Action des gib

FLEURANT Thomas
DEMENET Alain
L3 Vie et Terre
LES RESERVES DES VEGETAUX
UN EXEMPLE DE MOBILISATION DES RESERVES :
Action des gibbérélines sur la synthèse d' α-amylase des semences
d'orge.
Responsable : FILLEUR Sophie
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u cours de ce TP, nous nous sommes intéressés a l’action des
gibbérellines qui forment une famille d’hormones végétales, chez un
grain d’orge.
A
L’embryon étant non photosynthétique, il doit utiliser le glucose provenant de
l’amidon contenu dans l’albumen du caryopse. L’amidon est clivé en α-1, 4 par des
enzymes α- amylases en glucose, maltose et dextrines. Comme l’embryon se sert
uniquement de sucres solubles tel que le glucose, cette transformation s’avère
indispensable pour sa croissance.
Nous avons cherché a mettre en évidence, l’action de l’acide gibbérellique 3 (AG3)
sur l’α-amylase et par conséquent sur la voie de digestion de l’amidon.
Matériel et méthode
Les caryopses d’orge sont stérilisés et rincés abondamment durant 24 heures.
Ensuite, nous nous débarrassons de la partie contenant l’embryon afin de ne garder
que l’albumen. En procédant ainsi on limite l’apport endogène d’AG3 .
On réalise 7 tubes dans lesquels on introduit les échantillons d’albumen et 5 ml d’une
solution d’ AG3 à différentes concentrations (dont une est inconnue). Deux autres
tubes comprennent une concentration d’ AG3 de 10--8 g/mL et soit de la cordycépine
(Cord), qui bloque la transcription, soit de la cycloheximide (CH), bloqueur de la
traduction. On prélève 0,5 mL dans chacun de ces tubes après centrifugation, que
nous diluons dans 7,5 mL d’eau distillée (soit une dilution de 1/16ème).
On réalise toutes ces manipulations en milieu stérile afin d’éviter de contaminer nos
solutions par des bactéries qui consommeraient la petite quantité de glucose
produite.
L’incubation se fait entre 24 et 48 heures à 30°C.
De manière à mesurer la quantité de glucose formé, on effectue un dosage
colorimétrique à l’aide d’un spectrophotomêtre (les données seront lues à 505 nm)
par la méthode enzymatique de TRINDER.
Le réactif G (réactif de TRINDER) réagit en présence de glucose ce qui donne une
coloration rose à la solution. Plus la coloration est importante plus la concentration
l’est aussi et donc plus l’activité de l’α-amylase est élevée. Après les mesures nous
pouvons tracer la courbe de la fig. 1 d’après la méthode qui sera exposée par la suite.
En parallèle, nous réalisons une courbe étalon qui nous servira de référence.
Sept solutions diluées de 10 mL sont obtenues grâce à des concentrations croissantes
en AG3 dont on mesure l’absorbance (DO) en présence de réactif G.
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Concentration
(μg/mL)
0 25 50 100 200 300 400
mL eau
distillée
10 9,75 9,5 9 8 7 6
mL glucose 0 0,25 0,5 1 2 3 4
DO à 505 nm 0 0,080 0,168 0,338 0,697 0,960 1,350
Les données obtenues nous permettent de tracer la courbe étalon (fig. 2).
On observe également la coupe tansversale d’un caryopse d’orge sec, incubé
dans une solution [AG3]=10--8 g/mL et un dernier dans [AG3]=10--8 g/mL et CH.
Enfin, on réalise une expérience qualitative à partir d’empois d’amidon seul
ou en présence d’[AG3]=10-8 g/mL avec ou sans CH, révélé au lugol (marqueur de
l’amidon).
Résultats et interprétations
Afin de calculer les concentrations en glucose dans nos 9 tubes, nous devons
déterminer le coefficient d’absorption (ε) à partir de la courbe étalon pour appliquer
la loi de Beer-Lambert.
On peut le déterminer à l’aide de la pente de la courbe étalon :
ε=yb−ya
xb−xa
ε=1,350−0,08
400−25
ε=0,0034
mL.μg-1.cm-1
Ainsi, les concentrations de glucose sont obtenues de la manière suivante :
Loi de Beer-Lambert : A= ε.l.c
A : absorption
ε : coefficient d’absorption
l : largeur de la cuve
c : concentration de la solution
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D’où c = A/(ε.l)
D’après les valeurs mesurées et calculées pour le témoin :
C=0,396
0,0034∗1=116,47
μg/mL
On étend le même procédé à toutes les autres valeurs. Le résultat est résumé dans le
tableau ci-dessous :
Concentration
gibbérélines (g/mL)
DO à 505 nm Concentration de
glucose (μg/mL)
Activité α-
amylasique
T = 0 0,396 116,47 582,35
10-10 0,450 132,35 661,75
10-9 0,511 150,29 751,45
10-8 0,518 152,35 761,75
10-7 0,326 95,98 479,9
10-6 0,265 77,94 389,7
10-8 + CH 0,008 2,35 11,75
10-8 + Cord 0,373 109,71 548,55
X 0,430 126,47 632,35
L’activité α-amylasique (en μg de glucose) est obtenue en multipliant la
concentration par 5, des 5 mL de solution de départ.
Nous retrouvons la courbe de l’activité α-amylasique, en ug de glucose, en fonction
de la concentration en AG3, en g/mL (fig. 1). Il s’agit d’une gaussienne typique de
l’activité hormonale.
Pour une concentration nulle en AG3, on observe une activité de l’α-amylase à
hauteur de 582 μg de glucose alors qu’on s’attendait à un résultat proche de zéro. On
peut l’expliquer par le fait que le caryopse contenait déjà de l’AG3 endogène dans
l’albumen. C’est notre témoin.
Si on augmente la concentration en AG3, l’activité croit jusqu’à un seuil maximal, par
rapport au témoin, qui correspond aux concentrations optimales d’activité de l’α-
amylase soit 10--8 μg/mL. Au-delà l’activité décroît jusqu’à des valeurs inférieures au
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