Détection de la surexpression de erb-B2 par immunohistochimie : pourquoi, quand, comment ? F. Penault-Llorca* L a famille des EGF (Epithelial Growth Factors) compte quatre membres (EGF-r, erb-B2, erb-B3, erb-B4). Parmi eux, erb-B2 ou HER2/neu, a été étudié de façon extensive dans le cancer du sein ces dernières années (1, 2). Il s’agit d’un oncogène situé sur le chromosome 17q21. Il code pour un récepteur transmembranaire de la famille des tyrosines kinases. Il est amplifié et surexprimé dans 20 à 30 % des cancers du sein invasifs, dans 50 % des * Service d'anatomie et de cytologie pathologiques, centre Jean-Perrin, 58, rue de Montalembert, 63001 Clermont-Ferrand. La Lettre du Cancérologue - volume XI - n° 1 - janvier-février 2002 carcinomes intracanalaires et dans 90 % des maladies de Paget du mamelon. Il est non amplifié et non surexprimé dans le sein normal et hyperplasique. Son expression normale représente tout de même plus de 10 000 récepteurs à la surface cellulaire. La protéine HER2 est un récepteur transmembranaire qui forme des homodimères ou des hétérodimères avec les autres récepteurs de la famille des EGF, sous l’action de leurs ligands. Cette liaison entraîne une activation via une phosphorylation et déclenche une cascade de signalisations intracellulaires et la stimulation de la croissance cellulaire. HER2 n’a pas de ligand propre connu. Il s’agit d’un récepteur orphelin. 27 C O N G R È S INTÉRÊT DE L’ÉTUDE DE HER2 (1-5) Les premières études concernant HER2 se sont attachées à démontrer son intérêt en tant que facteur pronostique – sans grand succès avec le recul – , puis en tant que facteur prédictif (sensibilité à la doxorubicine, résistance au tamoxifène et au CMF, malgré des résultats contradictoires). Actuellement, la mise sur le marché d’un anticorps monoclonal humanisé dirigé contre le domaine extracellulaire p185 de la protéine HER2, l’Herceptin® (Trastuzumab), a fait de cette protéine une cible thérapeutique. HER2 apparaît comme une cible thérapeutique idéale car elle joue un rôle important dans la croissance tumorale, elle est accessible puisque située à la surface cellulaire, elle présente un fort niveau d’expression dans les tumeurs et un faible niveau d’expression dans les tissus normaux. Les études avec des anticorps dirigés contre HER2 ont montré (6-7) : in vitro, une inhibition de la prolifération des cellules surexprimant HER2 en culture et, in vivo, d’une part, l’inhibition de la croissance des xénogreffes chez la souris nude et, d’autre part, chez les patientes métastatiques d’un cancer du sein surexprimant HER2, des réponses cliniques observées sur les métastases dans 53 % des patientes sous AC/Herceptin®. Le taux de réponses dépend du niveau de surexpression de la protéine. blies sur l’étude de broyats de tumeurs) et méthodes morphologiques qui préservent l’intégrité tissulaire (tableau I). Tableau I. Avantages et inconvénients de chacune des techniques. FISH ELISA IHC Surexpression protéique Surexpression protéique Oui Non Oui Non Oui Non Oui Non Oui Non Oui Oui Oui Non applicable Oui Oui Oui Non Oui Oui ++ ++ Élevée Élevée ++ ++ Bonne Bonne + + Variable* Variable* +++ +++ Moyenne Bonne Anomalie détectée Amplification Réalisation sur coupes tissulaires Permet de différencier invasif et in situ Peut être réalisé à partir de blocs inclus en paraffine Affecté par les conditions de fixation Peut être réalisé sur microbiopsies ou ponctions Coût Temps technique Sensibilité Spécificité Biologie moléculaire Amplification *Dépend des anticorps utilisés et des conditions techniques. HER2 CIBLE DE HERCEPTIN® : QUELLES PATIENTES TESTER ? En Europe, actuellement, les patientes susceptibles de bénéficier d’un traitement ciblé par Herceptin® sont sélectionnées par immunohistochimie (IHC). Herceptin®, en association avec le docétaxel (Taxotère®), a reçu l’autorisation de mise sur le marché (AMM) pour le traitement du cancer du sein métastatique chez des patientes à forte surexpression tumorale de HER2 (score 3+) (tableau I). Comme il existe une très bonne corrélation de l’expression de HER2 entre la tumeur et les métastases (8, 9), il est recommandé de réaliser le test de préférence sur la tumeur initiale ou, à défaut, sur les métastases si elles sont facilement accessibles (métastases cutanées, nodules de perméation). Le test doit être réalisé sur coupes histopathologiques (prélèvements cytologiques en évaluation). Actuellement, avec le développement d’essais thérapeutiques adjuvants avec Herceptin®, il paraît licite de réaliser le test au moins sur les patientes potentiellement graves (femmes jeunes, tumeurs non de grade 1, envahissement ganglionnaire…), voire sur toutes les patientes à la phase initiale de leur maladie (afin d’anticiper la stratégie thérapeutique). MÉTHODES DE DÉTECTION DE LA SUREXPRESSION DE HER2 (10-12) La mise en évidence d’une surexpression de la protéine apparaît donc comme le point clé pour commencer éventuellement un traitement par Herceptin®. Les techniques utilisées peuvent être individualisées en méthodes non morphologiques (car éta28 Les méthodes non morphologiques ne sont pas recommandées car elles sont fondées sur l’étude de broyats de tumeurs. Comme le sein normal et l’hyperplasie ne sont pas surexprimés, il peut y avoir une dilution des acides nucléiques tumoraux et un faux signal négatif : faux négatif, mauvaise sensibilité. Comme les carcinomes intracanalaires surexpriment HER2 dans plus de 50 % des cas, il peut y avoir un signal positif, erroné puisque n’intéressant pas le contingent invasif : faux positif, mauvaise spécificité. Les méthodes morphologiques sont donc recommandées car elles permettent de contrôler les types cellulaires qui présentent le signal : seul le signal du contingent invasif est significatif. Elles permettent de contrôler la qualité de la technique. Le témoin interne – le sein normal ou hyperplasique – doit être non marqué. Parmi les méthodes morphologiques, il en est deux qui sont actuellement évaluées et comparées de façon extensive de par le monde : l’immunohistochimie (IHC) et l’hybridation in situ par fluorescence (FISH). Une troisième méthode se développe, la CISH, qui est identique à la FISH, mais qui utilise une sonde chromogène non fluorescente et donc d’une utilisation plus facile (13). Immunohistochimie Les arguments en faveur de l’IHC sont qu’il s’agit d’une technique très répandue dans les services et les cabinets de pathologie, qui est caractérisée par un temps technique court, une rapidité d’interprétation, un caractère peu onéreux, la présence de contrôles externes et une validation par des études cliniques. À l’opposé, cette technique est susceptible d’être peu La Lettre du Cancérologue - volume XI - n° 1 - janvier-février 2002 reproductible en raison de la diversité des anticorps commercialisés, des variations des conditions techniques maîtrisables (comme la dilution et le prétraitement par la chaleur), ou non maîtrisables (comme la fixation). Il est capital que l’évaluation IHC du statut HER2 d’un carcinome mammaire soit optimisée et fiable (3). L’écueil majeur dans la détection immunohistochimique de la surexpression de HER2 est le risque d’une trop grande sensibilité du protocole technique et donc de faux positifs (14). Tous les fixateurs courants sont utilisables, mais le type de fixateur utilisé influe sur le signal immunohistochimique et la technique doit lui être adaptée (15). L’interprétation des immunomarquages nécessite aussi un apprentissage ; elle est délicate pour les positivités intermédiaires (16). Le signal immunohistochimique spécifique est un marquage membranaire intense et complet en “mailles de filet” des cellules néoplasiques invasives (figure 1). Ce qui rend l’immunodétection de la surexpression de HER2 particulière, c’est que, nous l’avons vu, à l’état normal, la protéine est exprimée à la surface de la cellule. Le risque est de détecter ce niveau basal d’expression, non significatif en clinique, en raison d’une trop grande sensibilité de la technique. Kits standardisés de détection immunohistochimique Aux États-Unis, la Food and Drug Administration (FDA) a reconnu Herceptest® (anticorps polyclonal DA485, Dako) puis Pathway® (anticorps monoclonal CB11, Ventana), comme tests validés pour la détection du statut HER2, dans le cadre d’un éventuel traitement par Herceptin®. Ces deux kits sont commercialisés en France. Leur prix de revient est élevé en regard de la cotation d'un acte d'immunohistochimie. Ce qui fait l’originalité de ces kits, c’est d’une part, l’inclusion de témoins qui sont des lignées cellulaires dont le taux d’expression est connu et, d’autre part, la standardisation des différentes étapes techniques. Le seul paramètre non contrôlable est la fixation des tissus. L’Herceptest®, le plus ancien, a été très critiqué pour sa trop grande sensibilité. En fait, la plupart des travaux comparant les résultats d’Herceptest® à ceux obtenus avec d’autres anticorps et par FISH (17, 18) n’étaient pas exactement réalisés dans les conditions techniques requises pour le test (fixation inadéquate) (19). Récemment, Birner et al. (20) ont montré la très bonne corrélation entre les résultats d’Herceptest® et la FISH sur plus de 300 patients. La fixation Les conditions de fixation et de prétraitement des lames peuvent considérablement modifier le signal (15). S’il n’existe pas de fixateur idéal, il faut savoir que la fixation en liquide de Bouin est délétère pour la plupart des antigènes (et plus particulièrement pour ceux reconnus par le Tab250 et le CB11 en l’absence de prétraitement par la chaleur). Mais l’adjonction d'un prétraitement permet de pallier cet effet dans de nombreux cas. Par ailleurs, les fixateurs alcooliques seraient générateurs de faux positifs avec le kit Herceptest® (17). Figure 1. Immunomarquage membranaire complet d’intensité forte présent dans toutes les cellules tumorales invasives identifiables. Score 3+. Surexpression de HER2 par IHC. Carcinome canalaire infiltrant, fixation AFA. Anticorps polyclonal DA485, dilution au 1/1 500. remarques techniques concernant l’IHC •LesQuelques anticorps Parmi les anticorps disponibles sur le marché, les deux les plus utilisés sont l’anticorps monoclonal CB11 (Novocastra) et l’anticorps polyclonal DA485 (Dako), tous deux dirigés contre le domaine interne de la protéine. Par ailleurs, l’anticorps monoclonal Tab250 (Zymed) reconnaît la portion externe de la molécule, où est située la cible du médicament et l'anticorps monoclonal 3B5 (Oncogene Science), sa portion interne. La protéine n’étant pas tronquée, le choix d'un anticorps dirigé contre un épitope de localisation intra- ou extra-cellulaire n’a pas d'importance et ne donne pas d’information sur la fonctionnalité du récepteur. La Lettre du Cancérologue - volume XI - n° 1 - janvier-février 2002 Les témoins Le parenchyme mammaire normal (témoin négatif) et une maladie de Paget, un carcinome intracanalaire de haut grade ou une tumeur dont le statut HER2 est connu (témoin positif) sont facilement accessibles pour les pathologistes. L'idéal pourrait être de disposer de témoins tissulaires ou de lignées cellulaires sous forme de multiblocs calibrés que chaque service pourrait étalonner selon son protocole habituel. Certaines firmes commercialisent des témoins sous forme de lignées, mais à des prix encore prohibitifs. Une fois la technique calibrée Les cas douteux ne devraient pas représenter plus de 10 %. Il est important de participer à des évaluations externes d’assurance qualité (AFAQAP, UK-NEQAS) et de suivre les recommandations publiées par les groupes de travail afin d’affiner sa technique. Comment évaluer le score de réponse ? Plusieurs systèmes de score ont été proposés, aucun n’a été validé. Le score le plus connu des cliniciens et celui utilisé dans l’analyse des études récentes sur l’Herceptin® (voir plus loin) est la grille de l’Herceptest® de Dako (tableau II). Ce qui est 29 C O N G R È S probable, c’est que le score utilisé jusqu’ici pour l’évaluation d’un pronostic est sûrement différent de celui utilisé pour prédire la réponse à Herceptin®. Mais seules des études cliniques sur de grandes séries homogènes de patientes pourront nous donner une valeur seuil pour prédire la réponse à Herceptin®. Tableau II. Score immunohistochimique reconnu pour décider d’un traitement par Herceptin® dans le cadre de l’AMM. Score Marquage Interprétation 0 Absence de marquage ou membranaire < 10% Marquage faible et partiel de plus de 10 % des cellules Marquage membranaire, faible/modéré et complet, de plus de 10 % des cellules Marquage membranaire, fort et complet, de plus de 10 % des cellules Négatif Signification clinique Pas de traitement Négatif Pas de traitement Cas douteux Pas de traitement dans le cadre de l’AMM* Traitement 1 + 2+ 3+ Positif * Si une étude complémentaire par FISH met en évidence une amplification du gène HER2, le traitement par Herceptin® peut être proposé. Aux États-Unis, les indications du traitement par Herceptin® incluent le score 2+. LA FISH Le principe est celui d’une hybridation de l’ADN en une étape, avec une sonde prémarquée par la fluorescence. Deux tests sont principalement commercialisés : le kit Oncor/Ventana et le kit Vysis. Ces kits sont approuvés par la FDA, mais pas dans l’indication Herceptin®, comme pour l’Herceptest®, mais pour établir le pronostic et prédire la réponse à une chimiothérapie standard chez les patientes avec ou sans envahissement ganglionnaire (1, 12). Les arguments en faveur de la FISH sont qu’elle est hautement spécifique, qu’elle se présente sous forme de kits standardisés, sur le plan de la technique et de l’expression des résultats. Les résultats sont quantitatifs et, pour les sondes Vysis, rapportés au nombre de chromosomes 17, visualisés grâce à une sonde centromérique. Cette technique peut être réalisée sur coupe en paraffine. Comme pour l’IHC, des contrôles internes peuvent être effectués simultanément. Les arguments contre sont qu’il s’agit d’une méthode indirecte – on détecte l’amplification du gène et non sa surexpression, et dans 5 à 10 % des cas, il peut y avoir surexpression sans amplification – , que l’appareillage est onéreux et que la technique est pour le moment réservée à quelques centres spécialisés (actuellement, en France, seuls quelques centres pratiquent la FISH HER2 en routine). Une amplification est définie par un nombre de copies de HER2 supérieur au nombre de centromères du chromosome 17 (le rapport doit être supérieur à 2). Si l’on ne dispose pas de sonde pour le centromère du chromosome 17, la présence de plus de 4 copies de HER2 suggère une amplification. Cependant, on ne peut éliminer une sur-représentation du gène par hyperploïdie du chromosome 17. À partir de 6 copies de HER2, l’amplification est fort probable. Une amplification forte est considérée selon les auteurs entre 10 et 20 copies de HER2. 30 La FISH est techniquement plus difficile que l’IHC, longue à réaliser et coûteuse (voir tableau I). Au même titre que l’immunohistochimie, des variations intra- et interlaboratoires sont possibles : épaisseur des coupes, prétraitements, interprétation… et une démarche d’“ assurance qualité ” s’impose (2124). En cas de fixation au Bouin ou de contact des tissus avec le Bouin, la technique de FISH n’est pas réalisable. On considère aujourd’hui, en Europe, la FISH comme une alternative à l’immunohistochimie pour la détection (indirecte) de la surexpression de HER2. Elle est, en revanche, très utile pour définir les cas 2+ (puisque seuls les cas 2+, FISH amplifiés, répondent à Herceptin®). Elle permet de calibrer la technique IHC. Aux États-Unis, plusieurs équipes ont milité pour l’utilisation de la FISH en routine dans la sélection des patientes pour un traitement par Herceptin®. Cela vient du fait que dans beaucoup des études pivots qui ont évalué Herceptin®, les tests IHC n’étaient pas optimaux et, en particulier, le taux de 2+ (parfois de l’ordre de 20 à 30 %) paraît beaucoup trop élevé. Concordance entre FISH et IHC Le taux de concordance est de 80-95 % (12, 19). La concordance est très forte pour les cas fortement positifs et négatifs en IHC, respectivement FISH+ et FISH–. Douze à 29 % des cas présentant un marquage faible (2+) seront amplifiés par FISH (tableau III). Dans l’étude pivot (ASCO 2000), la corrélation FISH/IHC (CTA) pour les cas 2+ est de 24 %, contre 89 % pour les 3+ (25). Tableau III. Concordance réponse clinique FISH étude (H0649g). Groupe 3+ (n = 107) 3+ en IHC Réponse Absence de réponse Taux de réponses FISH+ 18 72 20 % FISH– 0 17 0% Groupe 2+ (n = 35) 2+ en IHC Réponse Absence de réponse Taux de réponses FISH+ 3 12 20 % FISH– 0 20 0% Résultats cliniques L’interprétation des essais pivot et des premiers essais cliniques a montré que les cas 3+ en IHC répondaient mieux à Herceptin® que les cas 2+ et, a fortiori, que les cas négatifs. La FISH a permis d’identifier la population des patientes 2+ susceptibles de répondre à Herceptin®. Ainsi, la population de patientes FISH amplifiées (comprenant des 3+ et des 2+) présente une évolution identique aux patientes 3+ (26). RECOMMANDATIONS À l’heure actuelle, il n’y a pas de réactifs ou de méthodes pouvant être recommandés pour le test (5, 14, 24, 27, 28). Dans le compte rendu, il faut rapporter la méthode et le réactif utilisés. La Lettre du Cancérologue - volume XI - n° 1 - janvier-février 2002 Seul le contingent invasif doit être pris en compte dans le score. Pour l’immunohistochimie, seul le marquage membranaire est considéré comme positif. Le compte rendu doit inclure le pourcentage estimé de cellules marquées plus ou moins l’intensité. Si un score particulier ou une valeur seuil de positivité sont utilisés, ils devront être définis. Les cas douteux devront être testés par une autre méthode. Quels que soient la technique et le seuil utilisés, ils devront être corrélés avec les données cliniques et morphologiques. R É F É R E N C E S B I B L I O G R A P H I Q U E S 1. Ross SR, Fletcher JA. HER2/neu (c-erb-B2) gene and protein in breast cancer. Am J Clin Pathol 1999 ; 112 (suppl. 1) : S53-S67. 2. Penault-Llorca F, Jacquemier J. Outil pronostique, thérapeutique, explorateur de la carcinogenèse : quelle place pour erb-B2 en cancérologie mammaire. Ann Pathol 1999 ; 19 : 103-15. 3. Allred DC, Swanson PE. Testing for erb-B2 by immunohistochemistry in breast cancer. Am J Clin Pathol 2000 ; 113 : 171-5 4. Hayes DF, Yamauchi H, Stearns V, Brotzman M, Isaacs C, Trock B. Should all breast cancers be tested for c-erb-B2. ASCO Educational Book 2000 : 257-65. CONCLUSION Malgré les difficultés de standardisation, l’immunohistochimie est la technique de référence pour déterminer le statut de HER2 dans les carcinomes mammaires (3, 12, 27-30). Il s’agit d’une méthode idéale pour le dépistage de masse des altérations de HER2. À la différence d’autres méthodes, elle est réalisable quelles que soient les conditions de fixation des tissus. Son optimisation passe par la mise au point d’une technique correcte et d’un apprentissage de l’interprétation des immunomarquages. Une fois acquis, ce savoir-faire doit être pérennisé par l’observation de règles de bonnes pratiques techniques : utilisation rigoureuse de témoins internes et externes et participation régulière à un programme d’évaluation externe de la qualité technique, notamment (31). La FISH est utilisée pour la détermination des cas 2+ (à condition qu’ils n’aient pas été fixés dans le liquide de Bouin), et pour l’étalonnage de la technique IHC (figure 2). 5. Ravdin PM. Should HER2 status be routinely measured for all breast cancer patients. Semin Oncol 1999 ; 26 (suppl. 12) : 117-23. 6. Pegram MD, Lipton A, Hayes DF, Weber BL, Basege JM, Tripathy D et al. Phase II study of receptor-enhanced chemosensitivity using recombinant humanized anti-p185 HER2/neu monoclonal antibody plus cisplatin in patients with HER2/neu-overexpressing metastatic breast cancer refractory to chemotherapy treatment. J Clin Oncol 1998 ; 16 : 2659-71. 7. Norton L, Slamon D, Leyland-Jones B, Wolter J, Fleming T, Eirmann W et al. Overall survival (OS) advantage to simultaneous chemotherapy plus the humanized anti-HER2 monoclonal antibody (Herceptin (H) in HER2 overexpressing (HER2) metastatic breast cancer (MBC). Proc ASCO 1999 ; 18 : 127a (abstr. 483). 8. Masood S, Bui MM. 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PAS DE TRAITEMENT A practical alternative for fluorescence in situ hybridization to detect HER2/neu oncogene amplification in archival breast cancer samples. Am J Pathol 2000 ; 157 : 1467-72. TRAITEMENT 2+ 10 - 20 % Absence d'amplification FISH Amplification 14. Penault-Llorca F, Jacquemier J, Le Doussal V, Voigt JJ et le GEFPICS. Le défi de la qualité en immunohistochimie : exemple du statut erb-B2 dans le cancer du sein. Ann Pathol 1999 ; 19 : 280-2. 15. Penault-Llorca F, Adelaide J, Houvenaeghel G, Hassoun J, Birnbaum D, Jacquemier J. Optimization of immunohistochemical detection of erb-B2 in human breast cancer : impact of fixation. J Pathol 1994 ; 173 : 65-75. 16. Jacobs TW, MC Gown AM et al. HER2/neu protein expression in breast Figure 2. Algorithme des modalités du test HER2 en France, actuellement. cancer evaluated by immunohistochemistry. A study of interlaboratory agreement. Am J Clin Pathol 2000 ; 113 : 251-8. 17. Jacobs TW, Gown AM, Yaziji H, Barnes MJ, Schnitt SJ. Specificity of Herceptest® in determining HER2/neu Status of breast cancers using FDA-approved scoring system. J Clin Oncol 1999 ; 17 (7) : 1983-7. Avec le développement des thérapeutiques ciblées par anticorps spécifiques, nous sommes probablement au début d'une longue série de molécules pour lesquelles nous aurons à définir des tests optimaux afin de sélectionner correctement les patientes pouvant en bénéficier. O La Lettre du Cancérologue - volume XI - n° 1 - janvier-février 2002 18. Roche PC, Ingle JN. Increased HER2 with US Food and Drug Administration-approved antibody. J Clin Oncol 1999 ; 17 : 434. 19. Lebeau A, Deimling D, Kaltz C et al. HER2/neu analysis in archival tissue samples of human breast cancer : comparison of immunohistochemistry and fluorescence in situ hybridization. J Clin Oncol 2001 ; 19 : 354-63. 31 C O N G R È S 20. Birner P, Oberhuber G, Stani J et al. Evaluation of the United States Food 26. Mass R. 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Fax : 01 56 43 62 63. e-mail : [email protected] le site internet : http ://www.afldcr.org Journées internationales de Biologie Du jeudi 14 au samedi 16 novembre 2002, au CNIT, Paris La Défense. Conférences et salon, de 9 h à 19 h. Renseignements : Syndicat des biologistes, 11, rue de Fleurus, 75006 Paris. Tél. : 01 53 63 85 00. Fax : 01 53 63 85 01. e-mail : [email protected]. le site internet : http ://www.sdbio.fr 32 Vivre avec la Polypose adénomateuse familiale Association pour la Prévention, le Traitement et l’Étude des Polyposes Familiales. Renseignements : APTEPF, 12, rue Pasteur, 93230 Villemomble Tél./Fax : 01 48 94 22 17. e-mails : [email protected] [email protected] le site internet : http ://aptepf.free.fr Transvaginal Surgery Mise à disposition des cassettes vidéo éditées à partir des démonstrations faites pendant les journées du Cercle Joseph Récamier. Renseignements : Evelyne Da Costa, pavillon L, hôpital E. Herriot, 69437 Lyon Cedex 03. La Lettre du Cancérologue - volume XI - n° 1 - janvier-février 2002