BIOSUF 2007-2010 Biogenesis of thiolated compounds
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BIOSUF 2007-2010 Biogenesis of thiolated compounds P1: S. Ollagnier de Choudens, M. Fontecave (coordinateur), C. Gerez, E. Mulliez, C. Tron, S. Wollers P2: F. Barras, B. Py, L. Loiseau, D. Vinella, S. Angelini, V. Trotter, R. Panel P3: E. Talla, C. Brochier P1: Laboratoire de Chimie et Biologie des Métaux, iRTSV, UMR-5249, CEA-Grenoble, 17 rue des Martyrs, 38054 Grenoble cedex 09, France P2: Laboratoire de Chimie Bactérienne, UPR CNRS 9043, IFR 88 Institut de Microbiologie de la Méditerranée, CNRS, Université de la Méditerranée Marseille, France P3: Laboratoire de Chimie Bactérienne, UPR CNRS 9043, IFR 88 Institut de Microbiologie de la Méditerranée, CNRS, Université de la Méditerranée/ de Provence, Marseille, France Contact: [email protected] Le soufre est un élément essentiel du vivant. De nombreuses molécules soufrées sont présentes dans les organismes vivants et y jouent des rôles essentiels. Il peut s’agir de : (i) composés inorganiques, en particulier les clusters fer-soufre qui confèrent aux protéines qui les complexent des propriétés chimiques remarquables et des fonctions biologiques importantes (transferts d’électrons, régulation de l’expression des gènes, catalyse rédox et non rédox) ; (ii) des composés organiques comme la biotine et l’acide lipoique, des cofacteurs essentiels, la thiamine, une vitamine, ou encore des nucléosides modifiés dans les ARNs de transfert. Le projet BIOSUF visait à comprendre d’un point de vue fondamental, en combinant des méthodes de génétique microbienne, de chimie de protéines et de bioinformatique, les propriétés mécanistiques, physiologiques et phylogénomiques des processus utilisés pour l’insertion d’atome de soufre dans les molécules biologiques. Ceci a été adressé au travers de l’étude 1- de la biosynthèse des centres Fe/S comme thème principal; 2- de la biosynthèse de composés organiques soufrés catalysée par les enzymes Radical-SAM. H2N O CH H2C C HS OH Cystéine UNN Le projet a été mené à travers l’étroite collaboration d’une équipe de chimie (P1) et d’une équipe de microbiologie et génétique microbienne (P2). Cette combinaison a permis de traiter de nombreuses questions par la combinaison complémentaire d’approches in vivo (génétique, mutagénèse, physiologie microbienne, étude de phénotypes, étude d’interactions in cellulo…) et in vitro (chimie des protéines : structure et réactivité, spectroscopies diverses en particulier magnétiques et nucléaires). La possibilité de confronter les observations cellulaires avec les résultats moléculaires est l’une des richesses de ce projet. Une troisième équipe (P3) a apporté des compétences très utiles en bioinformatique, permettant de mieux comprendre, par des approches de phylogénomique, l’évolution de ces machineries qui semblent être parmi les plus anciennes et les mieux conservées du monde vivant. Dans le domaine de la biosynthèse des centres Fe/S, nos travaux sur la machinerie SUF ont conduit à: - L’identification de la fonction de la protéine SufB (protéine d’assemblage des clusters) et de la protéine SufA (protéine de transport des clusters) - La découverte d’un cofacteur flavinique dans le complexe SufBCD. - La mise en évidence de nouveaux acteurs dans la biosynthèse des Fe/S, aussi bien pour les processus de transport de soufre (CsdAE) que de transport de clusters (ErpA, NfuA). - La mise en évidence par des approches phylogénomiques et génétiques de la diversité et de l’importance des protéines de transport des clusters (protéines de type-A), comme mécanisme d’adaptation aux conditions de croissance cellulaire. - La démonstration que le régulateur de transcription IscR, responsable du contrôle de l’expression des machineries de biosynthèse des clusters fer-soufre SUF et ISC, constituait un acteur majeur de l’adaptation de certaines bactéries pathogènes aux conditions agressives de son environnement. - La démonstration que les machineries de biosynthèse des centres fer-soufre peuvent être des cibles fragiles lors de l’exposition des cellules à des métaux toxiques tel que le cobalt. sufA sufB sufC sufD sufS -L’insertion d’atomes de soufre dans des composés organiques a été étudiée dans le cas des ARNs de transfert (à travers l’étude de la methylthiotransférase MiaB) ou des protéines (à travers l’étude de la sulfuration de la protéine ribosomale S12 catalysée par la méthylthiotransférase RimO). Le résultat le plus notable a été la découverte de la première tRNA methylthiotransférase de mammifère, MtaB, un homologue de la protéine MiaB et l’obtention de la première structure d’une méthylthiotransférase Rimo. Le résultat le plus notable a été la découverte de la première tRNA methylthiotransférase de Mammifères, MtaB, un homologue de la protéine MiaB et l’obtention de la première structure d’une méthylthiotransférase Rimo. sufE «S» «S» «S» Ribbon view of MiaB T. maritima Model Surface view of MiaB T. maritima Model Surface view of truncated Apo RimO structure (2.0 Å) Ribbon view of truncated Apo RimO structure (2.0 Å) Transfert direct Non identifiées Aconitase NuoG Impact dans le domaine de la Biosynthèse des cofacteurs soufrés: 5 publications IspG/ IspH Cibles Escherichia coli possède 3 cystéines désulfurases capables de transformer la L-cystéine en alanine et en sulfure : IscS, SufS et CsdA. Nous avons étudié le rôle, encore inconnu, de CsdA par des approches génétiques et biochimiques. Nous avons montré que CsdA est impliquée dans la biosynthèse des centres Fe/S en recrutant spécifiquement SufBCD comme “scaffold” et non IscU. De plus, nous avons montré que CsdA interagit avec CsdE (en opéron avec CsdA) et est capable de lui transférer des atomes de soufre via des réactions de transpersulfuration. Par la technique de TAP-Tag et de double hydride, un nouveau partenaire de CsdA et CsdE a été identifié: CsdL. Il appartient à la classe des protéines E1-like (ou ubiquitin-activating like protéines) qui fixent l’ATP et activent des protéines cibles par adénylation de leur C-terminal pour l’insertion d’atome de soufre. Nous proposons ainsi que CsdA soit engagée dans deux voies métaboliques “soufrées”: (1) la biogénèse des Fe/S impliquant CsdA et SufBCDE ; (2) la biosynthèse d’un cofacteur soufré impliquant CsdA et CsdL. La perte de ce composé soufré, encore non identifié, est cruciale pour la survie de la bactérie en phase stationnaire de croissance. SufE L-cystéine FeS SufBCD CsdA (CsdE) CsdL X-S Fitness Impact dans le domaine de la Biosynthèse des Fe/S : 12 publications; Congrès: 8; Conférences/séminaires invités: 23 Le projet BIOSUF a permis de mieux comprendre certains aspects du métabolisme du soufre, encore peu compris et considéré comme un véritable défi, du à la chimie complexe du soufre qui peut exister dans différents états rédox, certains d’entre eux étant très réactifs. L’ensemble de nos travaux pose de nouvelles questions importantes que nous nous proposons de traiter dans un nouveau projet ANR déposé à l’appel d’offre 2011. Nous nous proposons de traiter (i) lien entre le métabolisme des flavines et l’assemblage des centres fer-soufre; (ii) la recherche de nouveaux acteurs; (iii) l’identification du composé soufré produit par la voie métabolique dépendante de CsdL. 166
