1. Protéines CAHIER D`EXERCICES de BIOCHIMIE

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PCEM1
1. Protéines
CAHIER D'EXERCICES
de BIOCHIMIE
2009-2010
EDITE PAR LE DEPARTEMENT DE BIOLOGIE

Cahier d'Exercices en Biochimie / PCEM1 Protéine / 2
Faculté de Médecine Pierre & Marie Curie
CAHIER D'EXERCICES POUR PCEM1
BIOCHIMIE
I . P R O T E I N E S
SOMMAIRE
Page
1. Techniques d'étude des protéines ........ 3
2. Structure des protéines .................. 7
3. Fonction des protéines ..…............ 12
4. Enzymologie ............................ 14
4.1 Généralités .......................... 14
4.2 Enzyme Michaëlien ................... 15
4.3 Enzyme Allostérique ................… 17
5. Problèmes de révision ....……......... 17
6. Annales du concours : QCM et QROC …. 21
Image de couverture :
Structure d'un cristal de BRCA2, une protéine déficiente dans des formes héréditaires de
cancer du sein (Science-13sep2002 : www.sciencemag.org)

Cahier d'Exercices en Biochimie / PCEM1 Protéine / 3
Faculté de Médecine Pierre & Marie Curie
1. TECHNIQUES D’ETUDE DES PROTEINES
1.1
PM
( kDa )
Ve
( ml )
bleu dextran*
1000
80
uréase
500
90
aldolase
150
115
sérum albumine
65
150
ovalbumine
45
170
chymotrypsinogène
25
190
En chromatographiant des protéines de poids
moléculaires connus sur une colonne de gel
filtration, on peut déterminer leur volume
d’élution (Ve) et tracer une courbe
d’étalonnage qui permet d’évaluer le poids
moléculaire d’une protéine inconnue.
Les données ci-contre sont utilisées pour
tracer la courbe d’étalonnage ci-dessous.
(* le bleu dextran est un polymère de haut PM)
lysozyme
14
200
Une protéine X, chromatographiée dans les mêmes conditions expérimentales, est éluée à un
volume d’élution de 130 ml.
a- Justifier l’ordre d’élution des protéines de PM connus.
b- Evaluer le PM de la protéine X.
Cette protéine X est ensuite analysée par électrophorèse SDS-PAGE, et on détecte une seule
bande correspondant à un PM apparent de 25 kDa.
Après traitement de la protéine X par un excès de β-mercaptoéthanol, la même analyse par
électrophorèse ne donne toujours qu’une seule bande à 25 kDa.
c- Sur quel principe est basée la détermination du PM apparent mesuré par
électrophorèse SDS-PAGE? En quoi diffère-t-il de la chromatographie par gel
filtration ?
d- Que peut-on dire des ponts disulfures de la protéine X ?
e- Proposer une structure schématique pour la protéine X
1.2 a. Dans le but de collecter les protéines du cytosol, un homogénat cellulaire de cerveau de
souris est soumis à des centrifugations de vitesse croissante :
- 1ere centrifugation : 1000g pendant 10 minutes.
- 2ème centrifugation : 20000g pendant 20 minutes.
- 3ème centrifugation : 80000g pendant 1 heure.
- 4ème centrifugation de 150000g pendant 3 heures.
Parmi les différents culots et surnageants obtenus, indiquer celui qui ne contient que
les protéines du cytosol ?
20
30
50
70
200
300
500
700
Volume d’élution
PM
(kDa)

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b.Les protéines sont extraites de cette fraction cytosolique et soumises à une
chromatographie d’affinité qui permet de purifier une protéine.
- Une chromatographie de filtration sur gel de la protéine purifiée indique la présence
d’une protéine majoritaire d’une masse moléculaire d’environ 100 000 daltons.
- La protéine purifiée est ensuite analysée par électrophorèse SDS-PAGE. On détecte deux
bandes majoritaires de 75 000 et 25 000 daltons.
- La même analyse est réalisée sur un deuxième échantillon de la fraction purifiée
préalablement traitée par le β-mercaptoéthanol. On détecte alors deux bandes de
50 000 et 25 000 daltons.
Que peut-on déduire de ces données quant à la structure de la protéine purifiée ?
1.3 Expliquer et commenter ces affirmations.
a. La solubilité minimale d’une protéine est atteinte à son point isoélectrique (pHi).
b. Pour une valeur de pH supérieure à son pHi, une protéine porte toujours une
chargée négative et pour une valeur de pH inférieure à son pHi, une protéine porte
toujours une charge positive.
c. L’ajout d’une quantité importante de sulfate d’ammonium entraîne la précipitation de
nombreuses protéines.
1.4 Une solution contenant de l’albumine (pHi= 4,6), de la β-lactoglobuline (pHi = 5,2) et du
chymotrypsinogène (pHi= 9,5) est chargée sur une colonne de DEAE cellulose à pH 5,4. (Le
DEAE est une molécule chargée positivement)
La colonne est éluée par un gradient de NaCl de concentration croissante.
• Proposer un ordre d’élution de la colonne pour ces protéines.
1.5 Soit une protéine (A) oligomérique d’un poids moléculaire (PM) de 240 000 Daltons. Sa
structure quaternaire est étudiée par la détermination des poids moléculaires à l’issue de
divers traitements:
a. Traitement par le β-mercaptoéthanol 0,1M : donne uniquement des structures
protéiques d’un PM de 120 000 Da.
b. Traitement par l’urée 4M : donne uniquement des structures protéiques d’un PM de
80 000 Da.
c. Traitement par le β-mercaptoéthanol 0,1M et l’urée 4M : donne uniquement des
structures protéiques d’un PM de 40 000 Da.
• Quels sont les effets de ces différents traitements ?
• Ces résultats ont-ils été obtenus par gel-filtration ou SDS-PAGE ?
• Proposer un volume d’élution en gel filtration sur la colonne de l’exercice 1.1 de
la protéine (A) dans un tampon 0.1M β-mercaptoéthanol.
• Proposer un schéma de migration de la protéine (A) en SDS-PAGE.
• Quelle est la structure quaternaire de cette protéine ?
1.6 Influence du pH sur la conformation d’un peptide.
Le squelette peptidique est flexible. Il se replie de manière adéquate pour associer les résidus
chargés par des liaisons ioniques (dans cet exemple).
Ce peptide possède des conformations variables en fonction du pH.
A l’aide des valeurs de pKa des acides aminés données ci-dessous, attribuer aux pH suivants : pH
2, pH 5,5 pH 7, pH 11 et pH 13 une des conformations proposées pour le peptide étudié.

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B
C
D
E
A
1.7 On se propose de purifier, à partir de sérum humain, la protéine de transport
plasmatique des hormones sexuelles, dénommée TEBG (testosterone estradiol binding
globulin) » ou encore SBP (sex steroid binding protein).
La TEBG présente la propriété de lier de façon non covalente et avec une forte affinité la
testostérone et l’estradiol. Cette propriété est mise à profit pour suivre les différentes
étapes de la purification de la TEBG : après incubation du sérum avec de la testostérone
radioactive qui joue le rôle de traceur, on suit le complexe TEBG-testostérone radioactive
en mesurant la radioactivité.
Ces étapes sont résumées ci-dessous :
a. Traitement du sérum par du sulfate d’ammonium à 50% de saturation et
centrifugation.
a.1 Quel est l’intérêt de ce traitement ?
a.2 La radioactivité est mesurée dans le culot et dans le surnageant et on constate que
seul le culot est radioactif : sur laquelle des fractions (culot ou surnageant) faut-il
poursuivre la purification ?
b. La fraction choisie en (a.2) est dialysée contre du tampon phosphate 20 mM, pH 6, NaCl
50 mM.
Quel est l’intérêt de cette étape de dialyse à ce stade de la purification ?
c. La solution obtenue en (b) est chromatographiée sur une résine échangeuse d’anions ;
diverses protéines, dont une fraction radioactive, sont éluées par diminution
progressive du pH jusqu’à 5.
c.1 Sur quelle propriété des protéines est basée la chromatographie sur résine
échangeuse d’ions ?
c.2 Que peut-on dire du pHi de la TEBG ?
d. La fraction radioactive isolées en (c) est déposée sur une colonne de chromatographie
par gel filtration (Sephadex G100) et éluée par un tampon phosphate 20 mM, NaCl 150
mM, pH 7. Le profil d’élution est représenté sur le schéma ci-dessous (DO = densité
optique). La colonne de Sephadex G100 a été préalablement calibrée avec 4 protéines
de masses moléculaires connues dont les volumes d’élution respectifs sont indiqués sur
ce même schéma (flèches).
AA
pKa
chaîne extrémité
latérale terminale
Asp
3,9
Glu
4,1
His
6,0
Lys
10,5
Arg
11,5
C-terminal
4,2
N-terminal
10,6