet néfaste ou bénéfique selon la façon
dont on les utilise. Le plus important est d’être au fait de ces interactions et d’adapter en conséquence
sa stratégie thérapeutique (dose, surveillance,…).
La faible utilisation des tests du métabolisme des TP n’est pas due à une défiance par rapport à leur
intérêt mais à une accessibilité limitée ou une absence de remboursement. Ces paramètres influencent
certainement les lignes de conduite édictées par les diverses sociétés savantes.
A contrario, la non-accessibilité des tests ne doit pas constituer un frein à l’utilisation des TP dans les
MICI.
109
Perspectives :
Beaucoup de questions restent posées près de 60 ans après la conception des ces médicaments et ont
d’ailleurs été évoquées tout le long du manuscrit. Par ailleurs, comme toujours, la poursuite des
recherches amène à de nouvelles interrogations.
- Existe-t-il un lien entre la survenue des lésions endothéliales hépatiques sous TP et le statut GST
du patient ?
- L’intolérance digestive de type nausées, vomissements, qui survient sous AZA et qui peut être
évitée sous MP, est-elle liée à un statut GST particulier de l’individu ?
- La même question se pose pour les arthralgies et myalgies, qui selon Hindorf, peuvent être
évitées en passant de AZA à 6MP (126).
- Quelle est l’importance des phosphates kinases (MPK et DPK), enzymes qui interviennent dans
la production des différents types de 6TGN (mono-, di-, triphosphatés) dans la résistance au
traitement par TP ?
- Pourquoi certains patients sous TP développent-ils des taux hyper-élevés de 6-MMP, si l’activité
TPMT n’intervient que peu dans ce phénomène (193) ?
- Des taux hyper-élevés de 6-TGN, comme ceux observés lors du traitement par thioguanine, sontils responsables de la survenue de l’hypertrophie nodulaire régénérative ?
- Par quel(s) mécanisme(s) l’allopurinol diminue-t-il la production de 6-MMP responsables de
l’hépatotoxicité ?
- Le statut acétylateur rapide ou lent influence-t-il l’interaction 5-ASA/AZA ?
- …………..et, bien d’autres encore.
Parmi les différentes questions en suspens, le sujet des phénomènes immuno-allergiques (pancréatite,
syndrome grippal,..) lors de la prise d’AZA/MP nous interpelle plus particulièrement. Ces effets
secondaires sont très désagréables et par définition imprévisibles. Cependant, le délai classique de 2 à
3 semaines entre l’initiation du traitement et la survenue des symptômes peut faire évoquer un effet-
110
dose : une accumulation d’une certaine quantité de métabolites serait nécessaire pour que la réaction
allergique se déclenche. Le mécanisme exact de ces allergies demeure inconnu. Le fait que les
pancréatites ne surviennent pas lors de l’administration de 6-TG mais bien lors de l’administration
d’AZA ou MP, suggère que le métabolite ou les métabolites responsables sont situés en amont des 6TGN. Par ailleurs, certains cas de pancréatites dues aux TP et rencontrées au sein d’une même famille
peuvent faire suggérer l’intervention d’un facteur génétique.
L’ étude de Marinaki (170) a confronté les effets secondaires rencontrés sous azathioprine aux
variations-mutations TPMT (uniquement les mutations *3A/*3C) et de l’ITPA. Stocco a réalisé le même
travail pour GST (177). Les auteurs retrouvaient une possible association entre des phénomènes
immuno-allergiques et des mutations de l’ITPA ou de GST.
En collaboration avec le professeur Jean-Luc Gala, nous avons réalisé une étude exploratrice évaluant
la possibilité de rechercher les mutations de l’ITPA et de GST.
Nous souhaitons réaliser une étude comprenant davantage de patients ayant souffert de « phénomènes
immuno-allergiques » (en priorité les pancréatites), afin de les tester à la fois pour l’ensemble des
mutations de la TPMT, pour les variantes de l’ITPA et de GST. Cette étude sera réalisée à Saint Luc et
en collaboration avec différents centres du réseau.
Nous espérons, par la réalisation de cette étude, mieux comprendre les mécanismes responsables des
effets secondaires allergiques liés à l’azathioprine et éventuellement arriver à mieux dépister les
patients susceptibles de subir ce type de complication. Ceci pourrait avoir comme effet d’accroître le
profil de sécurité.
Au-delà des transformations subies par la TP au sein de la cellule, d’autres pistes qui concernent le
transport des molécules ont possiblement un intérêt dans l’évaluation de l’efficacité des TP.
La MP est importée en intracellulaire via la famille des transporteurs SLC28A/3 et 29/A2 (Solute Carrier
Family ou transporteur de nucléoside) et ses métabolites sont exportés en dehors de la cellule via
111
ABCC4 (ATP-binding cassette sub-family member C4). Dès lors, des modifications ou des variations
d’efficacité de ces transporteurs peuvent influencer les concentrations en MP ou de ses dérivés.
Une étude in vitro sur des cellules leucémiques résistantes au traitement par MP a révélé une « downregulation » de SLC28A3 et une « up-regulation » d’ABCC4, qui pourrait être un des mécanismes
expliquant la résistance (251).
ABCC4 protège la cellule d’une accumulation de 6-TGN. Or, tout comme pour les enzymes
précédemment décrites, il existe une mutation d’ABCC4 due à un polymorphisme d’un simple
nucléotide. Cette mutation entraine une diminution de fonction d’ABCC4 et dès lors une accumulation
de 6-TGN ainsi que des taux de leucocytes abaissés comme cela a pu être observé dans une
population de patients MICI. Le risque de développer une leucopénie en cas de mutation ABCC4 est de
3,3 (IC 95% : 1,03-10,57, p=0,036) (252). Cette mutation a été retrouvée dans 18 % de la population
japonaise et est également présente dans d’autres ethnies (253). Il s’agit d’une nouvelle voie de
recherche intéressante pour la compréhension de l’efficacité et de la toxicité des TP dans les MICI. Une
efficacité abaissée pourrait résulter d’une importation intracellulaire trop faible ou d’une évacuation
extracellulaire trop importante. De même, une toxicité accrue pourrait être la conséquence d’une
absorption accrue ou d’une élimination diminuée. Ainsi, il serait intéressant de tester la présence de
mutation de ABCC4 dans notre population de 46 patients qui ont présenté un épisode de MS alors qu’ils
possédaient un génotype TPMT normal. Cette analyse d’ABCC4 pourrait peut-être amener une
explication supplémentaire à la survenue des leucopénies observées.
112
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123
Annexes :
1. Principales mutations du gène de la TPMT et structure et fréquence des allèles nonfonctionnels du gène TPMT les plus fréquents
2. Thiopurine metabolism monitoring : implications in inflammatory bowel diseases.
O.Dewit, P. Starkel, X.Roblin
European Journal of Clinical Investigation, 2010, 40(11):1037-47
3. Limitations of extensive TPMT genotyping in the management of azathioprine-induced
myelosuppression in IBD patients.
O. Dewit , T. Moreels, F. Baert, H. Peeters, C. Reenaers, M. de Vos, Ph. Van Hootegem, V.
Muls,G. Veereman, F. Mana, M. Van Outryve, J. Holvoet, S. Naegels, H. Piessevaux, Y.
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124
Annexe 1 : Principales mutations de la TPMT
TPMT alleles associated with normal activity
Defective TPMT alleles
TPMT*2
[26,34]
TPMT*1
(wild-type)
TPMT*1S
[28]
TPMT*3A
[22,26,28]
T474C
(silent)
TPMT*1A
[29]
C-178T
TPMT*7
[15,16,29]
TPMT*20
[27]
TPMT*5
[20,26]
A356C
(Lys119Thr)
TPMT*10
[15,31,26]
TPMT*23
[33]
TPMT*24
§
TPMT*25
§
G292T
G460A
(Glu98Stop) (Ala154Thr)
T146C
(Leu49Ser)
A539T
(Tyr180Phe)
TPMT*11
[26,36]
C124G
( Gln42Glu)
G395A
(Cys132Tyr)
TPMT*12
[15,26]
G211A
( Gly71Arg)
TPMT*13
[15,26]
A365C
(Lys122Thr)
TPMT*14
[37]
G106A
(Gly36Ser)
C374T
(Ser125Leu)
A83T
(Glu28Val)
A1G
(Met1Val)
TPMT*15
[37]
A712G
(Lys238Glu)
GA
splice site
TPMT*16
[8,32]
G488C
(Arg163Pro)
TPMT*21
[9], §
C500G
(Ala167Gly)
G537T
(Gln179His)
T634C
(Cys212Arg)
A719G
(Tyr240Cys)
-1 G  A
splice site
TPMT*6
[20,26]
G430C
(Gly144Arg)
TPMT*20
[9]
TPMT*22
[9]
A719G
(Tyr240Cys)
TPMT*4
[20,35]
G644A
(Arg215His)
TPMT*9
[8,26], §
TPMT*19
[32]
TPMT*3D
[20]
A719G
(Tyr240Cys)
G460A
(Ala154Thr)
TPMT*3C
[22,26,28]
T681G
(His227Gln)
TPMT*8
[30]
TPMT*18
[8]
G460A
(Ala154Thr)
TPMT*3B
[22,26,28]
TPMT alleles suspected to decrease activity
TPMT*17
[8]
G238C
(Ala80Pro)
G488A
(Arg163His )
C205G
(Leu69Val)
Figure 5. Allelic variants of the human TPMT gene.
Hatched boxes, exons containing at least one mutation; White boxes,
exons with normal sequence. Solid gray boxes,non-coding exonic
sequence. Exons sizes are proportional to their relative lengths, but
introns not.
§: Present study
125
Annexe 1 : Structure et fréquence des allèles non-fonctionnels du gène TPMT les plus fréquents.
126
DOI: 10.1111/j.1365-2362.2010.02346.x
REVIEW
Thiopurine metabolism monitoring: implications in
inflammatory bowel diseases
Olivier Dewit*, Peter Starkel* and Xavier Roblin†
*
St. Luc University Hospital, Catholic University of Louvain Brussels, Brussels, Belgium, †CHU Saint-Etienne, Saint-Etienne,
France
ABSTRACT
Background Thiopurines (TP) are widely used in the management of inflammatory bowel diseases. Side effects
and inefficacy are a major concern as they lead to withdrawal of the drug.
Materials and Methods Tools investigating TP metabolism are useful to avoid inadequate cessation of TP
therapy.
Results TP metabolism is complex and many enzymes are involved. Among them, Thiopurine methyl
transferase is the only one routinely measured by pheno- or genotyping. A decreased TPMT activity results in a
potential overdosing of TP drugs leading to myelotoxicity, whereas an ultra-high activity leads to TP ineffectiveness and overproduction of methylated compounds responsible for hepatotoxicity. TPMT determination prior to
TP treatment results in an individual adapted dose. Xanthine oxidase ⁄ dehydrogenase (XOD), inosine triphosphate pyrophosphatase (ITPA) and glutathion-S-transferase (GST) are other promising enzyme targets that might
help to explain TP efficacy or toxicity. ITPA and GST polymorphisms might potentially be related to some TP side
effects, while a XOD inhibition by allopurinol could avoid TP-related hepatotoxicity.
Conclusions Utilization of thiopurine metabolites, 6-thioguanine nucleotides and 6-methylmercaptopurine, is
discussed, specifically, in case of thiopurine failure and recommendations are given about their interpretation
and potential dose optimization. These enzymes and metabolites tests are complementary to the regular monitoring of blood cells count and liver tests which remains mandatory.
Keywords 6-Thioguanine nucleotides, azathioprine, thiopurine metabolites, thiopurine side effects, TPMT.
Eur J Clin Invest 2010
Introduction
Thiopurine (TP) drugs, azathioprine (AZA), 6-mercaptopurine
(6MP) and 6-thioguanine (6TG) were discovered in the late 50s
by Elion and Hitchings, who received the Nobel Prize in Medicine in 1988 for their work. 6MP was described for the first time
as an IBD treatment in 1962 [1]. Since then, the use of thiopurine
drugs in IBD has considerably increased and nowadays, more
than half of the IBD patients are treated with azathioprine or
6-mercaptopurine [2]. Despite the fact that TP has been used for
almost 50 years, many questions remain concerning their mode
of action, metabolism, efficacy, side effects or practical use.
Side effects are found in 9–34% of cases [3], including allergic
reactions, bone marrow suppression, pancreatitis, hepatitis,
nodular regenerative hyperplasia, gastrointestinal symptoms,
infections and malignancies. As consequence, TP drugs have to
be reduced or even discontinued in up to one-third of the
patients. Given the lifelong course of inflammatory bowel
disease (IBD), it seems particularly important to optimise each
therapeutic agent before declaring treatment failure and
introducing an alternate therapy. Pharmacogenomic advances
continue to improve the optimization and personalization of
TP therapy in IBD. In this article, we reviewed data from
different studies related to TP metabolism (enzymes and
metabolites) and analysed their clinical impact on IBD
treatment.
Enzymes involved in thiopurine metabolism
Thiopurine metabolism is complex and described in Fig. 1.
Among the different enzymes involved, we will focus on Thiopurine methyl transferase (TPMT), Xanthine oxydase ⁄ dehydrogenase (XOD), inosine triphosphate pyrophosphatase
(ITPA) and glutathion-S-transferase (GST).
European Journal of Clinical Investigation 1
O. DEWIT ET AL.
www.ejci-online.com
GI
symptoms
AZA
NMI
Inhibition of de novo
nucleotide synthesis
8 OH-6MMP
AO
GST
TPMT
8-OHAZA
6-MMP
Hepatotoxicity
6-MTITP
DPK
6MP
6-MTIDP
MPK
HGPRT
XOD
Allopurinol
TPMT
8-OHMP
6-MTIMP
Nodular regenerative hyperplasia
Veno-occlusive disease
6-TIMP
6-MTG
IMPDH
MPK
XOD
TPMT
8-OHTX
6-MTGMP
6-TUA
6-TIDP
DPK
ITPA
XOD
AO
6-TXMP
6TG
TPMT
GMPS
6-TUA
GD
HGPRT
XOD
6-TX
6-TGMP
6-TITP
MPK
Allergic
reactions ?
Myelotoxicity
6-TGDP
DPK
Rac-1 inhibition,
False nucleotide incorporation and
DNA/RNA strand breakage.
6-TGTP
Figure 1 Thiopurine Metabolism. AZA, azathioprine; 6MP, 6-mercaptopurine; 6TG, 6-thioguanine; 8-OHAZA, 8-hydroxy-azathioprine; NMI, nitromethylimidazole; 8-OHMP, 8-hydroxy-mercaptopurine; 6-TUA, 6-thiouric acid; 6-MMP, 6-methylmercaptopurine;
8-OH 6-MMP, 8-hydroxy 6-methylmercaptopurine; 6-TIMP, 6-TIDP and 6-TITP, 6-thioinosine mono, di and triphosphate; 6-MTIMP,
6MTIDP and 6-MTITP, 6-methylthionosine mono, di and triphosphate; 6-TXMP, 6-thioxanthosine monophosphate; 6-TGMP, 6-TGDP
and 6-TGTP, 6-thioguanine mono, di and triphosphate; 6-MTGMP, 6-methylthioguanine monophosphate; 6-MTG, 6-methylthioguanine; 8-OHTX, 8-hydroxy-thioxanthine; 6-TX, 6-thioxanthine; AO, aldehyde oxydase; GST, glutathion-S-transferase; XOD, xanthine
oxidase ⁄ dehydrogenase; TPMT, thiopurinemethyltransferase; HGPRT, hypoxanthine guanine phosphoribosyl transferase; MPK,
monophosphate kinase; DPK, diphosphate kinase; ITPA, inosine triphosphate pyrophosphatase; IMPDH, inosine monophosphate
dehydrogenase; GMPS, guanosine monophosphate synthetase; GD, guanine deaminase.
Thiopurine methyl transferase (TPMT)
Thiopurine methyl transferase is the most frequently studied
enzyme of TP metabolism and the only one usually tested for in
routine clinic. TPMT status can be checked for based on phenotype or genotype tests.
Thiopurine methyl transferase phenotype reflects the enzyme
activity which can be measured in vitro by the conversion of
6-MP to 6-methyl-mercaptopurine (6-MMP). Analysis of TPMT
activity is difficult with considerable inter- and intra-individual
variability. Various assays are available using different units
complicating interpretation of results in daily practice.
Thiopurine methyl transferase genotyping consists of detecting single nucleotide polymorphism responsible for TPMT
inactivation. A good correlation exists between TPMT activity
and TPMT genotyping and varies from 76% to 99% as described
in different studies [4]. Based on TPMT, genetic polymorphism,
the general population can be divided in three groups: wildtype homozygous TPMT with high methylation activity (88%),
heterozygous for a deficient TPMT allele with intermediate
activity (11%) and homozygous for deficient TPMT alleles with
a low methylation activity (0Æ3%) [5]. The human TPMT gene is
located on chromosome 6 and contains 10 exons. To date, 27
alleles responsible for possible TPMT activity deficiency have
been described: *2,*3A,*3B,*3C,*3D,*4 to *25 [6]. Mutation *3A
contains two single nucleotide polymorphisms that are also
found separately in mutation *3B and *3C (exon 7 and exon 10,
respectively). One explanation for the low activity is the fact
that the TPMT protein structure is modified, which leads to
protein instability and decreased enzymatic activity. This is
reflected by TPMT half-life which decreases from 18 h in the
TPMT wild-type genotype to 15 min in genotypes *2 and *3A
[7]. TPMT *3A, *2 and *3C are the most frequent mutations
found in the Caucasian population and account for 95% off all
2 ª 2010 The Authors. Journal Compilation ª 2010 Stichting European Society for Clinical Investigation Journal Foundation
THIOPURINE METABOLISM MONITORING IN IBD
mutations [8,9]. In the African and Asian population, TPMT
*3C is the most frequently encountered genotype [9].
The debate is still open between experts advocating phenotyping and those favouring genotyping. One of the advantages
of phenotyping is to determine more precisely the TPMT activity which can vary among individuals with the same genotype.
Moreover, it allows detection of patient with a very high methylation activity. On the other hand, phenotyping can be influenced by a possible drug interaction, whereas genotyping
cannot. Indeed, studies have described interaction between
aminosalicylates, diuretics (thiazidic and furosemide) [10,11],
NSAIDs [12], AZA and TPMT activity. Aminosalicylates cause
in vitro inhibition of TPMT [13] and an interaction between
AZA and aminosalicylates has been found in different clinical
studies [14–16]. It seems that aminosalicylates are able to
increase the level of antipurine metabolites. However, the
mechanism of this interaction remains unknown, as TPMT
activity was not clearly modified by aminosalicylates in the different studies. In addition, it is not yet clear whether this interaction is of any clinical relevance. Given the potential risk of
toxicity as a result of the higher TP metabolites levels, we
recommend more frequent blood monitoring during the
weeks following dose changes or introduction of aminosalicylates. The same controversy exists for AZA, thought to
increase the TPMT activity but without a clear clinical impact
so far [17].
Impact of different TPMT activities
If a patient has a low or intermediate TPMT activity and takes
TP, the drug metabolism will be shifted towards an increased
production of active compounds, responsible not only for the
therapeutic effect of the drug but also for myelotoxicity. In a
study including 262 IBD patients, a TPMT deficient genotype
predicted leucopenia with an odd ratio of 6Æ32 in comparison
with a TPMT wild-type genotype [18]. However, the strategy of
determining TPMT status prior to the start of TP therapy (and
to adapt eventually the dose) to minimize the risk of myelotoxicity is still controversial [19–21].
It is generally admitted that a TP dose adaptation is necessary
in case of TPMT deficiency (Table 1). In case of intermediate
TPMT activity, reduction from 33% to 50% of the usual dose,
thus 1–1Æ25 mg kg)1 for AZA and 0Æ5 mg to 0Æ75 mg kg)1 for
6-MP, is recommended [22]. This strategy has been applied in a
prospective study, where an adapted TP dose was able to avoid
any acute leucopenia event [23]. The same dose adaptation was
efficient in a recent prospective work, in 77 IBD patients, using
TPMT activity and metabolites measurements to predict TP
dosing requirements [24].
In case of total TPMT deficiency (low methylator), it is usually recommended to avoid the use of TP, or unless its use is
still necessary, to decrease dosage to 10% of the normal dose
and to follow the patient with great caution and very frequent
blood monitoring [25].
At the opposite, about 15% of patients may have high TPMT
activity [26] and will shift the drug metabolism towards a more
inactive compound such as 6-MMP, thereby lowering active
6-TGN levels and increasing the risk of clinical ‘drug resistance’. Moreover, they will produce higher amounts of methylated derivates responsible for liver toxicity (see below). Ultrahigh enzyme activity status is found in 1–2% of this population
and is easily detected by a phenotypic test. Recently, a trinucleotide (GCC) polymorphism in the promoter gene of TPMT
[27] referring to a modification in the number of GCC
sequences (normally 6) has been associated with ultra-high
TPMT activity status. This trinucleotide GCC polymorphism
may explain in part ultra-high TPMT activity in some of these
patients, but presumably other polymorphisms will also be discovered in the future.
Ansari et al. [26] studied about 94 IBD patients treated with
TP, who had their TPMT activity analysed before treatment. A
TPMT activity > 14 U ml)1 was associated with a high probability of resistance to AZA ⁄ 6MP (OR 0Æ21; CI 95%: 0Æ07–0Æ68).
Cuffari et al. [28], in 41 patients, assessed the clinical response
obtained by TP according to TPMT activity. The presence of a
TPMT activity < 15Æ3 U ml)1 was associated with a 6-fold
higher response rate to azathioprine (OR: 6). Another prospective multicenter study followed 207 patients treated with
azathioprine and assessed their response according to TPMT
activity and metabolites levels [29]. An increased response rate
was associated with a baseline TPMT activity below
35 pmol (h.ml.Hb))1 (81% vs. 43%, P < 0Æ001).
Implication of TPMT in TP side effects has been described for
myelotoxicity and hepatotoxicity. In 2000, Colombel et al. [30]
published a study on 41 CD patients taking azathioprine, who
experienced leuco and ⁄ or thrombocytopenia. They analysed
the known mutations *2,*3A,*3B,*3C,*4,*5,*6,*7 and also
described a new *10 one. In this study, only 27% of all myelosuppression events could be explained by a TPMT deficiency.
In 2001, it has been demonstrated that some patients present a
low TPMT activity without carrying known mutations in the
TPMT genotype, leading to the hypothesis that all possible
mutations have not been discovered yet [31]. Recently, another
study in 61 IBD patient experiencing myelosuppression on azathioprine therapy found a similar result than Colombel et al.:
only 25% of all myelosuppression was related to a TPMT deficiency, despite the fact that 23 TPMT mutations have been analysed [32]. The mutations that have been found were restricted
to *3A,*3C and *2, suggesting that a test limited to those three
mutations might be sufficient as already proposed by others
[33]. In both studies, the delay of onset of myelosuppression
was shorter in patients with a low or intermediate methylator
phenotype compared with a high methylator phenotype.
European Journal of Clinical Investigation 3
O. DEWIT ET AL.
www.ejci-online.com
The results of various pharmacoeconomic models favour
testing of TMPT before the initiation of thiopurine treatment
[34–37]. In a recent study [38], both the cost of TPMT determination and the cost as a result of leucopenia and associated
infections were taken into account. The strategy of systematic
determination of TPMT activity was cost-effective. In a second
analytical model, TPMT activity determination has been shown
to be cost-saving in comparison to no screening and could
avoid up to 10 cases of leucopenia per 1000 patients [34]. This
assumption has to be tested in clinical practice and two randomized trials (TOPIC and TARGET) are currently ongoing.
They compare standard care and pre-treatment TPMT testing
in terms of adverse drug reactions, clinical outcome, quality of
life and costs. The results are eagerly awaited as the debate is
still open about the necessity to perform TPMT analysis before
initiating thiopurine therapy which is recommended by the
FDA but not by ECCO guidelines.
Finally, TPMT analysis does not predict all TP side effects
but determines a higher risk group which could benefit from an
adapted dose as proposed by Cara in relation to TPMT activity
(Fig. 2) [39]. We believe that, theoretically TPMT activity has
the potential to select patients with a pharmacological resistance to TP and helps us to decide upon another treatment
option.
Xanthine oxydase ⁄ dehydrogenase (XOD)
Xanthine oxydase ⁄ dehydrogenase is a cytoplasmic enzyme
involved in the degradation of endogenous and exogenous
substrates like thiopurine. Its activity is particularly high in
intestine and liver cells. Apart from rare genetic disorders (xanthinuria type I and IIA), a 4- to 10-fold inter-individual variation of XOD activity exists [40–42]. This variation is partially
explained by both environmental and genetic factors [42–44].
Like others enzymes, different single nucleotide polymorphisms in the XOD gene have been recently described [45–47]
and might explain a part of the inter-individual variation. Poor
XOD metabolizers run an increased risk of TP side effects,
whereas rapid XOD metabolizers have an increased risk of thiopurine failure as a result of low 6TGTP formation.
Allopurinol blocks XOD, and if prescribed together with
AZA or 6-MP, a shift towards an increased production of active
as well as toxic compounds occurs that are responsible for myelosuppression. This toxic drug–drug interaction has been
shown in various studies with myelosuppression occurring
within weeks of allopurinol addition [48,49]. As a consequence,
if the association is mandatory, a dose reduction of thiopurine
treatment is recommended to 25–33% of the normal dose, as
generally about two-third of thiopurine is normally inactivated
by XOD pathway [49].
Some authors took advantage of this drug–drug interaction
for it could avoid some thiopurine resistance or hepatotoxicity.
In a study including 20 IBD patients, who have high 6-MMP
levels and were non-responders to thiopurine, Sparrow et al.
commenced 100 mg allopurinol and decreased 6MP ⁄ AZA to
25–50% of the original dose [50]. They observed an increase in
6TGN levels, a decrease in 6MMP, and an improvement of the
disease as shown by the evolution of the disease activity scores
and the reduction in steroid requirements. In case of hepatotoxicity, they observed a sustained normalization of liver enzymes
during a mean follow-up period of 36 months [51]. In addition,
a recent study by Ansari et al. confirmed the benefit of an association of a low TP dose and allopurinol in patient with drug
reactions to TP. In this study, 14 ⁄ 16 patients with hepatic side
effects and 18 ⁄ 25 patients with non-hepatic side effects (myalgias, nauseas and fatigue symptoms) were able to reach clinical
remission under this drug association [52].
Indeed, the inhibition of XOD by allopurinol should lead to
an increase in levels of both 6-TGN and 6-MMP (considered as
responsible for hepatotoxicity, see below). Surprisingly, they
found that while 6-TGN levels increased, concentrations of 6MMP declined. Because allopurinol does not inhibit TPMT
activity, alternative hypotheses need to be raised: the TPMT
pathway might be less competitive for a low thiopurine dose or
allopurinol might alter metabolite distribution rather than production. Whatever the underlying mechanism might be, this
Metabolite measurements are indicated in patients not responding or experiencing adverse
events to adequate weight-bases doses of TP
Group 1
Group 2
Group 3
Group 4
Low/absent 6-TGN
and
Low/absent 6-MMP
Low 6-TGN
and
Low 6-MMP
Low 6-TGN
and
High 6-MMP
High 6-TGN
and
High 6-MMP
Non-adherence
Under-dosing
Thiopurine resistance
Thiopurine refractory
Education
Increase TP dosage
Add allopurinol ?
Change to another drug
Figure 2 Indications for Thiopurine
Metabolite Measurements in IBD. Adapted
from M Sparrow (UEGW 2009 task force of
thiopurine) [72]. Metabolite measurements
are indicated in patients not responding or
experiencing adverse events to adequate
weight-bases doses of TP.
4 ª 2010 The Authors. Journal Compilation ª 2010 Stichting European Society for Clinical Investigation Journal Foundation
THIOPURINE METABOLISM MONITORING IN IBD
association should only be considered in well selected cases
and, if a co-therapy is decided, careful full blood and TP metabolites monitoring is required.
Smith et al. [47] reported recently their study about various
XOD related polymorphisms and their impact on AZA treatment outcome in IBD. They studied AOX1 (aldehyde oxidase),
XDH (xanthine oxydase) and MOCOS (molybdenum cofactor
sulfurase: the product of which activates the essential cofactor
for AO and XDH). The study identified a weak protective effect
against adverse drug reactions with SNPs in XO (XDH
c.837C>T, P = 0Æ048) and MOCOS (MOCOS c.2107A>C,
P = 0Æ058). Patients in whom both SNPs were present
(P = 0Æ019) experienced no adverse effects. Additionally, SNP
AOX1 (c.3404A>G) predicted a lack of response to AZA therapy (P = 0Æ035), although the functional significance of metabolites produced by AO is unknown. Moreover, when patients
presented two markers of adverse outcome
[TPMT > 35 pmol (h.ml.Hb))1 and AOX1 c.3404A>G], the
probability of complete response to azathioprine was significantly decreased.
intolerant IBD patients. As those two studies yielded opposite
results concerning the association of azathioprine related allergic reactions with ITPA mutations, additional well-designed
studies are required with a higher number of patients to settle
this issue.
At the opposite, 6 Thioguanine (6TG; Lanvis, GlaxoSmithKline, Brentford, Middlesex, UK) shares with the others TP
only the last step of their metabolism and therefore does not
produce, like AZA or 6MP, numerous intermediate metabolites
that could potentially be allergy-inducing or toxic. This might
explain, why 6TG is well tolerated in IBD patients, who previously suffered from a TP allergic reaction [56] reinforcing the
hypothesis that the compound responsible for such a side effect
appears at an earlier stage in TP metabolism. Unfortunately, TG
is responsible for severe side effects such as regenerative nodular hyperplasia and veno-occlusive disease limiting its clinical
usefulness [57].
Regarding Azathioprine-induced myelosuppression, ITPA
mutations do not appear to play a role, as various studies
[54,55,58,59], except one [18] in IBD and Kidney transplant series did not show any association.
Inosine triphosphate pyrophosphatase (ITPA)
Inosine triphosphate pyrophosphatase intervenes a little
further downstream in TP metabolism at the level of IMP. The
latter, as a result of 6MP transformation, is converted into an
adenine or guanine nucleotide in nuclear cells; but it can also be
phosphorylated to ITP which in turn can undergo a dephosphorylation by ITPA (Fig. 1). This futile cycle is blocked in case
of ITPA deficiency and as a consequence an accumulation of
ITP in red cells is observed. So far, little is known about consequences of ITP accumulation in patients not taking thiopurines.
The ITPA gene is located on chromosome 20p and two infrequent ITPA mutations (*94C>A and IVS 2 + 21A>C), found
respectively, in 6% and 13% of the Caucasian population seem
clinically relevant [53]. The phenotypic expression of those
mutations is different. No enzyme activity is detectable in
ITPA94C>A homozygous patient and its activity is decreased
to 22Æ5% of the mean value of controls in a heterozygous
patient. If mutation IVS 2 + 21A>C is present, ITPA activity
decreases to 60% of the mean control value in a homozygous
and to 90% of this value in a heterozygous.
In 62 IBD patients, who experienced various AZA side
effects and 68 IBD controls tolerating AZA, assessment of
mutations TPMT*3A+3C and ITPA94C>A and IVS2 + 21A>C
showed that only mutation ITPA94C>A was significantly associated (P = 0Æ0034) with azathioprine immunoallergic reactions
(rash, flu-like syndrome and pancreatitis) but not with myelosuppression [54]. Those results were not confirmed by Gearry
et al. [55], who did not show any association between mutation
94C>A and any azathioprine side effect in 73 azathioprine-
Glutathion-S-transferase (GST)
Conversion of AZA into 6MP has widely been considered as a
non-enzymatic reaction facilitated by glutathione and other
endogenous proteins containing sulfhydril [60]. However, some
findings suggest that at certain sites, such as the liver and in the
small intestine, an enzyme reaction catalysed by GlutathionS-transferase (GST) might be responsible for 99% of AZA
biotransformation into 6MP [61]. Three major families of GST
have been described (cytosolic, mitochondrial and microsomic).
Among the cytosolic GST, A1-1, A2-2 and M1-1 are highly
expressed in the liver and exhibit the highest GST activity.
Some of the cytosolic GST isoenzymes (GST-M, P and T) show
important genetic polymorphisms.
Stocco et al. [62] studied the influence of GST (M1, P1, T1)
and TPMT (*2,*3A,*3B,*3C) polymorphisms in 70 young IBD
patients treated with AZA, 15 of whom developed side effects.
A correlation has been found between wild-type GST-M1
genotype (high activity) and an increased probability of developing adverse effects and leucopenia during treatment with
azathioprine. Individuals with high GST activity are apparently
predisposed to azathioprine side effects (pancreatitis, hepatitis,
myelosuppression, arthralgias and neuropathy) which might
be explained by two factors. First, high amounts of 6MP are
formed leading to an accumulation of active as well as toxic
compounds. Second, high GST activity favours glutathione
depletion which causes cell damage. Nevertheless, these results
have to be confirmed before the usefulness of GST testing to
predict azathioprine side effects can be assessed.
European Journal of Clinical Investigation 5
O. DEWIT ET AL.
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Digestive intolerance might be due to the imidazole compound, liberated by the AZA transformation into 6MP raising
the possibility that indeed such side effects could be avoided in
1 ⁄ 2 to 2 ⁄ 3 of cases by switching from AZA to 6MP [63–65]. It
would be interesting to check, if the GST activity plays a role in
the emergence of these side effects.
Metabolites
6-Thioguanine nucleotides (6-TGN)
Azathioprine and 6-MP are both inactive prodrugs that are
metabolized via three main enzymatic pathways to produce the
nucleotide metabolites, 6-thioguanine (6-TGN), 6-methylmercaptopurine (6-MMP) and 6-thiouracil (6-TU) (Fig. 1). 6-TGN
appears to be one of the active metabolites responsible for therapeutic efficacy. Recent work has increased our understanding
of the role of 6-TGN metabolites in achieving therapeutic
effects. It has been previously assumed that the immunosuppressive actions of TP are achieved via incorporation of 6-TGN
into lymphocytic DNA, thereby inhibiting cellular proliferation
(Table 1). However, Tiede et al. [66] have suggested an
alternative mechanism of action of these drugs by showing that
the 6-TGTP metabolite of AZA ⁄ 6-MP stimulates apoptosis of
lamina propria T lymphocytes by binding to and suppressing
Rac1, an intracellular enzyme involved in the activation of
nuclear factor jB and STAT-3 pathways.
Three thioguanine nucleotides are known [6-thioguanine
monophosphate (6-TGMP), 6-thioguanine diphosphate
(6-TGDP) and 6-thioguanine triphosphate (6-TGTP)] that are
distinguished by the number of phosphate residues attached
during the anabolic conversion of 6-thioxanthosine monophosphate. Neurath et al. [67] quantified 6-thioguanine triphosphate
(6-TGTP) levels to monitor azathioprine therapy in 50 CD
patients. The subgroup of patients with higher 6-TGN and
increased 6-TGDP levels showed a worse outcome with lower
responses rates than patients with high 6-TGN and predominantly detectable 6-TGTP levels. These data suggest that
6-TGDP levels of more than 15% of total 6-TGN levels predict
poor response in azathioprine treated patients. Conversion of
6-TGDP to 6-TGTP is supposed to be catalysed by nucleoside
diphosphate kinase (NDPK), an enzyme presenting inter-individual variability with unknown impact on 6-thioguanine
phosphates levels.
Dubinsky et al. explored in 92 IBD paediatric patients the
relationship between the therapeutic response, erythrocyte
metabolite levels and TPMT genotype, determined coincidentally with haematologic, pancreatic and hepatic parameters
[68]. 6-TGN levels > 235 pmol per 8 · 108 RBC were associated
with clinical response. In a comparable study, Cuffari et al. [28]
reported a strong correlation between treatment response and
6-TGN levels > 250 pmol per 8 · 108 RBC. Conversely, Lowry
et al. [69] did not find any level of 6-TGN to be predictive of a
response to azathioprine.
Moreover, a recent meta-analysis [70] (Table 2) showed that
the sensitivity of 6-TGN threshold levels for clinical response is
only 62% and with a specificity of only 72%. However, this
meta-analysis presented a statistically significant heterogeneity
(P = 0Æ003). The update of the meta-analysis in 2009 after exclusion of the study by Lowry et al. [69], eliminated the significant
heterogeneity (P = 0Æ09). The new pooled analysis showed that
62% of patients above the threshold value were in remission,
compared with 36% of patients below the threshold value who
were in remission. Patients in remission were more likely to
have 6-TGN levels above the threshold value, with a pooled OR
of 3Æ27 (95% CI, 1Æ71–6Æ27; P: 0Æ001).
In a recent randomized prospective study, Reishagen et al.
[71] compared the clinical response in 71 patients treated either
with a 6-TGN guided AZA dose or a standard AZA dose of
2.5 mg kg)1 d)1. After 24 weeks of AZA treatment, standard
and adapted dosing schemes led to identical 6-TGN concentrations and clinical remission rates. The authors concluded that
6-TGN adapted dosing of AZA has no apparent clinical benefit
for their patients (these results were reported for patients with
a TPMT activity between 8 and 20 nmol (mL Ery · h))1.
The apparent discordance between studies and results about
the clinical interest of 6-TGN levels might be explained by different biochemical tests which modify profoundly the 6-TGN
Table 1 Adaptation of doses in relation to TPMT activity (adapted from Cara; ref: 36)
AZA recommended
dose (mg kg)1 day)1)
Major active metabolite
Mechanism of
action
Therapeutic
6-TGN levels
Potential
myelotoxicity
3Æ0
Methylated ribonucleotides
Antimetabolic
Low
Delayed
High (> 18Æ1–26 U ml )
2Æ5
Methylated ribonucleotides
Antimetabolic
Low
Delayed
Intermediate
(13Æ8–18 U ml)1)
1Æ5
Low (5Æ1–13Æ7 U ml)1)
0Æ5
6-Thioguanine nucleotides
Apoptotic
High
Acute
Very Low (< 5 U ml)1)
0Æ125
6-Thioguanine nucleotides
Apoptotic
High
Acute
TPMT activity
Very high (> 26Æ1 U ml)1)
)1
6 ª 2010 The Authors. Journal Compilation ª 2010 Stichting European Society for Clinical Investigation Journal Foundation
THIOPURINE METABOLISM MONITORING IN IBD
Table 2 Interest of 6-TGN in patients treated with TP Meta-analysis and list of studies retained for the analysis
6-TGN
threshold*
Proportion >
threshold in
remission
Proportion
< threshold
in remission
Odds ratio
CI 95%
92 (30)
235
0Æ78
0Æ40
5Æ07
2Æ62–9Æ83
Gupta et al., 2001 [77]
101 (47)
235
0Æ56
0Æ43
1Æ65
0Æ73–3Æ75
Lowry et al., 2001 [69]
170 (114)
250
0Æ64
0Æ68
0Æ86
0Æ37–2Æ02
Cuffari et al., 2001 [78]
28 (19)
230
0Æ75
0Æ65
1Æ62
0Æ26–10Æ2
Belaiche et al., 2001 [79]
82 (47)
250
0Æ86
0Æ35
11Æ63
3Æ78–35Æ7
Goldenberg et al., 2004 [80]
74 (15)
235
0Æ24
0Æ18
1Æ47
0Æ47–6Æ42
Achkar et al., 2004 [81]
60 (24)
235
0Æ51
0Æ22
3Æ8
1Æ17–12Æ4
Osterman et al., 2006 [70]
0Æ62
CI 95% (0Æ46–0Æ78)
0Æ41
CI 95% (0Æ26–0Æ57)
2Æ61
1Æ30–5Æ22
Up-dated metanalysis* (DDW2009)
0Æ62
0Æ36
3Æ27
1Æ71–6Æ27
Study, year
Dubinsky et al., 2000 [68]
Patients
(remission)
6-TGN threshold is measured in pmol 8 · 10 RED blood cells.
*
After exclusion of Lowry’s study.
measurements. In addition, conflicting results might also be
related to significant intra- and inter-individual variability.
Nevertheless, dose escalation guided by metabolite monitoring
significantly increases the likelihood of attaining steroid-free
remission. In a recent study of 106 patients with steroid-dependent IBD, AZA dose escalation with metabolite monitoring was
performed for 12 months and permitted to achieve steroid-free
remission in 59% of patients [72]. Among patients with a
6-TGN level > 250 pmol per 8 · 108 RBC, 69% went into remission (P < 0Æ05), but no patient with a 6-TGN level < 250 pmol
per 8 · 108 RBC achieved remission (P < 0Æ01). Although
encouraging, these results need confirmation by further prospective studies.
6-Methylmercaptopurine (6-MMP)
6-Methylmercaptopurine is either degraded intracellularly into
an inactive metabolite, 6 methylmercaptopurine (6-MMP), or
transformed into the active metabolites, 6-thioguanine nucleotides (6-TGNs) and 6-methylmercaptopurineribonucleotides
(6-MMPRs). Overproduction of 6-MMP can be responsible for
adverse events. Dubinsky et al. reported that 6-MMP levels
> 5700 pmol per 8 · 108 RBC were associated with hepatotoxicity. By contrast, in a group of 60 consecutive IBD patients treated with TP included in a 20 weeks prospective study, no liver
toxicity and ⁄ or correlation with methylated metabolites was
found. Patients with me-TIMP concentrations > 11450 pmol
per 8 · 108 RBC during steady state at week 5 had an increased
risk of developing myelotoxicity (odds ratio = 45Æ0; P = 0Æ015)
[73]. To date, there is no clear explanation why, paradoxically,
some patients develop hepatotoxicity, whereas others develop
myelotoxicity. Some insight might come from the different
techniques used for dosage of methyl metabolites in both
studies. Alternatively, the authors did not analyse the same
metabolites (6MMP vs. 6TIMP) and it is conceivable that these
metabolites might have different toxicity profiles.
With the purpose of providing guidance to adequate use of
these different metabolites, Sparrow et al. [74], in a recent
review, proposed to identify four groups of patients (Fig. 2).
Group 1. Non-compliant patients. This subgroup of patient
might represent 20% of TP treated patients: they have negligible
levels of both 6-TGN and 6-MMP or methyl metabolites.
Group 2. Patients insufficiently treated. They have sub-therapeutic levels of both metabolites. TP dose escalation seems necessary to reach a clinical remission.
Group 3. Patients pharmacologically resistant to TP. The
metabolite profile is defined by low levels of 6-TGN and high
levels of methyl metabolites. This might be explained by ultrahigh TPMT activity and counter acted by allopurinol use as
previously described.
Group 4. Patients refractory to TP treatment. They reach therapeutic levels of both 6-TGN and 6-MMP without clinical efficacy. Continuation of TP therapy in this scenario seems futile,
as demonstrated in a prospective study of 55 patients (43 CD,
12 UC) with refractory disease after 6 months of AZA therapy
[75]. In this study, response to dose escalation was inversely
proportional to baseline 6-TGN levels. Seventy-seven percentage of patients with a baseline 6-TGN level of 100–200 pmol per
8 · 108 RBC achieved steroid-free remission with monitored
European Journal of Clinical Investigation 7
O. DEWIT ET AL.
dose escalation. By contrast, there was no patient with a
baseline 6-TGN level > 400 pmol per 8 · 108 RBC, who
achieved remission (P = 0Æ041). In this fourth group of patients,
another class of therapeutic agent is required.
Metabolite testing is not the only research pathway as outlined by a recent study by Waljee et al. [76]. They investigated
whether patterns in common laboratory parameters might be
used to identify appropriate immunologic responses to TP and
whether they are more accurate than measurements of TP
metabolites in identifying patient who respond to therapy. The
authors have developed a random forest algorithm based on
laboratory and age data. Although the ability of 6-TGN to differentiate responders from non-responders under azathioprine
was poor (AUROC: 0Æ594), the algorithm differentiated clinical
responders from non-responders in this test set with an
AUROC of 0Æ856. One limitation of this study consists of its
cross-sectional nature which does not allow extrapolating
whether the results of the clinical response algorithm could be
used prospectively to direct dose changes of TP or changes in
therapy. If validated, this approach would provide a low cost
and rapid monitoring, alternative to TP metabolite measurements.
Conclusions and recommendations for clinical
practice
Thiopurine methyl transferase and thiopurine metabolites have
gained considerable scientific interest as underlined by the
numerous studies on this topic that are found in the literature
over the last years. Nevertheless, their use in clinical practice is
still debated. However, these tests provide clinicians with tools
to optimize thiopurine therapy resulting in significant therapeutic benefits. TPMT genotype or phenotype testing performed prior to treatment can identify a proportion of patients
at risk of developing myelotoxicity, a life-threatening condition,
and helps in making dosage choices. Data about clinical interest
of XOD, ITPA and GST testing are too scarce to implement
directly their use in daily practice, but the first results appear
promising. Thiopurine metabolites determination should not
be performed in all patients taking antipurine therapy, but only
in a situation of suspected TP failure. Very low TP metabolite
levels in individuals thought to receive an optimal dosage regimen identifies non-compliant patients. The lack of efficacy
might also be explained by suboptimal TP dosage, ‘drug resistance’ and true inefficacy of TP. These different situations can
rapidly be identified by using 6-TGN ⁄ 6MMP tests which lead
to an adapted strategy and avoid inadequate cessation of TP
therapy, which remain a keystone of IBD treatment. Enzyme
determination or TP metabolite measurements cannot be used
as a substitute for the current practice of regular monitoring of
the blood cells count and liver tests.
www.ejci-online.com
Address
Department of Gastroenterology, St. Luc University Hospital,
Catholic University of Louvain Brussels, Av. Hippocrate 10,
1200 Brussels, Belgium (O. Dewit, P. Starkel); CHU Saint-Etienne, Saint-Etienne, France (X. Roblin).
Correspondence to: Olivier Dewit, MD, Department of Gastroenterology, St. Luc University Hospital, Av. Hippocrate 10,
1200 Brussels, Belgium. Tel.: +32 2 764 2822; fax: 32 3 764 8927;
e-mail: [email protected]
Received 30 April 2010; accepted 10 June 2010
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European Journal of Clinical Investigation 11
Clinical Biochemistry 44 (2011) 1062–1066
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Clinical Biochemistry
j o u r n a l h o m e p a g e : w w w. e l s ev i e r. c o m / l o c a t e / c l i n b i o c h e m
Limitations of extensive TPMT genotyping in the management of
azathioprine-induced myelosuppression in IBD patients
O. Dewit a,⁎, T. Moreels b, F. Baert c, H. Peeters d, C. Reenaers e, M. de Vos d, Ph. Van Hootegem f, V. Muls g,
G. Veereman h, F. Mana i, M. Van Outryve b, J. Holvoet j, S. Naegels j, H. Piessevaux a, Y. Horsmans a, J.L. Gala a
On behalf of the Belgian Inflammatory Bowel Disease Research Group (BIRD)
a
UCL Saint-Luc, Brussels, Belgium
UZA, Antwerp, Belgium
c
HHR, Roeselare, Belgium
d
U Gent, Gent, Belgium
e
ULG, Liège, Belgium
f
AZ St Lucas, Brugge, Belgium
g
CHU St Pierre, Brussels, Belgium
h
Queen Paola Children Hospital, Antwerp, Belgium
i
VUB, Brussels. Belgium
j
ZNA, Middelheim, Antwerp, Belgium
b
a r t i c l e
i n f o
Article history:
Received 23 March 2011
Received in revised form 8 June 2011
Accepted 11 June 2011
Available online 24 June 2011
Keywords:
TPMT
IBD
Myelosuppression
Leucopenia
Azathioprine
TPMT mutations
a b s t r a c t
Background and aims: TPMT deficiency is associated with azathioprine (AZA)-induced myelosuppression (MS). However, in one previous study, only about ¼ of MS episodes in Crohn's Disease patients under
AZA can be attributed to TPMT deficiency. Recently, new TPMT mutations have been described and our aim is
to investigate their clinical relevance before and after a first MS episode on thiopurine therapy.
Methods: Clinical data from 61 IBD patients having developed MS during AZA therapy were collected.
Sequencing analysis was carried out on TPMT cDNA for the presence of all currently known mutations.
Results: Only TPMT *2, *3A and *3C mutations were found in this cohort. TPMT mutations were observed
in 15 out of 61 patients (25%). Four out of 15 were homozygous for a TPMT mutation (low methylator, LM
genotype) and 11 were heterozygous (intermediate methylator, IM genotype). Median delays of MS onset
were 2, 2.75 and 6 months in the LM, IM and HM (high methylator, wild type TPMT) groups, respectively.
After the first MS episode, 36 patients resumed thiopurine treatment of which 13 experienced a second MS
episode. This second episode was also rarely associated with TPMT mutations.
Conclusions: One quarter of MS episodes during AZA were associated with TPMT deficient genotype. After
a first leucopenia episode, thiopurine therapy may be resumed in a majority of patients independently of their
TPMT genotype.
© 2011 The Canadian Society of Clinical Chemists. Published by Elsevier Inc. All rights reserved.
Introduction
Thiopurine drugs, azathioprine (AZA) and its metabolite 6mercaptopurine (6-MP), have been used in the treatment of
inflammatory bowel disease (IBD) for more than 40 years [1]. Their
use has considerably increased over the last decade as it may be
steroid sparing [2], enhance closing of fistulas or induce mucosal
healing.
In up to one third of patients, thiopurine drug efficacy is not
obtained because of side effects leading to drug dose reduction or
⁎ Corresponding author at: Department of Gastroenterology, St. Luc University
Hospital, Av. Hippocrate 10, 1200 Brussels, Belgium. Fax: + 32 2 764 89 27.
E-mail address: [email protected] (O. Dewit).
complete withdrawal [3,4]. One of the thiopurine major side effects is
myelosuppression (MS).
In a review of thiopurine-induced myelotoxicity in patients with
IBD, compiling data from 8302 patients from 66 trials [5], the
cumulative incidence of AZA/MP-induced myelotoxicity was 7%. The
incidence rate (per patient and year of treatment) was 3%.
Bone marrow toxicity may occur any time after initiation of
thiopurine therapy. In this review, the delay for the onset of MS
ranged from 12 days [6] to 27 years [7] but most cases occurred
within the first months of therapy.
While patients with myelosuppression have sometimes to be
hospitalized, data about rate and duration of hospitalization are
usually missing.
There is a dose-dependent effect of thiopurine [8] in IBD therapy.
Recommended dosages are 2 to 2.5 mg/kg for AZA and 1 to 1.5 mg/kg
0009-9120/$ – see front matter © 2011 The Canadian Society of Clinical Chemists. Published by Elsevier Inc. All rights reserved.
doi:10.1016/j.clinbiochem.2011.06.079
O. Dewit et al. / Clinical Biochemistry 44 (2011) 1062–1066
for 6MP. These recommendations do not take into account individual
thiopurine metabolism variability. AZA is rapidly converted by both
enzymatic and non-enzymatic conjugation via gluthatione [9] into 6mercaptopurine which, in turn, is enzymatically converted into an
active and an inactive moiety. The enzymes involved are hypoxanthine phosphoribosyl transferase (HPRT), Xanthine oxydase (XO),
inosine triphosphate pyrophosphatase (ITPA) and thiopurine methyltransferase (TPMT). TPMT is the most frequently studied enzyme of
TP metabolism and the only one usually tested for in routine clinic.
Both phenotype and genotype TPMT status tests are available.
TPMT genetic polymorphism was first described by Weinshilboum
[10]. The expression of the enzyme is inherited in an autosomal
codominant fashion, and consequently varies within the population.
In Caucasians, 11% of the population harbour heterozygous and 0.3%
homozygous TPMT mutations, leading to an intermediate or low
TPMT activity, respectively. In these patients, thiopurine metabolism
is shunted towards an increased production of active but also toxic
compounds. The gene encoding TPMT is located on chromosome 6
and contains 10 exons. The wild type alleles responsible for a normal
or high TPMT activity are TPMT 1, 1A and 1S. Various mutant alleles,
characterized by one or more single nucleotide polymorphisms, have
been described leading to a decreased or unknown activity of the
enzyme [11]. A high degree of concordance was demonstrated
between TPMT genotype and phenotype in Caucasians [12,13].
Heterozygous patients have intermediate activity whereas homozygous patients have low activity, although variability may be seen
between these groups. The use of these tests in clinical practice
remains controversial: in contrast to European [14] guidelines,
American guidelines suggest the use of TPMT determination before
TP administration [3].
Colombel et al. [15] analyzed the distribution of 9 mutant alleles
associated with TPMT deficiency in 41 patients with CD and MS during
thiopurine therapy. A TPMT allele deficiency (homo or heterozygous)
was found in 27% of patients experiencing myelosuppression vs. 10%
in a European control population. This result suggests a modest
relationship between the presence of these mutations and the
occurrence of bone marrow suppression but does not explain
occurrence of leuco-thrombocytopenia in all the reported cases. The
authors concluded therefore that other causes like viral infections, use
of drugs interfering with thiopurine metabolism or use of myelotoxic
drug might have been considered. Alternatively the presence of yet
unidentified TPMT mutations could explain numerous MS episodes.
Indeed, recently, additional TPMT mutations were identified and
characterized. More than 25 mutations are now indexed but the
clinical relevance of some of them remains unclear [11]. Nonetheless,
very few studies have assessed the contribution of these new TPMT
mutations on the occurrence of MS in IBD patients treated with AZA.
We therefore retrospectively investigated the impact of genotyping
extensively the TPMT exons, by use of TPMT mRNA in IBD patients
who experienced MS while taking thiopurine therapy. We aimed at
comparing the clinical characteristics of MS in deficient and normal
TPMT groups. Finally, we studied the impact of TP re-administration
on recurrence of MS.
Methods
Cohort of patients
Sixty-one patients (median age 39 years [15–75 years]), with IBD
(48 CD and 13 UC, 33 men and 28 women) were retrospectively
included after ethical committee approval and after obtaining an
individual informed consent. Only patients having developed MS
(defined as white blood cell count below 3000/mm 3 and/or
thrombocytopenia defined as a platelets count below 100,000/mm 3)
during thiopurine therapy were included. The median treatment dose
was 100 mg/day (range 50–250) and 2 mg/kg (range 0.7–2.5). Delay
1063
of onset of MS, the list of concomitant medications at that time, MS
characteristics and required therapy, as well as frequency and length
of related hospitalizations were recorded. Follow-up data on the
outcome of thiopurine treatment were also collected.
Methods
Thirty milliliters of venous blood collected in EDTA-treated tubes
were drawn from each patient, at least several weeks after MS
episode, and sent to a central laboratory for analysis. Sequence
analysis was carried out on TPMT cDNA. The presence of currently
known mutations (TPMT*2, *3A, *3B, *3C, *3D, *4,*5, *6, *7, *8, *9, *10,
*11, *12, *13, *14, *15, *16, *17, *18, *19,*20, *21, *22, *23, *24, *25)
was tested between exons 4 and 10 [11].
Total RNA was isolated from venous blood using Trizol reagent
(Roche) and retro-transcribed by Superscript™ II RNase H-reverse
transcriptase (Invitrogen) according to the manufacturers' instructions. TPMT cDNA was amplified by PCR using Ampli Taq DNA
polymerase (Applied Biosystems) and a pair of primers that anneal to
sequences within exon 4 and exon 10 of the published sequence of the
TPMT cDNA (NCBI: accession number BC009596) as follows: Sense
primer: 5′-GGAAGACATATGCTTGTGAGACA-3′; Anti-sense primer: 5′AAAAACATGTCAGTGTGATTTTATTTT-3′. Primers were designed to
avoid co-amplification of the highly similar processed pseudogene
[16]. The anticipated size of the PCR product was 819 bp. The PCR
protocol consisted of an initial denaturation step at 95 °C for 2 min,
followed by 32 PCR cycles (94 °C for 50 s, 56 °C for 40 s and 72 °C for
2 min 15 s) and a final extension at 72 °C for 10 min. cDNA sequencing
was performed on both strands with the Big Dye® terminator cycle
sequencing kit (Applied Biosystems), using an automated ABI3130
capillary sequencer. Sequences were compared with the wild type
sequence using the SeqScap version 2.0 software, which identifies
variant and sequence matches from an allele library. In addition,
sequences identify variant and sequence matches from an allele
library.
The control measurements for preventing carry-over were
previously described [17]. Briefly, contamination at the DNA level
was excluded by performing PCR analysis without reverse transcriptase, as well as by including a water control containing no cDNA
template.
A formal comparative statistical analysis was not attempted
because of the absence of comparator group and the relatively low
number of TPMT deficient patients.
Results
Fourty-six patients (75%) were wild type homozygous (high
methylator: HM) for all known mutations, 11 were heterozygous for
at least 1 non functional mutation (intermediate methylator: IM) and
4 were homozygous (low methylator: LM) (Table 1). The TPMT
variants identified were TPMT *2, *3A and *3C. In homozygous
deficient patients, mutations were *2A/*2A in 1 patient, *3A/*3A in 1
patient and *3C/*3C in 2 patients. In heterozygous patients, 10 were
*3A/*1 and 1 was *2/*1.
Median delay between azathioprine initiation and myelosuppression was 2 months (range, 5 weeks to 5 months) in LM (low
methylator genotype) patients 2.75 months (range, 4 weeks to
6 years) in IM (intermediate methylator phenotype) patients; and
6 months (range, 11 days to 7 years) in patients with HM (high
methylator genotype or wild type) (Fig. 1). Leucopenia was found in
58/61 patients (including 14/15 LM + IM patients), thrombocytopenia
in 12 patients (including 4/15 LM + IM patients) and leuco-thrombocytopenia in 9 patients (including 3/15 LM + IM patients). Anemia
defined as a hemoglobin level below 10 g/dL was found in 27 patients.
Pancytopenia was found in 8 patients (including 3/15 LM + IM
patients).
1064
O. Dewit et al. / Clinical Biochemistry 44 (2011) 1062–1066
Table 1
Summary of results.
N patients
Sex M/F
Median age (years)
Type of IBD
Median AZA dose (mg)
Median AZA dose (mg/kg)
Delay (months)
Median white blood cells count (WBC/mm³)
Presence of thrombocytopenia
Presence of anemia
Presence of pancytopenia
Concomittant medications
5-asa
allopurinol
diuretics
infliximab
NSAID
Infectious syndrome
Hospitalizations
Median stay of hospitalization (days)
Medical intervention (AB, transfusion)
Re-introduction of azathioprine
Second episode of leucopenia
Wild type/HM
Heterozygos/IM
Homozygos/LM
46
27/19
39.5
38 CD/8 UC
125
2
6
2325
8/46
16/46
4/46
11
4/7
42
8 CD/3 UC
100
1.9
2.75
2260
2/11
7/11
2/11
4
2/2
23.5
2 CD/2 UC
100
1.5
2
1465
2/4
4/4
1/4
28/46
2/46
2/46
4/46
1/46
15/46
12/46
16.5
14/46
29/46
10/29
9/11
1/11
/
/
/
2/11
4/11
10.5
5/11
6/11
3/6
3/4
/
/
/
1/4
3/4
3/4
15
3/4
1/4
0/1
Concomitant medications at the time of MS were: aminosalicylates
(n = 40); methylprednisolone (n = 10); budesonide (n = 4); infliximab (n = 4); allopurinol (n = 3); bumetanide (n = 1), spironolactone (n = 2) and NSAID (n = 2). No other medication was given in
11/61 patients. Of these, ASA, allopurinol, diuretics, infliximab and
NSAID's are known to have a drug–drug interaction with TP.
The most prevalent complication was the occurrence of an
infectious syndrome (20/61 pts). Infections were considered severe in
5 patients, including 2 patients with pneumonia, 2 with Staphylococcus
aureus septicemia and 1 Listeria meningitidis. No death was reported.
Three patients developed bleeding episodes related to
thrombocytopenia.
Transfusions were given in 17 patients.
Hospitalization was required in 19/61 patients (median duration,
15 days; range, 2 to 42 days).
With respect to the MS episode treatment, it is tempting to speculate
that LM+ IM patients might be prone to consume more frequently
medical resources. Hospitalizations were more frequent (7/15 vs. 12/46)
in LM+ IM patients, and they needed proportionally more medical
interventions (transfusions and antibiotics) (8/15 vs. 14/46) than HM
patients. Azathioprine was definitively stopped in 25 patients, stopped
and re-introduced progressively at similar dose in 9 patients (2 IM, 7
HM) or lower dose in 27 patients (1 LM, 4 IM, 22 HM) (Fig. 2).
Six of the 9 patients in whom TP was re-introduced at similar dose
developed a second episode of MS which then led to a definitive
withdrawal of TP therapy. Among these 6 patients, 2 were IM whereas
the 4 others were HM (see Table 2). Seven of the 27 patients receiving
a decreased dose of AZA dose developed a second episode of
leucopenia. Only one was IM, the 6 others were HM.
Discussion
This study shows that IBD patients developing MS under AZA
therapy are only mildly enriched in TPMT mutants. These findings are
in line with the observations from Colombel et al. In our hands,
extensive TPMT cDNA genotyping did not yield any significant
additional mutation as compared to the genotyping looking only for
the TPMT*2, *3A, *3B, *3C, *3D mutations. In the present study, the
population was mainly Caucasians. The identified TPMT mutations
were mainly *3A, *3C and *2, which reproduces findings in similar
populations [18]. Our results confirm that focusing genotyping, at
least in Caucasian populations on the presence of TPMT3A/3C/2
variants may be sufficient. More importantly, our findings emphasize
the limitations of performing TPMT genotyping in the management of
AZA induced MS.
Patients
5
4
3
2
HM
IM
1
0
//
//
//
LM
//
Months
Fig. 1. Delay between administration of azathioprine and onset of myelosuppression.
O. Dewit et al. / Clinical Biochemistry 44 (2011) 1062–1066
1065
Outcome of azathioprine therapy
N= 61
Aza definitely stopped
N=25
LM N= 3
IM N= 5
TPMT
HM
TPMT
N=17
Aza re-introduced to reach the
same dose N=9
IM
TPMT
N=2
HM
TPMT
N=7
New episode of MS
N=6/9
IM
TPMT
N=2
HM
TPMT
N=4
Aza re-introduced to reach
a lower dose N=27
LM N= 1
IM N= 4
TPMT
HM
TPMT
N=22
New episode of MS
N=7/27
IM
TPMT
N=1
HM
TPMT
N=6
Fig. 2. N = number of patient in each group, LM: low methylator, IM: Intermediate methylator, HM: high methylator, MS: Myelosuppression, TPMT: thiopurine Methyltransferase.
The median delay before MS onset was shorter in the LM + IM
group (2 and 2.75 months for homozygous and heterozygous variants,
respectively) vs. 6 months in the HM group. These differences were
more pronounced than those in the Colombel's study, where the
median delays of MS onset were 1 month in LM, 4 months in IM and
3 months in HM (24). The longer delay before MS in HM patients
support the hypothesis that other factors may be involved.
In our cohort, the median azathioprine dosage was slightly lower
than the recommended 2–2.5 mg/kg (1.5 in LM, 1.9 in IM and 2 in
HM). This reflects the well-known observation that patients are not all
treated with the optimal AZA dose and confirms the discrepancy
between recommendation and real life.
Infectious syndrome was observed in 20/61 (33%) patients
including 5/15 LM + IM and 15/46 HM patients. This is much higher
than the 6.5% infection rate reported in the literature [5]. Infections
were severe but not lethal in 5/20 (25%) patients including 2 in the
LM + IM and 3 in the HM subgroups. The retrospective nature of our
study and the potential influence of steroid administration in several
cases may hamper identification of a potential relationship between
azathioprine therapy, MS and the occurrence of infection.
Twenty seven (27/61) patients had anemia with or without
related symptoms such as asthenia, dyspnea and/or angina pectoris.
As anemia is rather common in the course of IBD (due to iron
deficiency and/or inflammation), it is not possible to identify the
genuine impact of MS episode on the hemoglobin value in those cases.
Bleeding was infrequently observed (3/61 patients). This finding
matches the low incidence of thrombocytopenia (12/61 patients),
concordantly to the literature [5].
Concomitants drugs may interfere with thiopurine metabolism
thereby precipitating MS. In clinical practice, assessing such interactions is often difficult.
The toxicity of drug interaction is well known for allopurinol [19],
which inhibits xanthine-oxydase activity and shifts azathioprine
metabolism towards active but potentially toxic moiety. Despite this
well-known drug–drug interaction, in our series, 3 patients developed
MS while treated simultaneously with both drugs (1 in IM group, 2 in
HM group). The patients developed MS respectively 4, 5 and 10 weeks
after initiation of allopurinol given at full dose (300 mg/day). These
cases outline the toxicity of such an association and the need for
reminding those related risks to health professionals and to patients.
A majority of patients received aminosalicylates (40/61) concurrently to azathioprine. An interaction between AZA and aminosalicylates has been reported in several clinical studies [20–22].
Aminosalicylates have been shown to increase the level of antipurine
metabolites but the clinical relevance of such an interaction is not yet
clinically demonstrated. Its mechanism remains unknown. To date no
clinical study identified a change in the TPMT activity subsequent to
aminosalicylates administration.
Diuretics, infliximab (IFX) and NSAIDs administration has also
been associated with thiopurine drug–drug interaction [23] and these
drugs were found in some of our patients.
In contrast to the Colombel study, where TP were only reintroduced in 7/41 (17%) patients, in the present study, AZA was readministered in 36/61(59%) of the patients, to reach a similar dose in
9 or a lower dose in 27/36 patients. Such TP administration after the
first MS episode was performed without knowing the TPMT genotype
which was performed several months later (i.e. at the time of
initiation of this retrospective study). As only 13/36 (36%) patients
experienced a second episode of MS, it can be concluded that readministration of thiopurine therapy may be relatively safely
attempted in patients who have previously developed MS during
AZA therapy. In addition, the finding that 23/36 patients did not
experience any subsequent MS episode, pleads against an underlying
genetic mechanism in those patients.
However, when thiopurine re-introduction is considered after a
first MS episode, it has to be done with caution. From this study, we
can advice to re-treat patient with a lower dose than the one initially
given. Indeed, 6/9 patients treated with the same TP dose experienced
a second MS episode, in contrast to only 7/27 that have been treated
with a lower dose than initially.
The delay of onset of the 2nd MS event was shorter in 5 patients
and longer in 6 patients suggesting that white blood cells monitoring
should not be skipped.
There were fewer concomitant medications at the time of 2nd MS,
except for IFX which was added 2 weeks before MS in 2 cases and
2.5 months in a third case. IFX-AZA has been reported as a possible
drug–drug interaction inducing leucopenia [23].
It is interesting to note that AZA dose at the time of a second MS
episode was similar to the dose used at the time of the 1st MS episode in
two of the three LM+ IM patients, which pinpoints a direct relationship
between AZA dosage and a TPMT deficient genotype. In the third case,
the second MS episode occurred at a lower thiopurine dose.
The occurrence of a second MS episode in HM patients however
raises the hypothesis that other enzyme polymorphisms or deficiencies may also interfere and contribute to enhance the thiopurine
toxicity.
1066
O. Dewit et al. / Clinical Biochemistry 44 (2011) 1062–1066
Table 2
Second myelosuppression episode in 13/36 patients.
Pat. TPMT
AZA dose/1st
MS
Second MS episode
10 *1/*3A
(IM)
13 *1/*3A
(IM)
29 WT (HM)
35 WT (HM)
39 WT (HM)
46 WT (HM)
while thiopurine is re-introduced to reach the same dose (6/9 patients)
150 mg
2.75
150 mg
1.5
5 ASA stopped
75 mg
5
75 mg
9
5ASA 3 g, infliximab (9 Mo)
150 mg
150 mg
100 mg
100 mg
2.75
4
6
11
100 mg 6MP
100 mg 6MP
100 mg
100 mg
6
3
114
3
5 ASA stopped
No change
4th infliximab infusion (2.5 Mo), 5ASA for more than 10 years
No other medication
Second MS episode
9
*1/*3A
(IM)
30 WT (HM)
32 WT (HM)
while thiopurine dose is decreased (7/27 patients)
90 mg
2.75
10 mg 6MP
2
5 ASA stopped
125 mg
50 mg
3
3.25
4
6
No other medication
1st infliximab 2 weeks before, 5ASA 3 g for years
41
45
47
54
200 mg
150 mg
150 mg
100 mg
8
10
14
30
40
16
2
21
1st infliximab 2 weeks before
No other medication
No other medication
No change
WT
WT
WT
WT
(HM)
(HM)
(HM)
(HM)
Delay 1st MS (months) AZA dose/2nd MS
75 mg
25–25–50 mg
(3 days)
50 mg 6MP
100 mg
100 mg
50 mg
Delay 2nd MS (months) Change in medication/1st MS
Pat: patient number, AZA: azathioprine, 6MP: 6-mercaptopurine, MS: myelosuppression, (Months) duration of drug intake.
In all the patients, thiopurine dose was progressively raised and the delay is related to the last dose change.
In conclusion, an extensive TPMT genotyping explains only 25% of
all MS event in IBD patients taking purine analogs. The TPMT variants
found in these patients are the most common ones (*3A,*3C,*2). A
TPMT genetic determination, if prescribed in a Caucasian population,
might focus on those variants as the other mutations do not appear to
be relevant. TPMT genotyping is a useful tool but does not seem
sufficient to direct TP treatment. No differences were found between
TPMT deficient genotype and TPMT wild type genotype in terms of
severity of MS and frequency of complications. Resuming AZA therapy
after a first MS episode may be considered, even without TPMT
determination. However the administration of a lower thiopurine
dose should be advocated in such cases.
Appendix A. Supplementary data
Supplementary data to this article can be found online at doi:10.
1016/j.clinbiochem.2011.06.079.
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Aliment Pharmacol Ther 2002; 16: 79±85.
Interaction between azathioprine and aminosalicylates: an in vivo
study in patients with Crohn's disease
O. DEW IT, R. VAN HEUVERZWY N, J. P. DESAGER & Y. HOR SMANS
Department of Gastroenterology, Catholic University of Louvain, Brussels, Belgium
Accepted for publication 4 September 2001
SUMMARY
Background: The inhibition of thiopurine methyltransferase activity, one of the enzymes responsible for
azathioprine metabolism, by aminosalicylates has been
described in an in vitro study. This could result in a
higher risk of bone marrow depression when using the
two drugs together.
Aim: To investigate the in vivo interaction between
azathioprine and aminosalicylates in quiescent Crohn's
disease by measuring 6-thioguanine nucleotide levels,
thiopurine methyltransferase activity and the plasma
levels of the acetylated metabolite of 5-aminosalicylic acid.
Methods: Sixteen patients taking a stable dose of
azathioprine, plus sulfasalazine or mesalazine, were
enrolled and completed the study. They were not taking
any drugs interfering with azathioprine metabolism.
Four visits every 4 weeks were held over a 3-month
INTRODUCTION
Azathioprine and its metabolite, 6-mercaptopurine, are
effective in achieving and maintaining remission in
patients with Crohn's disease.1 Their indications are
wide: refractory disease, ®stulating Crohn's disease,
steroid dependency, maintenance of long-term remission, etc.
Azathioprine, a thiopurine analogue, is rapidly converted non-enzymatically into 6-mercaptopurine which,
Correspondence to: Dr Y. Horsmans, Department of Gastroenterology, St
Luc Hospital, Avenue Hippocrate, 10, B-1200 Brussels, Belgium.
E-mail: [email protected]
Ó 2002 Blackwell Science Ltd
period. Aminosalicylate administration was withdrawn
after the second visit. At each visit, the blood cell count,
in¯ammatory parameters, levels of 6-thioguanine nucleotide and the acetylated metabolite of 5-aminosalicylic
acid and thiopurine methyltransferase activity were
determined.
Results: After aminosalicylate withdrawal, mean 6-thioguanine nucleotide levels decreased signi®cantly from
148 pmol (57±357 pmol) to 132 pmol (56±247 pmol)
per 8 ´ 108 red blood cells (P ˆ 0.027), without signi®cant changes in thiopurine methyltransferase activity
or biological parameters.
Conclusions: This in vivo study favours the existence of
an interaction between azathioprine and aminosalicylates through a mechanism which remains unclear.
This drug±drug interaction should be taken into
account when using azathioprine and aminosalicylates
simultaneously.
in turn, is converted into the active moiety, 6-thioguanine nucleotide, by the hypoxanthine phosphoribosyltransferase pathway. There are two other enzymatic
pathways, leading to inactive metabolites: one using
xanthine oxidase and leading to 6-thiouric acid, and the
second using thiopurine methyltransferase and leading
to 6-methylmercaptopurine.2, 3
Various side-effects of azathioprine have been reported:4 fever, rash, nausea, diarrhoea, opportunist infections, pancreatitis, hepatic and bone marrow toxicity.
Myelosuppression seems to be directly related to
increased red blood cell levels of 6-thioguanine nucleotide.5, 6
High 6-thioguanine nucleotide levels can be observed
in patients with low thiopurine methyltransferase
79
80
O. DEWIT et al.
activity, such as, for example, patients with a genetic
de®ciency of this enzyme.5, 7, 8 The expression of the
enzyme is inherited in an autosomal codominant
fashion, and consequently varies within the population. In Caucasians, 11% of the population are
heterozygous and 0.3% are homozygous with respect
to thiopurine methyltransferase de®ciency, leading to
an intermediate or low thiopurine methyltransferase
activity, respectively. In these patients, azathioprine
metabolism is shunted towards an increased production of 6-thioguanine nucleotide.9
Certain drugs might also interfere with azathioprine
metabolism. Allopurinol inhibits xanthine oxidase,
blocking one of the metabolic pathways of azathioprine.10 Other drugs may also interfere with thiopurine
methyltransferase activity, such as non-steroidal antiin¯ammatory drugs,11 diuretics11 and derivatives of
benzoic acid, e.g. sulfasalazine or mesalazine.12
The last two drugs are commonly used as ®rst-line
treatment in in¯ammatory bowel disease, and therapy
is sometimes maintained in refractory patients after the
initiation of azathioprine therapy.
Szumlanski and Weinshilboum12 reported an in vitro
inhibition of thiopurine methyltransferase with sulfasalazine and 5-aminosalicylic acid derivatives. The
potential clinical consequence is a higher risk of bone
marrow depression when using combined therapy. This
has been described in in¯ammatory bowel disease case
reports.13, 14 In one of these, a patient developed two
episodes of severe bone marrow depression while being
treated with olsalazine (a 5-aminosalicylic acid derivative) and 6-mercaptopurine. A similar phenomenon
has also been observed in an adult with Still's disease,15
in which a decrease in leucocyte counts to subnormal
levels occurred after the addition of sulfasalazine to
long-term azathioprine therapy. In this patient, the
drug combination resulted in agranulocytosis.15
In this context, we performed an in vivo study to
evaluate the possible drug±drug interaction between
azathioprine and sulfasalazine or mesalazine in patients
with Crohn's disease.
PATIENTS AND METHODS
Study group
The study protocol was approved by the ethical
committee of the Catholic University of Louvain, and
all patients gave written informed consent before being
enrolled in the study.
Sixteen patients (nine women and seven men) with
inactive Crohn's disease (Crohn's disease activity index,
< 150) on azathioprine (Imuran, GlaxoSmithKline,
Dartford, UK) and sulfasalazine (Salazopyrine, Pharmacia-Upjohn, Sweden) (eight patients) or azathioprine and mesalazine (Claversal, Tramedico, WuÈl®ng
Pharma, Gronau/Leine, Germany) (eight patients) were
enrolled in the study. Eligible patients were at least
Table 1. Baseline characteristics of patients
Patient
Age
Gender
AZA
(mg/day)
AS
(g/day)
Weight
(kg)
AZA
(mg/kg)
Duration
AZA
Evolution
Localization
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
25
47
38
42
66
41
74
64
50
39
50
23
23
29
41
37
Female
Female
Female
Male
Male
Male
Female
Female
Male
Male
Female
Male
Male
Female
Female
Female
75
100
100
100
150
100
50
100
100
75
150
100
150
100
75
75
1.5
1
2
1.5
1
2
2
2
1
1.5
1
3
1.5
1
1
2
55
53
65
55
115
94
59
70
80
65
64
58
75
79
78
54
1.36
1.89
1.54
1.82
1.30
1.06
0.85
1.43
1.25
1.15
2.34
1.72
2.00
1.27
0.96
1.39
18 months
8 years
4 years
10 years
4 years
5 years
11 years
10 years
5 years
11 years
8 years
2 years
3 years
2 years
10 years
7 years
6 years
20 years
12 years
20 years
6 years
14 years
22 years
20 years
10 years
18 years
12 years
12 years
8 years
8 years
10 years
13 years
Colitis and perineal
Ileocolitis and perineal
Ileocolitis
Ileocolitis and perineal
Colitis and perineal
Colitis and perineal
Ileocolitis and perineal
Colitis and perineal
Ileitis and perineal
Perineal
Colitis and perineal
Colitis and perineal
Colitis and perineal
Colitis and perineal
Colitis and perineal
Colitis and perineal
AS, aminosalicylates; AZA, azathioprine. Patients 1±8, sulfasalazine; patients 9±16, mesalazine.
Ó 2002 Blackwell Science Ltd, Aliment Pharmacol Ther 16, 79±85
AZATHIOPRINE AND AMINOSALICYLATE INTERACTION IN CROHN'S DISEASE
18 years of age and had been on a stable regimen of
medication for at least 3 months. The mean age
was 43 years (23±66 years), and mean duration of
azathioprine therapy was 6.4 years (2±11 years).
The azathioprine mean daily dosage was 1.46 mg/kg
(0.85±2.36 mg/kg). Drugs with the potential to interfere with azathioprine metabolism (warfarin,16 allopurinol, non-steroidal anti-in¯ammatory drugs, etc.) were
not allowed nor was any change in azathioprine
regimen. All other drugs taken were recorded. Low
doses of steroids (less than 15 mg prednisolone/day)
without dose changes were allowed during the study
period. Clinical data on the patients and their therapeutic regimen are shown in Table 1.
The study period was 3 months. Each patient was
seen four times at 4-week intervals. At each visit,
clinical examination, Crohn's disease activity index
and blood sampling were obtained. In blood samples,
the cell count, in¯ammatory parameters, red blood
cell 6-thioguanine nucleotide levels, plasma levels of
5-aminosalicylic acid and its acetylated metabolite
and thiopurine methyltransferase activity were measured. After visit 2 (1 month after study inclusion), the
aminosalicylate (sulfasalazine or mesalazine) was
stopped, dividing our study into two phases with
each patient being his or her own control: phase 1,
azathioprine + aminosalicylate; phase 2, azathioprine
alone.
Methods
The total concentration of 6-thioguanine nucleotide in
red blood cells, based on the conversion of 6-thioguanine
nucleotide to the free 6-thioguanine base, was assayed
by high performance liquid chromatography according to the method of Lennard and Singleton17 using
single wavelength detection at 342 nm. Two quality
control samples of 6-thioguanine nucleotide at 119
and 299 pmol/8 ´ 108 red blood cells were analysed
during each run. The interday coef®cients of variation
were 6.8% (116 ‹ 7.9 pmol/8 ´ 108 red blood cells)
and 4.6% (305 ‹ 13.9 pmol/8 ´ 108 red blood cells),
respectively (n ˆ 25). The limit of detection was 5 pmol/
8 ´ 108 red blood cells.
The activity of thiopurine methyltransferase was
determined according to the method described by
Weinshilboum et al.18 One unit corresponds to the formation of methylmercaptopurine at a rate of 1 pmol/h
per millilitre of packed red blood cells.
Ó 2002 Blackwell Science Ltd, Aliment Pharmacol Ther 16, 79±85
81
The high performance liquid chromatographic
method described by Bystrowska et al.,19 measuring
the concentration of 5-aminosalicylic acid and its
acetylated metabolite in plasma, was used with a few
modi®cations: ethylanthranilate was used as an
internal standard and methanol±acetonitrile±water
(32:20:48, v/v) as a solvent. The within-run relative
standard deviations were below 5.3% (range 30±1500
ng/mL) and the between-run relative standard
deviations were below 10% for the same range.
The original sample of 5-acetylated metabolites of
5-aminosalicylic acid was a generous gift from
Dr Bystrowska (Poland).
The levels of 6-thioguanine nucleotide, 5-aminosalicylic acid and its acetylated metabolite and the
thiopurine methyltransferase activity of the four samples of each patient were analysed in the same run
after study completion; the laboratory technicians
performing the assay were blind to the patient's
treatment status.
Table 2. 6-Thioguanine nucleotide (6-TGN) level and thiopurine methyltransferase (TPMT) activity at phase 1 (azathioprine +
aminosalicylate) and phase 2 (azathioprine alone). Values are the
mean of each phase. The difference between the two phases was
signi®cant for 6-TGN level (P ˆ 0.027) but not for TPMT activity
(P ˆ 0.245, N.S.)
Mean 6-TGN level
(pmol/8 ´ 108 RBC)
Mean TPMT activity
(pmol/h/mL RBC)
Patient
Phase 1
Phase 2
Phase 1
Phase 2
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
139.5
94.5
132
57
128.5
132.5
181.5
315.5
73
209.5
116
140.5
186.5
132
116
219
129.5
93
165
56.5
96.5
101
172.5
220.5
97.5
158
101.5
127
180.5
116
96
211
10.6
10.9
13.3
16.85
13.15
10.4
11.25
10.7
13.75
9.95
11.75
15.85
13.3
13.8
12.8
8.25
9.6
10.85
11.15
11.05
11.9
13.15
13
10.75
12.8
10.45
11.6
10
13.75
11.15
14.05
7.3
Mean
148
P ˆ 0.027
133
12.29
P ˆ 0.245
11.41
RBC, red blood cells.
82
O. DEWIT et al.
Statistics
For each patient, the mean values of the ®rst two visits
(phase 1) were compared with the mean values of the
last two visits (phase 2). A paired Wilcoxon rank test
was used to compare the mean data obtained during
phase 1 and phase 2. P < 0.05 was considered to be
statistically signi®cant.
RESULTS
Sixteen patients were screened and enrolled: eight in the
group taking sulfasalazine and eight in the group taking
mesalazine.
Considering all patients, no changes were observed
between the two phases with respect to clinical
examination, Crohn's disease activity index, in¯ammatory parameters and blood cell counts.
The 6-thioguanine nucleotide levels and thiopurine
methyltransferase activity are shown in Table 2 and
Figures 1 and 2.
During phase 1, in the whole group, the median
concentration of the acetylated metabolite of 5-aminosalicylic acid was 379 ng/mL (range, 105±942 ng/mL);
it was 279 ng/mL (105±849 ng/mL) for the sulfasala-
zine subgroup and 480 ng/mL (214±942 ng/mL) for
the mesalazine subgroup.
Monitoring of the acetylated metabolite of 5-aminosalicylic acid during phase 2 showed that all patients
had effectively stopped aminosalicylate therapy.
The 5-aminosalicylic acid levels obtained in some
samples varied from 49 to 780 ng/mL.
In the whole group, the mean level of 6-thioguanine
nucleotide before aminosalicylate withdrawal was
148 pmol/8 ´ 108 red blood cells (57±357 pmol). This
level was 148 pmol/8 ´ 108 red blood cells for the
sulfasalazine subgroup and 149 pmol/8 ´ 108 red
blood cells for the mesalazine subgroup.
After aminosalicylate withdrawal and considering the
whole group, the mean 6-thioguanine nucleotide level
decreased signi®cantly (P ˆ 0.027) to 132 pmol/
8 ´ 108 red blood cells (56±247 pmol). However, this
statistically signi®cant effect disappeared when the data
from one of the patients (patient 1, 5, 6, 7, 8, 10, 11,
12, 14 or 15), with a decrease in 6-thioguanine
nucleotide level, were suppressed. The 6-thioguanine
nucleotide level dropped to 130 and 136 pmol/
8 ´ 108 red blood cells in the sulfasalazine and mesalazine subgroups, respectively. No statistically signi®cant differences between these levels were observed
Figure 1. Mean 6-thioguanine nucleotide (6-TGN) evolution during phase 1 (azathioprine + aminosalicylate) and phase 2 (azathioprine
alone). Values are the mean of each phase. RBC, red blood cells.
Ó 2002 Blackwell Science Ltd, Aliment Pharmacol Ther 16, 79±85
AZATHIOPRINE AND AMINOSALICYLATE INTERACTION IN CROHN'S DISEASE
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Figure 2. Mean thiopurine methyltransferase (TPMT) activity evolution during phase 1 (azathioprine + aminosalicylate) and phase 2
(azathioprine alone). Values are the mean of each phase. RBC, red blood cells.
comparing the mesalazine and sulfasalazine subgroups.
Considering the individual results, the 6-thioguanine
nucleotide level decreased in 12 patients, remained
stable in two patients and increased in two patients (one
in each subgroup).
In the whole group, the thiopurine methyltransferase
activity before withdrawal of aminosalicylate showed
normal values (mean, 12.29 units; range, 8.25±
16.85 units). The mean thiopurine methyltransferase
activity was 12.14 units in the sulfasalazine subgroup
and 12.43 units in the mesalazine subgroup.
After aminosalicylate withdrawal, the mean thiopurine methyltransferase activity did not change signi®cantly. For the whole group, it decreased to 11.41 units
(7.3±14.5 units) (P ˆ 0.245, N.S.), with a mean activity of 11.43 units in the sulfasalazine subgroup and
11.39 units in the mesalazine subgroup.
DISCUSSION
This study, performed in quiescent Crohn's disease
patients, showed an in vivo interaction between azathioprine and aminosalicylates in the absence of
inhibition of thiopurine methyltransferase activity.
Mean 6-thioguanine nucleotide levels decreased signi®cantly when aminosalicylate was stopped. However,
Ó 2002 Blackwell Science Ltd, Aliment Pharmacol Ther 16, 79±85
this decrease was rather small (around 10%) and not
clinically relevant in our group of 16 compliant
patients. This slight decrease was observed in the
majority of patients, but not in all. Moreover, the
statistically signi®cant effect disappeared when the data
from one of the patients, with a decrease in 6-thioguanine nucleotide level, were omitted. This might be
explained by the low azathioprine dose used. The
difference seemed to be more important for higher
initial 6-thioguanine nucleotide levels (patients 8 and
10). In contrast, the two patients in whom the
6-thioguanine nucleotide levels remained stable during
the two phases had very low levels (patients 2 and 4),
suggesting that the interaction might be more prominent with a higher dose of azathioprine. Another
explanation for the small decrease might be the long
course of combined therapy in our patients, with a
possible exhausting or accommodating effect on drug±
drug interaction.
In our patients, low steady state levels of 5-aminosalicylic acid were found in plasma, whereas the
5-acetamido metabolite was found to be 2±5 times
more abundant, as previously described.20 The high
sensitivity and speci®city of the methods allowed us to
check the compliance with aminosalicylate therapy. In
our patients, the mean plasma 5-acetamido metabolite
84
O. DEWIT et al.
concentration was relatively low, but similar to that
found in patients taking doses of aminosalicylate
between 750 and 1500 mg/day.21 Plasma 5-aminosalicylic acid concentrations were 225±3900 times lower
than the IC50 determined in the in vitro study
(190 000 ng/mL) showing an interaction between
5-aminosalicylic acid and thiopurine methyltransferase
activity.12 Such a low level of 5-aminosalicylic acid
could explain the absence of thiopurine methyltransferase inhibition observed in our patients.
In our study, the interaction between azathioprine and
aminosalicylate is not caused by an interaction between
5-aminosalicylic acid and thiopurine methyltransferase
activity. This suggests that another mechanism might
play a role in inducing a decrease in 6-thioguanine
nucleotide levels observed after aminosalicylate withdrawal. Aminosalicylate could interact with other
azathioprine metabolic pathways, causing hypoxanthine phosphoribosyltransferase or xanthine oxidase
modulation. Another potential site of interaction could
be the non-enzymatic azathioprine conversion into
6-mercaptopurine, a transformation which might be
blocked or delayed by aminosalicylate.
As our patients had a normal thiopurine methyltransferase activity phenotype, we cannot exclude an
inhibiting effect of thiopurine methyltransferase by
aminosalicylate in patients with the lowest activity of
this enzyme.
After absorption, most of the aminosalicylate is
acetylated. The aminosalicylate acetylator phenotype
of the patients was not determined, and this might be an
in¯uencing factor, with regard to the 5-aminosalicylic
acid half-life, its concentration and the duration of a
possible interaction. It could be hypothesized that the
inhibiting effect of the acetylated metabolite on different
enzymes (including thiopurine methyltransferase) could
differ from that of the aminosalicylate itself. Individuals
who are slow acetylators experience a higher incidence
of aminosalicylate dose-dependent adverse effects.22 In
these subjects, it has been suggested that a high
concentration of total sulfapyridine may induce haematological adverse effects.23
The design of the study, which involved the withdrawal of aminosalicylates in patients already on
azathioprine, was inspired by routine clinical practice
in which it is common to discontinue aminosalicylates
in patients already on azathioprine therapy.
It should be noted that aminosalicylate withdrawal
had no effect on the clinical and biological evolution of
these Crohn's disease patients on azathioprine. Relapse
of the disease was not observed, and there were no
signi®cant changes in the Crohn's disease activity index,
in¯ammatory parameters or white cell counts during
the 3-month study period. Despite the relatively short
follow-up period (2 months), it is debatable whether
both families of drugs should be maintained in patients
with quiescent Crohn's disease.
In conclusion, in a group of 16 quiescent Crohn's
disease patients, an interaction between azathioprine
and aminosalicylate derivatives was observed which
seemed to be independent of an inhibitory effect on
thiopurine methyltransferase activity. This might be of
clinical relevance in in¯ammatory bowel disease, especially in refractory disease where a high dose (> 2 mg/
kg) of azathioprine is given. The clinician should be
aware of this drug±drug interaction when treating
patients with combined therapy.
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