Progression tumorale du cancer du poumon - E. Brambilla
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Progression tumorale : modèle du cancer du poumon Elisabeth BRAMBILLA INSERM U823 Institut Albert Bonniot Département d'Anatomie et Cytologie Pathologique CHU Grenoble France Incidence et mortalité des cancers Epithélium bronchique Etats prénéoplasiques Exposition aux carcinogénes Prédisposition génétique Effets autocrines et paracrines Mutation somatique 3p, 9p P53 - Rb EGF-R ras Télomérase P14ARF délétion réarrangement mutation amplification Mutation somatique Effets autocrines et paracrines Carcinome invasif et métastases Mutation somatique Protéases Adhésion-Migration Angiogènése Hyperplasie atypique alvéolaire Adénocarcinome mixte Carcinome bronchioloalvéolaire Adénocarcinome acineux Normal Dysplasie Hyperplasie Metaplasie Carcinome in situ Carcinome invasif Cancérisation en champ - La carcinogénèse broncho-pulmonaire est un processus multi-étape et multicentrique chez les fumeurs - Elle peut affecter au hasard toute région de l’arbre aérien - La progression des lésions prénéoplasiques dépend du nombre de la chronologie et de la vitesse d'accumulation des anomalies génétiques et moléculaires Transformation maligne - Accélération de la prolifération - Dérégulation du cycle cellulaire - Échappement aux points de contrôle du cycle (check-points G1 G2) - Inhibition de la mort cellulaire programmée (apoptose) - Acquisition de propriétés de migration -Perte des molécules d'adhésion intercellulaires -Digestion de la matrice intercellulaire (protéase) -Invasion des vaisseaux, angiogénèse Voies de signalisations altérées Récepteurs tyrosines kinase EGF-R / Ras / AKT / MAP-K…. P53 : apoptose / arrêt en G1 P53 / Bcl2 / Bax Rb : arrêt en G1 Rb / P16INK4 / CyclineD1,E Dommages de l'ADN: arrêt en G2 P14ARF / ATM / CHK2-P Télomérase / télomères Croissance autocrine - Facteurs de croissance et récepteurs aux facteurs de croissance sur les mêmes cellules tumorales ¾ Indépendance de l’environnement Récepteur tyrosine-kinase (R-EGF) Plasma membrane Growth factor Cytoplasmic signal protein RAS EGF-R-mt RAS mt Inactive receptor of growth factor Activated receptor Oncogènes à activité tyrosine-kinase - Récepteur à l' EGF - amplification :10 - 20% - mutation : 10 - 20% - hyperexpression mRNA - protéine: 60 - 85% NSCLC 0% SCLC - Récepteur c erb2 / Neu (p185) - mutation / amplification: 3% - hyperexpression: NSCLC 20% EGF-R bronche normale EGF-R Adénocarcinome Voie du recepteur à l'EGF EGF-R Mendelsohn, J. et al. J Clin Oncol Inhibition de la signalisation du recepteur à l'EGF Mendelsohn, J. et al. J Clin Oncol Mutations EGF-R dans les carcinomes non CPC PAEZ et al. Science 2004, 304 :1497 ; LYNCH et al. New Engl. J. Med. 2004, 350 PAO et al. PNAS 2004 ; MARCHETTI et al. JCO 2005-06-21 • 10 à 15 % dans les adénocarcinomes 26 % dans les adénocarcinomes avec CBA (OR : 4,5) et les ADC papillaires • Rares dans les autres carcinomes non CPC • Significativement plus fréquentes chez les non fumeurs (50 %) que chez les fumeurs (5 %) (OR : 3,6) et chez les femmes vs hommes • Plus fréquentes chez les Asiatiques > Caucasiens > Africains Américains • Le plus puissant prédicteur de sensibilité aux TKI Distribution des mutations du domaine TK de EGFR : meta analyse de 5 études (n=1256) P- loop Extracellular domain 18 19 Deletions 46% 20 Duplications/ Insertions (9%) αC- helix Transmembrane region N-lobe ATP binding cleft C-lobe TK domain Regulatory domain Shigematsu Shigematsuetetal, al,Int. Int.J.J.Cancer Cancer2006 2006 A- loop 21 L858R (39%) Les mutations de l'EGFR prédisent la réponse aux TKIs Mécanismes d'activation de l’EGF-R • Mutation • Amplification du gène • Polysomie du chromosome 7? Hirsch et al. 2003 Disomy 7 / EGFR : 40% Trisomy : 40% FISH - FISH + High polysomy : 13% Amplification EGFR: 9% Prédicteurs moléculaires de la réponse aux TKI RR PFS OS EGF-R mutation 80-100 <0,001 <0,001 EGF-R Copy nb ≈ 50% <0,001 0,03 EGF-R high expression 20%? 0,01? 0,01? Mutations somatiques de la voie EGF-R dans le cancer du poumon 1 d n a Lig 2 Sos Grb2 Récepteur tyrosine kinase 5 + SH2 SH3 4 GNRP + 5 Ras-GTP ras-GDP GDP GAP5 SH GTP 6 Pi 7 Raf1 MAP kinase kinase ADN Croissance Différenciation AP1 fos jun MAP kinase Ras : Transduction du signal de croissance par les récepteurs tyrosinekinase GTP-ase - Ras-GTP Ras-GDP - Activation du gène Ras . mutation du gène Ki-ras (codon 12) . 15 % des adénocarcinomes . 15 % des hyperplasies atypiques alvéolaires . Seulement chez les fumeurs et ex fumeurs ¾ événement précoce dès le stade prénéoplasique Exon 1 Exon 2 K-RAS 2 GGT GGC Codon 12 Codon 13 Glycine GCA CCA Codon 59 Codon 61 Mutation ponctuelle unique 1ère ou 2ème base, jamais la 3ème TGT Cystine CGT Arginine GTT Valine AGT Sérine GAT AspartateGCT Alanine Exclusion mutuelle entre les mutations EGF-R, Her2 et K Ras • Aucun patient ne présente plus d'une mutation • Les mutations Ras et EGF-R sont précoces : – Dans le champ de cancérisation du tissu apparemment normal – Dans les prénéoplasies HAA AAH KiRas Mut. BAC / papillaire ADC mixte 15% 15% 15% fumeurs R-EGF Mut. 15% 15% 20% non fumeurs P53 Mut. 0 10% 30% EGF-R ¸nb copies 0 0 40% AAH BAC FISH FISH ADC mixte ? FISH++ La mutation de KRAS prédit la réponse à Gefitinib et Erlotinib (TKI) Lésions bronchiques prénéoplasiques Hyperplasie ⇓? Metaplasie ⇓? Dysplasie ⇓⇓ Carcinome In situ ⇓⇓⇓ Carcinome invasif Normal Dysplasie Hyperplasie Metaplasie Carcinome in situ Carcinome invasif Lésions bronchiques prénéoplasiques Hyperplasie ⇓? Metaplasie ⇓? Dysplasie ⇓⇓ Carcinome In situ ⇓⇓⇓ Carcinome invasif Pathologie moléculaire Cycle cellulaire Apoptose / sénescence Angiogénèse / migration Dérégulation précoce du cycle cellulaire • Index de proliferation : Ki67 • Perte du contrôle de l'arrêt en G1 P53 P16INK4 Cycline D1 Cycline E Lésions ADN P53 + + waf 1 p21 p16 cdk Stimuli p14 oncogèniques Myc, Ras, E2F1 Bax PIG Fas bcl2 cyclD1 apoptose survie Rb E2F arrêt G1 Rb - P E2F G1 S Mutations de P53 dans les cancers pulmonaire • 47% non fumeurs • 56% ex-fumeurs • 77% fumeurs G:C to A:T G:C to T:A A:T to G:C P53 Carcinome épidermoïde P53 Dysplasie modérée L'immunophénotype P53 mutant dans la dysplasie et le carcinome in situ est significativement corrélé - à l'existence d'un carcinome invasif p = 0,0014 - à la proximité de ce carcinome invasif p = 0,0003 E. Brambilla et al. Clin. Cancer Res. 1999 Lésions ADN p14 Mdm2 P53 + + waf 1 p21 p16 cdk Stimuli p14 oncogèniques Myc, Ras, E2F1 Bax PIG Fas bcl2 cyclD1 apoptose survie Rb E2F arrêt G1 Rb - P E2F G1 S MDM2 Ub Ub p14ARF Ub Ub p53 Stabilisation de p53 Transactivation Altération des fonctions P53 dans les cancers pulmonaires • P53: mutation 50% • Mdm2: hyperexpression 30% • P14ARF: perte d ’expression 25% ⇒ 60% non CPC CPC Oncogenic stimuli Myc, ras, E2F1 P53 dependant pathway DNA damage Telomere shortening Rb P14ARF CHK2 H2AX P-H2AX P-CHK2 G2 arrest apoptosis Alkylants Tobacco carcinogens Small Cell Carcinoma, Adenocarcinoma Gazzeri et al, Cancer Research, 1998 p14ARF Tip60 ATM/CHK2 Response to DNA damage Cell cycle arrest DNA repair Chemoresistance ? Apoptosis Eymin, et al, Mol.Cell.Biol., 2006 Alkylating drugs Cigarette smoke condensate p14ARF Tip60 Acetylation of proteins / histones ATM / CHK2 DNA damage checkpoint Lésions ADN p14 Mdm2 P53 + + waf 1 p21 p16 cdk Stimuli p14 oncogèniques Myc, Ras, E2F1 Bax PIG Fas bcl2 cyclD1 apoptose survie Rb E2F arrêt G1 Rb - P E2F G1 S P53 Waf1 (p21) P16 (mts1) P15 (mts2) Cdk2 - cycline E Cdk4 - cycline D1 mdm2 Rb E2F Rb P P P E2F Arrêt G1 G1 → S Cell cycle cyclin A and B +Cdc 2 M G2 cyclin D1 D2 D3 +Cdk 2, 4, 5, 6 P21 cyclin A +Cdk 2 S G1 p15, p16 p21, p27 cyclin E + Cdk 2 E2F / DP-1 activation Rb phosphorylation P53 100 Perte d'expression de Rb dans les cancers pulmonaires 80 60 40 0 Malp ADC 73 43 Bas. 19 Tumeurs Non NE C d ï no i c 8 r a 1 . C N EG 31 C 20 C P C 3 4 Tumeurs NE Changements phénotypiques révélateurs de la dérégulation du cycle cellulaire : arrêt en G1 • P16 INK4 • Cycline D1 • Cycline E Inhibiteur de Cdk: P16INK4 • Inhibe la phosphorylation de Rb par les Cdk • Inactivation deP16: perte du contrôle de l'arret en G1 - Deletion homozygote 48% - Methylation du promoteur 33% - Mutation d'un allele 14% 95% de concordance avec la perte de l'expression protéique Gazzeri et al. Oncogene 1997 9p centromeric probe P16 INK4 probe 9p centromeric probe P16 INK4 probe P53 Waf1 (p21) P16 (mts1) P15 (mts2) Cdk2 - cycline E Cdk4 - cycline D1 mdm2 Rb E2F Rb P P P E2F Arrêt G1 G1 → S Cycline D1 et E • Phosphorylent Rb – Cycline D1 - CdK4-6 – Cycline E - CdK2 • Hyperexpression Î perte du contrôle de l'arret en G1 • Amplification rare • Détection: immunohistochimie, western blott Cycline D1 Altérations de la voie Rb dans les cancers non à petites cellules - Perte de l’expression Rb : Perte de l’expression P16INK4 : Hyperexpression de la cycline D1 : Hyperexpression de la cycline E : ¾ Relation inverse Rb-P16INK4 10-15 % 50 % 50 % 70 % Cycline D1 C.I.S. Cycline E Hyperexpression des cyclines D1 et E dans les lésions préinvasives bronchiques (n=80) 100% 90 80 70 Cycline D1 Cycline E 60 50 40 30 20 10 P < 0,001 C IS D sé ysp vè la re sie D m ys p od la ér si ée e D lé y s p gè la re si e N H orm yp a er l pl as ie M et ap la si e 0 Perte de susceptibilité à l'apoptose Bcl2 / bax FHIT Fas Bax Bax Bax Bcl-2 Bax Bax Bax Bcl-X L Survie Apoptose Fonction Bax Fonction Bax neutralisée concervée Survie Apoptose (Reed J. C. 1996) BAX normal BAX SD BCL2 normal BCL2 SD Cancers non à petites cellules • 25% hyperexpression de Bcl2 • 50% perte de Bax Cancers à petites cellules • 90% hyperexpression de Bcl2 • 80% perte de Bax Fonctions apoptotiques dans les lésions prénéoplasiques 100% Bax 80 µ Bcl2 µ µ µ 60 Expression normale FHIT µ 40 µ 20 0 Hyperplasie Métaplasie Dysplasie CIS Carcinome Invasif Immortalisation des cellules tumorales Telomerase • - Une transcriptase inverse qui synthetise des sequences telomeriques, qui se perdent à chaque division cellulaire • - Inactive dans les tissus matures • - Exprimée dans les cellules souches • - Reactivée dans les cellules cancéreuses hTERT: protein hTERT: mRNA hTERT expression in preneoplastic bronchial lesions 250 200 150 Protein IH mRMA HIS 100 50 P<0.0001 0 N/H MM DL DM DS CIS INV P53 Cycline D1 0 Anomalie 1 Anomalie P = 0.02 2 Anomalies 3 Anomalies 4 Anomalies Métaplasie DL DM DS CIS Gènes suppresseurs de tumeurs - Localisés aux sites de délétions d’allèles (LOH) - Gènes récessifs : mutation d’un allèle perte du 2ème allèle (normal) micro RNA - Inactivation = perte de l’expression protéique Oncogènes et gènes suppresseurs Normal gene 2 parental alleles Dominant Oncogène One allele activated Other allele normal Recessive Oncogène One allele lost Other allele inactivated point mutation homozygous deletion aberrant methylation Gènes suppresseurs de tumeurs • Fonctions : - Inhibition de croissance - Apoptose • Inactivation : - Perte d’un allèle - Méthylation du promoteur - Mutation - Délétion homozygote - Micro ARN Gènes suppresseurs = pertes d'allèles L.O.H. Gènes Fonctions 3p-14 Apoptose FHIT autres? Apoptose 3p-21,3 Semaphorine β catenine, LIMD1 Adhesion, arret G1 9p21- P16INk4 - P15 Cdk-I Arret en G1 17p13- P53 autres? Arret en G1 Apoptose 13q14- Rb autres? APC-MCC Arret en G1 5q21- Caténines Adhésion Méthylation aberrante CpG non méthylé Tissue normal Tumeur CpG méthylé Génes suppresseurs méthylés LOH 9 INK4 P16 9 9 RARβ 9 RASSF1 DAP-kinase Caspase 8 9 FHIT 06MGMT GSTπ1 CYCLE CELLULAIRE APOPTOSE REPARATION DE L'ADN 9 E Cadherin APC TIMP 3 MIGRATION Analyse de méthylation par technique MSP: tissu normal, tumoral et serum U: non méthylé M: méthyle Chronologie d ’acquisition des altérations génétiques ? Théorie séquentielle Hyperplasie ⇒ Metaplasie ⇒ Dysplasie ⇒ CIS ? ? ? ? Théorie parallele Hyperplasie ⇒ Metaplasie ⇒ Dysplasie ⇒ CIS ? ? ? ? Cancer invasif Etude de l'expression (ARN) des gènes par les micro-arrays: Objectifs ¾ Obtenir une signature moléculaire de cancer unique • Identifier les gènes de tumeur vs normal • Redéfinir les classes diagnostiques Classification histo-moléculaire • Identifier une signature prédictive "haut risque" vs "bas risque" • Identifier une signature de réponse au traitement ¾ Cibles moléculaires du diagnostic précoce du risque évolutif du traitement Survival prediction of stage I lung adenocarcinomas by expression of 10 genes Fabrizio Bianchi,1 Paolo Nuciforo,1 Manuela Vecchi,1 Loris Bernard,1 Laura Tizzoni,1 Antonio Marchetti,2 Fiamma Buttitta,2 Lara Felicioni,2 Francesco Nicassio,1 and Pier Paolo Di Fiore1,3,4 1IFOM, Fondazione Istituto FIRC di Oncologia Molecolare, Milan, Italy. 2Center of Excellence on Aging, University Foundation, Chieti, Italy. 3Istituto Europeo di Oncologia, Milan, Italy. 4Dipartimento di Medicina, Chirurgia ed Odontoiatria, Università degli Studi di Milano, Milan, Italy. The Journal of Clinical Investigation Volume 117 Number 11 November 200 La signature à 10 gênes Une signature de 5 gènes prédictifs d'agressivité • 185 prélèvements congelés • Jeu d'essai : 125 patients modèle d'expression génique • Jeu de validation 60 patients • Analyse Microarrays ¼ RT-PCR pour application • 16 gènes à haute valeur pronostique • Sélection de 5 gènes DUSP6, MMD, STAT1, ERBB3, LCK ¼ RT-PCR Arbre décisionnel 60 patients même centre ¼ 96% bonne prédiction 86 patients indépendants Chen HY et al. N. Engl. J. Med. 2007 Airway epithelial gene expression in the diagno evaluation of smokers with suspect lung cance Avrum Spira1, Jennifer E Beane2,8, Vishal Shah2,8, Katrina Steiling1, Gang Liu1, Frank Schembri1 Sean Gilman3, Yves-Martine Dumas1, Paul Calner4, Paola Sebastiani5, Sriram Sridhar1, John Bea Carla Lamb3, Timothy Anderson6, Norman Gerry7, Joseph Keane4, Marc E Lenburg7 & Jerome S NATURE MEDICINE VOLUME 13 [ NUMBER 3 [ MARCH 2007 Un profil d'expression (MRNA) prédictif de cancer pulmonaire : Affinutrix HG-UI33A (80 gènes) A. Spira et al. Nature Medecine 2007 • • • Prévalence du cancer br. : 50% Accuaray : 83% Cytobronchique - / GE+ 89% sensitivité 83% spécificité • Cytobronchique + or GE+ 95% sensitivité 94% validation prospective • Cytobronchique - / GE95% VPN 93% validation prospective ¼ Le brossage proximal en amont du cancer présente un profil d'expression m RNA prédictif de cancer à distance / champ de cancerisation
