Partie 1. Protéomique - Collège Lionel

Collège Lionel-Groulx Évolution et diversité du vivant 101-NYA-05
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Lab 7. Phylogénie
Première partie : Protéomique
1. OBJECTIFS
1.1. Effectuer une analyse de protéines afin d’établir un rapprochement évolutif des espèces animales.
1.2. Se familiariser avec une technique moderne utilisée en protéomique : l’électrophorèse verticale sur gel de
polyacrylamide («SDS PAGE»)
2. PRÉPARATION AU LABO
Lire le protocole; attention particulière à la section 5.1 «Manipulations»
3. SÉCURITÉ AU LABORATOIRE
 Port du sarrau obligatoire.
 Nettoyer le plan de travail et les mains avant et après le laboratoire.
 Comme toujours, il est interdit de manger ou de boire au laboratoire.
4. INTRODUCTION
L’évolution, thème fondamental en biologie, sous-tend à la fois l’unité et la diversité du vivant [1, p. 12]. La clé de
ces deux caractéristiques réside dans l’information génétique encodée dans l’ADN, et la biologie moléculaire apporte
un éclairage nouveau sur les liens évolutifs unissant les êtres vivants en scrutant de près le transfert de cette
information, d’abord transcrite en ARNm puis traduite en protéines.
4.1 La génomique vs la protéomique
La génomique est une discipline de la biologie moderne qui a pour objet l’étude du génome, l’ensemble du matériel
génétique (partie codante ou non codante de l’ADN), par le séquençage complet des gènes d’un organisme [1, p.
11]. La protéomique est quant à elle, plus complexe que la génomique, car cette science étudie le protéome,
l’ensemble des protéines d’une cellule à un moment donné [2]. Le génome est le même d’une cellule à l’autre tandis
que l’expression des gènes varie selon les parties du corps, les étapes de la vie et les conditions environnementales.
La protéomique a pour but de définir la structure, la fonction, les interactions, la localisation, le niveau d’expression
et les modifications post traductionnelles de toutes les protéines exprimées dans toutes les cellules, à toutes les
étapes du développement. Ce champ d’études étant très vaste, une collaboration internationale a été mise sur pied
afin de coordonner les différentes études, « Human Proteome Organization » (HUPO) [2].

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4.2 La protéomique et l’évolution
La protéomique a des applications dans plusieurs domaines, dont celui de l’évolution. Selon la théorie de la sélection
naturelle établie par Darwin, la valeur adaptative est la différence qui fait qu’un organisme est plus enclin à survivre
et se reproduire dans un environnement qu’un autre organisme [1, p. 555]. Cette adaptation est une caractéristique
phénotypique qui est déterminée par une composante génotypique. Les variations du profil de protéines d’un
organisme peuvent représenter des adaptations physiologiques à un environnement et une niche écologique, mais
elles proviennent de mutations de l’ADN qui se sont produites par hasard.
Mutations (ADN)  Variation (protéines)  Sélection  Adaptation  Évolution
Pour cette expérience, les protéines étudiées seront celles qui se retrouvent au niveau des muscles squelettiques
d’espèces aquatiques. Les deux principales protéines composant le muscle squelettique sont l’actine et la myosine
[3]. De nombreuses autres protéines sont aussi requises afin de permettre la contraction (Annexe 2). Bien que
l’actine et la myosine soient hautement conservées à travers le règne animal, les autres protéines musculaires
montrent une plus grande variabilité. Cette variation peut refléter un perfectionnement de la fonction musculaire
et de la performance qui est adaptif à la niche écologique particulière, à l’environnement ou au stress physiologique.
4.3 Électrophorèse verticale de protéines sur gel de polyacrylamide (SDS PAGE)
Les protéines sont synthétisées à partir d’une séquence de monomères appelés acides aminés [1, p. 85]. Il existe 20
acides aminés et c’est la séquence et l’interaction entre ceux-ci qui déterminent la conformation 3D des protéines
leur conférant une fonction spécifique [1, p. 88]. Le groupe « R » des acides aminés peut conférer une charge à la
protéine selon les acides aminés qui la composent. Les protéines peuvent donc avoir une charge intrinsèque
négative, neutre ou positive.
Le tampon utilisé afin d’extraire les protéines musculaires est le tampon Laemmli [4]. Ce tampon contient des
composés actifs tels que le 2-mercaptoéthanol, le sodium dodecyl sulphate (SDS) et le bleu de bromophénol.
L’échantillon de muscle est immergé dans le tampon et est ensuite chauffé à 95°C. Ce traitement favorise l’extraction
et la dénaturation des protéines. En effet, le SDS et la haute température permettent la dénaturation des protéines
et de leurs sous-unités, favorisant ainsi leur séparation selon leur taille et non leur selon leur conformation (figure
1).
Aussi, la chaleur, le SDS et le 2-mercaptoéthanol aident à réduire les liens chimiques dont les liens disulfures de la
conformation 3D de la protéine. Finalement le SDS, qui est un détergent, a aussi pour rôle de donner une charge
négative à toutes les protéines afin de les séparer selon leur taille et non selon leur charge intrinsèque (figure 1).
Finalement, le bromophénol bleu sert à colorer l’échantillon qui sera plus facile à charger dans le gel et qui formera
le front de migration (l’avancée des protéines sur le gel) (figure 1).
Les protéines extraites des différents échantillons sont, par la suite, séparées selon leur taille sur un gel de
polyacrylamide. Un courant électrique est appliqué sur le gel, la borne positive attire les protéines chargées
négativement vers le bas du gel (figure 1). Les protéines passent à travers les mailles du gel comme à travers un
tamis, la vitesse de migration est inversement proportionnelle à la taille. Par la suite, les protéines des différents
échantillons sont comparées avec un standard de protéines (Precision Plus Kaleidoscope prestained standard) dont
les différentes tailles sont connues. Cette comparaison permet la détermination de la taille réelle des différentes
bandes de protéines présentes sur le gel. La taille des protéines représente le poids moléculaire qui se mesure en
kilodalton (kD). À titre indicatif, la masse moyenne des acides aminés est de 110 daltons; la masse moyenne d’une
protéine de 100 acides aminés serait donc de 11 kD.
Les résultats de la migration sur gel des protéines peuvent servir d’empreinte pour les espèces aquatiques étudiées
(figure 2). En comparant le nombre de bandes de protéines que chacune des espèces aquatiques a en commun avec
une autre, il est possible d’émettre une hypothèse à propos du rapprochement évolutif de ces espèces.

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STD PPK
Figure 1 : Exemple de profils protéiques obtenus par la méthode SDS-Page et
Standard PPK (Precision Plus Kaleidoscope prestained standard)
-Chaleur (95C)
-SDS
-2-mercaptoéthanol + DTT
+
-
-Chaleur (95C)
-SDS
Séparation des sous-unités
de la protéine
Dénaturation des protéines,
perte de la conformation 3D 
la protéine devient linéaire
Perte de la charge intrinsèque des
protéines la protéine devient
chargée négativement
Protéine native
-SDS
Électrophorèse
La protéine va migrer à travers le gel selon
une seule caractéristique = sa taille
Figure 2 : Traitement et séparation des protéines musculaires d’espèces aquatiques par la
méthode SDS-PAGE.

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5. PROTOCOLE EXPÉRIMENTAL
5.1 Extraction des protéines musculaires
1. Identifier 6 microtubes de 1,5 ml en inscrivant sur le couvercle la lettre A à F (espèces) et votre # équipe.
2. Pipeter 250 µl de tampon Laemmli dans chacun des tubes.
3. Couper un cube de muscle de chacune des espèces aquatiques (0,25 x 0,25 x 0,25 cm) et transférer le cube
dans le tube correspondant. Éviter de prendre le gras (blanc), la peau et les arêtes.
4. Inverser les tubes chaque minute pendant 5 minutes pour extraire et solubiliser les protéines.
5. Pendant l’agitation, identifiez 6 nouveaux microtubes de 0,5 ml. Un pour chacune des espèces aquatiques.
6. Centrifuger à vitesse maximale pendant 10 secondes.
7. Transférer 50 µl du surnageant du premier tube dans le tube vide correspondant. Il est important de ne pas
transférer le cube de muscle, seulement le liquide.
8. Faire chauffer les tubes d’échantillon et le standard 5 minutes à 95°C afin de dénaturer les protéines.
Note: Un standard d'actine-myosine sera chauffé en même temps que vos échantillons. Cette solution standard
contient les principales protéines musculaires conservées au cours de l’évolution chez tous les vertébrés.
Il s’agit ici de protéines de lapin qui servent de contrôle positif pour valider notre méthode
d’électrophorèse et de coloration.
A
#1
B
#1
C
#1
D
#1
E
#1
Espèce
# équipe
F
#1
A
#1
B
#1
C
#1
D
#1
E
#1
Espèce
# équipe
F
#1

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5.2 Électrophorèse des protéines par la méthode de SDS PAGE
9. Le chargement du gel avec les échantillons et les standards se fait comme suit :
Puits
Volume
à charger
Nom de
l’échantillon
#1
Vide
N/A
#2
5 µl (technicienne)
STD PPK*
#3
10 µl
Échantillon A
#4
10 µl
Échantillon B
#5
10 µl
Échantillon C
#6
10 µl
Échantillon D
#7
10 µl
Échantillon E
#8
10 µl
Échantillon F
#9
10 µl
STD actine & myosine**
#10
Vide
N/A
* «Precision Plus Kaleidoscope prestained standard» formé de protéines colorées, de
dimensions connues, qui serviront de points de référence au cours de la migration et lors de
l’analyse des résultats.
** «Standard actine-myosine» contenant les principales protéines musculaires conservées au
cours de l’évolution chez tous les vertébrés. Il s’agit ici de protéines de lapin qui servent de
contrôle pour valider notre méthode d’électrophorèse et de coloration.
10. Afin de bien charger le gel, suivez les consignes suivantes :
a. Mettre un embout à chargement sur la pipette
b. Pipeter le volume voulu très doucement, car le liquide doit passer à travers un tout petit trou.
c. Insérer l’embout pointu à l’intérieur du bon puits.
d. Éjecter l’échantillon TRÈS DOUCEMENT. Si vous pipetez trop rapidement, l’échantillon sortira du
puits.
11. Après le chargement, mettre le couvercle et brancher les électrodes au générateur de courant.
12. Le voltage utilisé est de 200V pour une durée d’environ 60 minutes. Il est important de surveiller le front de
migration et de s’assurer d’une bonne séparation du standard «kaléidoscope».
13. Après la migration, placer le gel dans un bac contenant une solution de bleu de Coomassie. Colorer le gel
pendant 1 heure avec une agitation constante.
14. Vider le colorant et le remplacer par de l’eau afin de décolorer le gel pendant toute une nuit. Changer 2 à 3
fois l’eau lors de la décoloration.