EBV et HHV8

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EBV et HHV8 en transplantation d’organe
adulte et pédiatrique
Martine Raphaël
DIU de Transplantation
Lyon Mai 2009
EBV et HHV8 : virus oncogènes
EBV
Facteur déterminant dans le développement d ’un syndrome
lymphoprolifératif après transplantation
Dépend du statut sérologique du couple donneur/receveur
Receveur négatif d ’un donneur séro positif pour EBV
Population pédiatrique : risque atteint 30%
Heo JS, Transplant Proc, 2004
HHV8
Virus associé au sarcome de Kaposi
identifié dans
les lymphomes primitifs des cavités
la maladie de Castleman liée au VIH et souvent associée
au sarcome de Kaposi et aux lymphomes plasmoblastiques
EBV
• 1964 : LNH Burkitt : découverte : Epstein, Achong et Barr
• 1968 : Agent de la mononucléose infectieuse : Henle
• 1970 : Carcinome du Naso pharynx : Zur Hausen
• 1980s : lymphomes des déficits immunitaires
Hodgkin
Lymphomes T
EBV et lymphomes
• < 5% des LNH de l’immunocompétent
• 10 - 85% des lymphomes de Burkitt
• 20 - 80% du lymphome de Hodgkin
• 60 - 100% des lymphomes des déficits
immunitaires
• 5 - 100% des LNH T
EBV : structure et génome
• Human Herpes virus 4
Herpesviridae,
Lymphocryptovirus
Group C
120 à 200 nm
Double strand DNA 186k bp
From LS Young, A. Rickinson
Nature Review 2004
TR orip
U1
IR1
IR2
U2
orilyt IR4
IR3
orilyt
U3
U4
U5
TR
EBV et latence
EBV
proteines de Latence
CD21
HLA II
Lymphocyte B
EBNA2
EBNALP
EBNA2
EBNA1
EBNALP
EBNA2
EBNA3A
EBNA3B
EBNA3C
LMP1
LMP2A
LMP2B
EBER1, 2
Lignée lymphoblastoide : latence III
Programme de prolifération
EBV
protéines de latence, fonctions principales
les différents types de latence
Protéines
EBERS
EBNA1
EBNA2
EBNA 3A
EBNA3B
EBNA3C
EBNA LP
LMP1
LMP2A
LMP2B
0
+/ARN
ARN
-
Latences
I
II
+
+
+
+
+
+
+
fonctions
III
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
réponse IFN, anti apoptotique
persistance génome
transcription, lien RBP-Jk
transcription, lien RBP-Jk
transcription
activation cycle cellulaire
coopération EBNA2, cycle
activation, NFkB, STAT1, ..
bloquage: BCR, réactivation
?
Cellules B mémoire, BL, Hodgkin, LCL, MNI, LP des immunodéprimés
Lymphoprolifération induite par l ’EBV et déficit immunitaire
Latence : I, II, III
B mémoire
Latence II
Expansion clonale
B centre
germinatif
Différenciation plasmocytaire
et cycle productif
réactivation
Latence III
B naïve
EBV
Latence de l’EBV et cycle Lytique
EBNA1
LMP1
I
LMP1, EBNA2
II
III
LMP1
cycle lytique
ZEBRA
EBER
ZEBRA
Early protein : EA
Replication du DNA viral
VCA
EA
BCRF1
VCA
EBNA2
EBV et propriétés oncogéniques
• Latence
Type de latence et rôle de l ’EBV
Interactions entre les protéines de latence de l ’EBV
et la machinerie cellulaire : signalisation, transcription
• Rôle de la réplication?
Cycle productif et production de virions?
• Rôle de ZEBRA : rupture de la latence
Cycle abortif ?
EBV, lymphoproliférations B et déficit
immunitaire
Déficit immunitaire
LPPT
EBV
Lymphoproliférations B
Dérégulation du cycle cellulaire
inhibition de l ’apoptose
Inhibiteurs/
Activateurs
du cycle cellulaire
Signalisation
Transcription
CD18
LMP1
LMP2A
LMP2B
HLAII
BCL2
CD11a CD54
EBNA2
EBNA3C
EBNA1
Anomalies
géniques
CD23
CD44
CD40
CD39
CD21
x10 à200
EBV, transformation cellulaire et oncogénèse
EBNA2 et voie de signalisation NOTCH
Structure d ’EBNA-2 A
NLS
Pro
diversité
Dim
RBP-J Arg-Gly
TAD
S1 S2 S3
Structure de Notch
RBP-J liaison
RAM
Peptide signal
EGF-like répétition
N-extra cellulaire
•
•
•
LN
répetition
NLS
TM
Ankyrine
répétition
NLS
PEST
N-intra cellulaire
Activation par les ligands delta like 1 et 3, delta 4, jagged 1 et 2. Clivage S2 et S3
Translocation dans le noyau de N-IC et liaison avec RBP-J (Su (H) de la drosophile)
EBNA-2 : homologue viral fonctionnel de Notch activé (N-IC) mais indépendant des
ligands
EBNA2 aboli la répression médiée par RBP-Jκ par compétition
avec le complexe corepresseur
SIN3A
Répression
HDAC1/2
SMRT
SAP30
SKIP
CIR
RBP-jκ
EBNA2
x Off
SIN3A
SMRT
GTGGGAA
HDAC1/2
SAP30
CIR
Activation
EBNA3A
EBNA3B
EBNA3C
From EPSTEIN–BARR VIRUS: 40 YEARS ON
LS Young, A B. Rickinson, NATURE REVIEWS | CANCER, 2004
SKIP
EBNA2
RBP-jκ
GTGGGAA
EBNA-LP
BTM
ON
EBV, transformation cellulaire et oncogénèse
EBV et lymphomes, LMP1
• La structure de la molécule confère une fonction de récepteur constitutivement
activé : extremité NH2 et partie transmembranaire , agrégation et oligomérisation,
identification d ’une partie de LMP1 dans les rafts membranaires.
• Extremité C terminale et transduction du signal :
CTAR1/TES1 et recrutement des facteurs associés au TNF-R, (TRAF1,2,3,5)
CTAR2/TES2 et association avec TRADD et RIP (signalisation TNF-RI),
mais pas de death domaine sur LMP1
EBV, transformation cellulaire et oncogenèse
EBV et lymphomes, rôle de LMP1dans la
transformation cellulaire
• Wang D
(Cell 1985), expression de LMP1 et transformation de
fibroblastes de rat
• LMP1 : initiation et maintien de la prolifération
fonctions de LMP1 impliquées dans la transformation cellulaire
- Inhibition de l ’apoptose :
surexpression de BCL-2, MCL-1, BFL-1, A20 et c-IAPs
- Dérégulation de l ’expression cytokinique :
IL-8, IL-6, IL-10, métalloprotéïnase
- Interactions avec les voies de signalisation cellulaire
NF κB
JAK-STAT1
MAPK - ERK
JNK
Deux voies d’activation de NF-κB par LMP-1
LMP1 mime la signalisation CD40-CD40 ligand
Rafts
Membrane
N
N N
CTAR1
20 - 30%
TRAF1
TRAF2
TRAF3
Non canonique
NIK
IKKα
CTAR3
IκB
CTAR2 TRADDTRAF2
70 - 80% C
CC
Canonique
P10O
IKKβ
NEMO
From N. Faumont, 2005
P100
RelB
IKKα
P65/RelA
P50
IκB
noyau
NIK
P65
P50
P52
RelB
NF-κB
EBV, transformation cellulaire et oncogenese
LMP1 and NF κB
PCNSL
Infection EBV et diminution de l’expression de Bim
Bim : membre de la famille BCL2 pro-apototique, 1 seul domaine BH3
joue un rôle central dans l ’homéostasie lymphocytaire
• Activation constitutive de ERK1/2 par EBV
Phosphorylation de l ’isoforme BimEL par ERK1/2
Dégradation de l ’isoforme phosphorylé par par le protéasome
Résistance à l ’apoptose et
Contribution au potentiel oncogénique
de l ’EBV
D ’après C Clybouw, A Vasquez et al J Immunol 175 : 2968, 2005
• Répression de l ’expression de Bim au niveau transcriptionnel :
Rôle de la coopération des protéines nucléaires de l ’EBV
EBNA3A et EBNA3C
MJ Allday, BL meeting, Kampala Février 2008
EBV mime et interagit avec les voies de
signalisation et d’activation cellulaires et
« re-programme » les lymphocytes B
SURVIE DU VIRUS ET SURVIE CELLULAIRE
EBV and cell programmation
CD40L
LMP1
CD40
TRAFF
LMP2a : antigen B-cell receptor BCR
LMP1 : TNFrecepteur, CD40-CD40L
EBNA2 : facteur transcriptionnel
Notch
Ag
BCR
syk
lyn
NF-kB
STAT1
notchIC
RBP-Jk
B lymphocyte
LMP2A
syk
lyn
TRAFF
NF-kB EBNA2
STAT1 RBP-Jk
B lymphocyte
infected by EBV
Interactions moléculaires entre les protéines de l’EBV et
la machinerie cellulaire : survie et prolifération
IL-6
IL-10R
LMP1
IL-6R
IL-10
IL-10R
IL-6R
STAT
PI3K
STAT
PI3K
P38SAPK
Phosphorylation Rb
STAT
PKB
Cycline D1
NFkB
Cdk4/6
Bfl-1
bcl-2
A20 ….
EBNA-2
EBNA-LP
p27kip1
G1
S
EBNA-3C
SURVIE
PROLIFERATION
D ’après P. BRENNAN, 2001
Profil d ’expression génique des PTLD EBV+ et EBV• 8 cas de PTLD monomorphe (4 EBV-, 4 EBV +)
Affymetrix HU133A GeneChips
Clustering hiérarchique
• Comparaison entre les PTLD EBV + et EBV54 transcripts surexprimés : PTLD EBV+, dont :
IRF7, EBI2 (Epstein Barr induced gene),
MX1, IFITM1, IFITM3 (gènes induits par l ’IFN)
232 transcrits sous exprimés
• Profil comparable à ceux des lignées précédemment
décrites (F Baran-Marszak,
• Modification du profil d ’expression génique en lien
avec l ’EBV
Craig et al, Pittsburgh
Diagn Mol Pathol, 2007
Réplication de l ’EBV et prolifération cellulaire
• Détection de la phase lytique de l ’EBV dans les lymphomes
des déficits immunitaires liés à l ’EBV : BZLF, BLRF1
• Rôle des protéines virales du cycle lytique :
vIL10 : homologie avec l’IL10 hu
• EBV mutant, délété pour BZLF1 et absence de développement
d ’une lymphoprolifération chez la souris SCID
• Induction de facteurs cellulaires jouant un rôle dans
la prolifération et phénomène de paracrinie
IL10, IL6, facteur angiogénique (vascular endothelium growth factor)
LCL Z-KO : diminution de ces facteurs
• Interactions entre TGFβ et ZEBRA
EBV, lymphomes, transformation cellulaire
et oncogénèse
• Interaction persistante entre le virus et l ’hôte
• Paradoxe apparent
EBV transforme les lymphocytes quiescents in vitro
Infection persistante et asymptomatique in vivo
• Deux explications
importance du contrôle du système immunitaire de
l ’hôte
Interaction entre l ’EBV et la machinerie cellulaire
co-régulation de l ’expression des gènes
cellulaires et viraux
• Prolifération et silence immunologique
PROLIFERATIONS LYMPHOIDES APRES
TRANSPLANTATION (PTLD)
• Conséquence de l ’immunosuppression
• Incidence globale : 2% des patients transplantés
• Variation (<1% - 5%) selon le traitement immunosuppresseur et
l ’organe greffé, risque estimé : x20 : rein, x120 : coeur
• Diversité des proliférations
Proliférations précoces très souvent liées à l ’EBV
Proliférations tardives associées ou non à l ’EBV
Intervalle différent selon la présence de l ’EBV
EBV
délai moyen
+
6 - 10 mois
4 - 5 ans
Large prédominance des proliférations B
Origine : receveur (>90%),
donneur (<10%) (foie, poumon) infiltration préférentielle du greffon
High levels of Epstein-Barr virus DNA in blood of solid-organ
transplant recipients and their value in predicting post transplant
lymphoproliferative disorders.
Copy of EBV genome
per 0,5μg of PBMC DNA
1000000
100000
10000
1000
100
10
26
59
1
Immunocompetent
asymptomatic
Transplanted
patients
Transplanted
patients
with EBV
associated
pathology
J Clin Microbiol 38 : 613-9, 2000
PTLD : catégories histopathologiques
• Lésions précoces
Hyperplasie plasmocytaire
Lésions de type mononucléose infectieuse
• PTLD polymorphe ou type Hodgkin like
• PTLD monomorphe
- Proliférations B
Lymphome B diffus à grandes cellules
Burkitt/Burkitt atypique (like)
Myélome
prolifération de type plasmocytome
- Proliférations T
lymphome T périphérique
• Lymphome Hodgkinien classique
NL Harris, S H Swerdlow, G Frizzera, DM Knowles, OMS 2008.
PTLD : Lésions précoces
• Plus fréquemment observées dans la population pédiatrique
• Fréquence des PTLD après greffe hépatique
chez l ’enfant : 2 -5 %
• Hyperplasie plasmocytaire
Hyperplasie réactionnelle plutôt que PTLD
Localisation préférentielle : sphère ORL
Polyclonale, EBV +/-
• Lésion de type mononucléose infectieuse
EBV toujours présent, primo-infection EBV
Latence III de l ’EBV, programme de prolifération
Réarrangement des gènes des Ig : clones minoritaires
Avantage prolifératif de clones cellulaires
PTLD Polymorphe
• Destruction de l ’architecture et nécrose
• Prolifération lymphoïde polymorphe diffuse composée de
cellules lymphoïdes de tailles et de formes variées allant des
lymphocytes aux immunoblastes et cellules plasmocytaires
Présence de cellules cellules atypiques
• Peut régresser après diminution du traitement IS
• EBV+, latence II : LMP1+, EBNA2- ou III : LMP1+, EBNA2+
• Quelques zones sont monomorphes
• Polyclonal, oligoclonal, monoclonal : Immunoglobulines ou
EBV
• Quelques anomalies génétiques
PTLD Polymorphe
Localisation pulmonaire
Aspect très polymorphe
et spectre morphologique
EBV présent dans pratiquement
toutes les cellules
PTLD Monomorphe : B et T
Lymphome B diffus à grandes cellules
Centroblastique, immunoblastique avec differenciation
plasmocytaire
EBV+ ou EBVAnomalies génétiques
Lymphome de Burkitt
classique ou variants morphologiques (Burkitt atypique)
EBV+ or EBVc-MYC and anomalies génétiques additionnelles
Myelome ou plasmacytome
EBV + ou EBVLymphome T périphérique
α/β ou γ/δ
EBV + ou EBV-
PTLD
Monomorphe, pléomorphique
Enrichissement en grandes cellules
Monomorphe immunoblastique
PTLD Hodgkin et Hodgkin like
Hodgkin like PTLD
EBV+, EBER
Marqueurs et histogénèse des lymphomes
Cellules B Pré- centre
germinatif
BCL6-/CD138-
Cellule centre
germinatif
BCL6+/CD138-
Burkitt
Différenciation B
terminale
MUM1/IRF4 BCL 6-/CD138+
centroblastique
Immunoblastique
avec diff.
plasmacytaire
Histogenèse Moléculaire des PTLD
Expression de BCL6, IRF4/MUM1, CD138 : 25 PTLD
Morphologie, EBV
M Bemba, V Leblond, M Raphaël
BCL-6 and CD138 are selectivement exprimés
BCL-6 + : monomorphe, EBVCD138+ : polymorphe, Immunoblastique, EBV+, LMP1+
SHM, BCL6, IRF4/MUM1, CD138 : 52 PTLD
D. Capello, A Carbone, G. Gaidano
ongoing SHM, BCL6+, IRF4/MUM1+/-, CD138-, LMP1SHM, BCL6-, IRF4/MUM1+, CD138-, LMP1+/SHM, BCL6-, IRF4/MUM1+, CD138+, LMP1+
Crippling mutations
SHM avec mutations ‘ ongoing ’
PTLD
Mutations anormales
EBV
SHM sans mutations ‘ ongoing ’
CG
Survie
Post CG
Découverte de HHV8
• Particules virales de type Herpes ayant une antigénicité
croisée avec EBV et CMV dans les lignées cellulaires
établies à partir de KS africains (1970)
• Recherche d ’un agent infectieux préférentiellement
transmis par voie sexuelle dans les KS des patients VIH+
• Technique de biologie moléculaire RDA entre tissu sain et
tissu lésé (representational difference analysis)
--> identification d ’une séquence type Herpes de 1800 pb
(homologie avec l ’EBV et le virus saimiri), 1994
Organisation schématique du génome de
HHV8
v-MIP-II
v-IL6 v-MIP-I
v-Bcl2
v-IRF
v-cyc D
Région unique
Régions conservées entre les gamma Herpes virus
81 Open Reading Frames
Nombreux gènes piratés de l ’ADN cellulaire des cellules eucaryotes
Mêmes cascades de signalisation utilisées par HHV8 et EBV pour
leur survie.
Caractérisation de HHV8
• Gamma 2 Herpes virus
• Génome de 170 kb comprenant 81 gènes
• Homologies avec des gènes cellulaires (gènes piratés)
–
–
–
–
–
–
Cycline D
v-Cycline : non inhibée par p16 et p21
IL-6
v-IL-6 (cytokine, prolifération B)
Bcl2
v-Bcl2, v-FLIP (anti apoptotiques)
Interféron γ
v-IRF (potentiel oncogénique)
GPCR
v-GPCR (potentiel oncogénique)
Récepteurs au chemokines v-MIP-1, v-MIPII, liaison avec les
récepteurs CXC et signalisation
– Récepteur à l ’IL-8 (récepteur couplé à la protéine G)
• Mécanismes d ’autocrinie
– IL6/IL6R IL10/IL10R
– VEGF/VPF/Récepteur Flt-1
– NGF/NGFR
HHV8 et pathologie
• HHV8 et cancer
Toutes les formes épidémiologiques de
sarcome de Kaposi
Le lymphomes primitif des séreuses
• HHV8
Maladie de Castleman
Lymphome plasmoblastique
HHV8 : localisation et latence
• Localisation dans les cellules
–
–
–
–
–
endothéliales
monocytaires/macrophagiques
cellules dendritiques
lymphocytes B
lymphocytes T
• Phase de latence dans les proliférations lymphoïdes
- Expression de LANA (Latency Associated Nuclear Antigen)
- Détection de LANA : sérologie anti-LANA et PCR
Etudes épidémiologiques
- LANA inhibe p53
- Interaction entre LANA et c-IL-6
• Réplication dans une minorité de cellules infectées
HHV8 et pathologies post transplantation
• Pathologies
- Maladie de Castleman et proliferations plasmoblastiques
- Lymphome primitif des séreuses
- Sarcome de Kaposi
• Séroprevalence de HHV8 : dépend des zones géographiques
• Incidence du sarcome de Kaposi chez les patients transplantés varie selon
les zones géographiques, le type de greffe, les traitements IS et la sérologie
HHV8+ pré-greffe
• Co-infection des cellules cellules B par EBV et HHV8
• Rôle dans les mécanismes de lymphomagenèse des proteïnes codées
par les gènes de HHV8 et interactions avec des gènes cellulaires
BCL-2, IL-6, Cycline D, protéïne G (G protein coupled receptor)
IRF (Interferon regulatory factor)
Lymphome primitif des séreuses
• Localisations primitives au niveau des séreuses
plèvre, péricarde, péritoine
• Tumeur solide
• Association constante avec HHV8
• Association avec EBV : 80- 90%, LMP1• Taux élévés de cytokines IL6 et IL10 dans les épanchements
• Grandes cellules intermédiaires entre des immunoblastes et
des cellules anaplasiques
• Cellules B : CD45+, CD19-, 20-, 79a-, sIg-, cIg-, CD138+
gènes des IG : mutés et réarrangés
• Cellules activées : CD30+, CD38+
• c-MYC : non réarrangé
Post-transplant lymphoproliferative disorders
(PTLD): EBV not always to blame
Timothy Fenske, MD
Heme/Onc/BMT grand rounds
March 7, 2003
Dérégulation immunitaire
– Déficit de l’immunité à médiation cellulaire ⇒ diminution des
capacités d’immunosurveillance et de défense antitumorale.
– Activation polyclonale des lymphocytes B par des
stimulations antigéniques chroniques : polyadénopathies,
expansion des centres germinatifs,
hypergammaglobulinémie polyclonale.
– Dérégulation de la production de cytokines (IL6, IL9,
IL10…)
EBV et HHV8 ne sont pas seuls
Anomalies Génétiques
Instabilité chromosomique
Instabilité des microsatellites
Hypermutations somatiques aberrantes
Dans centres germinatifs des ganglions de patients
sains : hypermutations des gènes d’Ig.
Dans la lymphomagénèse : hypermutations aberrantes
des oncogènes : PAX5, RHO/TTF, PIM1, c-MYC
Genomic imbalances detected by CGH in 35 PTLD
18/35 (51.4%) of cases with CGH imbalances
gains / losses : 1.6/1
H A Poirel, Transplantation 2005
Interphase FISH with a YAC including bcl2 locus on nuclei (case n° 27)
YAC BCL2
H A Poirel Transplantation 2005
PTLD
EBV+ (90%)
Latency III
Proliferative
advantage
polyclonal
dim(17q) *
Mean number of CGH
imbalances
0.3
Regression
+/-
EBV-
Latency I
bcl6, H-ras
c-myc enh(8q)
p53 dim(17p)
dim(Xp) *
enh(18q) bcl2
enh(2p)
enh(5p)
enh(9q)
enh(12q)
enh(17q)
dim(17q) *
enh(8q) c-myc
dim(17p) p53 ?
enh(3q) *
dim(4q)
enh(18q) ampl(bcl2)
enh(2p)
enh(5p)
enh(9q)
enh(11) *
enh(12q)
enh(14q) *
enh(17q)
1.2
2.8
Autonomous proliferation
A
5’
3’
G
T
A A A A
T T T T
C A C A C A C A C A
G T G T G T G T G T
3’
5’
GT
hMSH2
hMSH2
hMSH6
hMLH1
hMLH1
hMLH3
hPMS2
5’
3’
hMSH2
hMSH3
A
T
A A A A
T T T T
hMSH3
hMLH1
hPMS2
C A C A C A C A C A
G T G T G T G T G T
The Mismatch Repair System in human
(from Jiricny et al., Current Opinion in Genetics and Development, 2000 )
3’
5’
PTLD et instabilités des microsatellites MSI-H
• Anomalies génétiques spécifiques des lymphomes
des déficits immunitaires : 10% des PTLD
• PTLD tardives, survenant plus de 5 ans après la greffe,
préférentiellement de nature T, associée ou non à l ’EBV
mais plus fréquemment EBV-.
• Les gènes cibles altérés semblent spécifiques et différents de
ceux des autres cancers MSI-H (RAD50, Bax, Caspase-5…)
• Les altérations des mécanismes de réparations de l ’ADN
impliqués ne sont pas homogènes et ne répondent pas aux
mêmes altérations que celles des autres cancers MSI-H
A Duval, PNAS, 2004
Allogreffe
Traitement IS
STIMULATION ANTIGENIQUE
CHRONIQUE
DEFICIT IMMUNITAIRE
EBV
HHV8
MSI
LOH
LYMPHOMAGENESE
INSTABILITE
GENETIQUE
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