Action des gib

FLEURANT Thomas
DEMENET Alain
L3 Vie et Terre
LES RESERVES DES VEGETAUX
UN EXEMPLE DE MOBILISATION DES RESERVES :
Action des gibbérélines sur la synthèse d' α-amylase des semences
d'orge.
Responsable : FILLEUR Sophie
1
2
A
u cours de ce TP, nous nous sommes intéressés a l’action des
gibbérellines qui forment une famille d’hormones végétales, chez un
grain d’orge.
L’embryon étant non photosynthétique, il doit utiliser le glucose provenant de
l’amidon contenu dans l’albumen du caryopse. L’amidon est clivé en α-1, 4 par des
enzymes α- amylases en glucose, maltose et dextrines. Comme l’embryon se sert
uniquement de sucres solubles tel que le glucose, cette transformation s’avère
indispensable pour sa croissance.
Nous avons cherché a mettre en évidence, l’action de l’acide gibbérellique 3 (AG3)
sur l’α-amylase et par conséquent sur la voie de digestion de l’amidon.
Matériel et méthode
Les caryopses d’orge sont stérilisés et rincés abondamment durant 24 heures.
Ensuite, nous nous débarrassons de la partie contenant l’embryon afin de ne garder
que l’albumen. En procédant ainsi on limite l’apport endogène d’AG3 .
On réalise 7 tubes dans lesquels on introduit les échantillons d’albumen et 5 ml d’une
solution d’ AG3 à différentes concentrations (dont une est inconnue). Deux autres
tubes comprennent une concentration d’ AG3 de 10--8 g/mL et soit de la cordycépine
(Cord), qui bloque la transcription, soit de la cycloheximide (CH), bloqueur de la
traduction. On prélève 0,5 mL dans chacun de ces tubes après centrifugation, que
nous diluons dans 7,5 mL d’eau distillée (soit une dilution de 1/16ème).
On réalise toutes ces manipulations en milieu stérile afin d’éviter de contaminer nos
solutions par des bactéries qui consommeraient la petite quantité de glucose
produite.
L’incubation se fait entre 24 et 48 heures à 30°C.
De manière à mesurer la quantité de glucose formé, on effectue un dosage
colorimétrique à l’aide d’un spectrophotomêtre (les données seront lues à 505 nm)
par la méthode enzymatique de TRINDER.
Le réactif G (réactif de TRINDER) réagit en présence de glucose ce qui donne une
coloration rose à la solution. Plus la coloration est importante plus la concentration
l’est aussi et donc plus l’activité de l’α-amylase est élevée. Après les mesures nous
pouvons tracer la courbe de la fig. 1 d’après la méthode qui sera exposée par la suite.
En parallèle, nous réalisons une courbe étalon qui nous servira de référence.
Sept solutions diluées de 10 mL sont obtenues grâce à des concentrations croissantes
en AG3 dont on mesure l’absorbance (DO) en présence de réactif G.
3
Concentration
(μg/mL)
0
25
50
100
200
300
400
10
9,75
9,5
9
8
7
6
mL glucose
0
0,25
0,5
1
2
3
4
DO à 505 nm
0
0,080
0,168
0,338
0,697
0,960
1,350
mL eau
distillée
Les données obtenues nous permettent de tracer la courbe étalon (fig. 2).
On observe également la coupe tansversale d’un caryopse d’orge sec, incubé
dans une solution [AG3]=10--8 g/mL et un dernier dans [AG3]=10--8 g/mL et CH.
Enfin, on réalise une expérience qualitative à partir d’empois d’amidon seul
ou en présence d’[AG3]=10-8 g/mL avec ou sans CH, révélé au lugol (marqueur de
l’amidon).
Résultats et interprétations
Afin de calculer les concentrations en glucose dans nos 9 tubes, nous devons
déterminer le coefficient d’absorption (ε) à partir de la courbe étalon pour appliquer
la loi de Beer-Lambert.
On peut le déterminer à l’aide de la pente de la courbe étalon :
ε=
 y b− y a 
 x b− x a 
ε=
1,350−0,08
400−25
ε =0,0034 mL.μg-1.cm-1
Ainsi, les concentrations de glucose sont obtenues de la manière suivante :
Loi de Beer-Lambert : A= ε.l.c
A : absorption
ε : coefficient d’absorption
l : largeur de la cuve
c : concentration de la solution
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D’où c = A/(ε.l)
D’après les valeurs mesurées et calculées pour le témoin :
C=
0,396
=116,47 μg/mL
0,0034∗1
On étend le même procédé à toutes les autres valeurs. Le résultat est résumé dans le
tableau ci-dessous :
Concentration
gibbérélines (g/mL)
DO à 505 nm
Concentration de
glucose (μg/mL)
Activité αamylasique
T=0
0,396
116,47
582,35
10-10
0,450
132,35
661,75
10-9
0,511
150,29
751,45
10-8
0,518
152,35
761,75
10-7
0,326
95,98
479,9
10-6
0,265
77,94
389,7
10-8 + CH
0,008
2,35
11,75
10-8 + Cord
0,373
109,71
548,55
X
0,430
126,47
632,35
L’activité α-amylasique (en μg de glucose) est obtenue en multipliant la
concentration par 5, des 5 mL de solution de départ.
Nous retrouvons la courbe de l’activité α-amylasique, en ug de glucose, en fonction
de la concentration en AG3, en g/mL (fig. 1). Il s’agit d’une gaussienne typique de
l’activité hormonale.
Pour une concentration nulle en AG3, on observe une activité de l’α-amylase à
hauteur de 582 μg de glucose alors qu’on s’attendait à un résultat proche de zéro. On
peut l’expliquer par le fait que le caryopse contenait déjà de l’AG 3 endogène dans
l’albumen. C’est notre témoin.
Si on augmente la concentration en AG3, l’activité croit jusqu’à un seuil maximal, par
rapport au témoin, qui correspond aux concentrations optimales d’activité de l’αamylase soit 10--8 μg/mL. Au-delà l’activité décroît jusqu’à des valeurs inférieures au
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témoin. Dans un premier temps, l’augmentation de la concentration en AG3 stimule
l’activité α-amylasique. Cette dernière atteint un optimum. Après cela il semblerait
que l’AG3 exerce un rétrocontrôle sur cette même activité en déclenchant des
mécanismes qui inhibe l’α-amylase.
A l’aide de la fig. 1, on peut déterminer approximativement la concentration en AG3
de notre tube X car on connaît son activité α-amylasique. Par lecture sur le graphe
nous
obtenons
deux
points
:
1,2.10-10
g/ml
et
1,55.10-7
g/ml.
On ne peut pas obtenir précisément laquelle des deux est la bonne concentration en
AG3. Il faudrait pouvoir doser l’AG3 pour savoir.
Pour une concentration en AG3 identique de 10--8 g/mL on constate que l’activité αamylasique
diminue
en
présence
de
Cord
ou
de
CH.
En effet, l’ajout de CH bloque presque entièrement l’activité de l’α-amylase soit une
valeur de 11,75. Or, on sait que cet inhibiteur intervient au niveau de la traduction,
ainsi
CH
empêche
l’action
de
l’hormone
AG3.
On remarque également que l’activité α-amylasique en présence de Cord diminue
significativement. Mais, cette inhibition est bien moins efficace que celle de CH
puisqu’elle vaut 548,55. Contrairement à CH, Cord agit sur la transcription. Donc,
comme ces inhibiteurs ont une action réelle sur le métabolisme, on peut penser
qu'AG3 agit sur la synthèse de l'enzyme et non sur son activation.
Nous avons effectué un test qualitatif de la présence d’amidon clivé par l’αamylase dont voici le résultat :
0
10
20
30
[AG3] = 0 g/mL
+++
+++
++
+
[AG3] = 10--8 g/
mL
+++
++
++
0
[AG3] = 10--8 g/
mL + CH
+++
+++
++
++
0 : incolore ; + : violet pâle ; ++ : violet ; +++ : violet foncé
Le témoin ne change pas de couleur au fil du temps ce qui est normal car il n’y a que
de l’amidon révélé au lugol. La baisse peut s’expliquer par une faible activité de l’αamylase dans la solution témoin que nous avons déjà vu précédemment.
Avec une solution de concentration 10--8 g/mL en AG3 qui a incubé avec de
l’albumen, on observe une nette diminution de la couleur jusqu’à disparition, durant
la demi-heure. L’α-amylase présente dans la solution a totalement clivé l’amidon en
glucose
entre
autre.
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Avec du CH et une concentration de 10--8 g/mL en AG3, on n’observe pratiquement
aucune variation de la couleur. L’amidon ne disparaît pas. Il n’est pas digéré par de
l’α-amylase, donc elle peu présente dans la solution. Donc CH inhiberait bien la
synthèse d’α-amylase.
Pour finir, on observe la coupe transversale de grain d’orge sec au microscope
optique.
Dessin d'observation de coupe transversale de caryopse d'orge au niveau de l'albumen
au microscope optique (x 100) coloré au lugol
On observe que le caryopse est composé d’un tégument, suivi de 3 assises de cellules
à aleurones. Puis, on trouve l’albumen avec des amyloplastes très gros colorés par le
lugol. L’albumen est donc riche en amidon.
On observe maintenant les cellules de l’albumen des grains incubés dans 10--8 g/mL
d’AG3 avec ou sans CH.
Comparaison des cellules à amyloblastes de l'albumen incubés dans 10--8 g/mL d'AG3 en
présence ou non de CH, coloré au lugol, observé au microscope optique (x 400)
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On remarque que les amyloplastes des grains d’orge à 10--8 possèdent des fissures et
leur centre est plus pâle que en présence de CH. Donc on peut en conclure que sans
CH l’amidon a bien été clivé de l’intérieur vers l’extérieur de l’amyloplaste (qui se
rétracte formant les fissures). En présence de CH les amyloplastes sont gros et bien
violet, l’amidon n’a pas été digéré car le CH a bloqué sa synthèse. Ce qui corrobore
notre observation faites précédemment.
N
Conclusion
os observations ont montré que l’AG3 était présent dans l’albumen puisque
le témoin à une activité α-amylasique non nulle, or on sait que l’AG3 est
formé exclusivement dans l’embryon. Ce qui implique forcèment un flux
d'AG3 de l’embryon vers l’albumen.
Cet AG3 va permettre la synthèse d’un grand nombre d’hydrolases, dont l’α-amylase
dans les cellules à aleurones du grain. L’α-amylase dégrade l’amidon en glucose
principalement. On a pu mettre en évidence l’existence d’un rétrocontrôle qui par
des mécanismes inconnues diminue l’activité de l’α-amylase après qu’un seuil en
concentration d’AG3 eut été dépassé. Ce dernier se trouve aux environs de 10--8 g/mL.
On a également observé l’existence d’inhibiteurs de cette voie de synthèse soit au
niveau de la traduction (CH) ou de la transcription (Cord). L’inhibition de la
traduction étant la plus forte on peut penser qu'AG3 agit préférentiellement au
niveau de la transcription. C'est à dire sur la synthèse de novo de l'α-amylase plutôt
que sur son activation.
L’α-amylase ainsi produite, se retrouve dans les amyloplastes des cellules de
l’albumen. Elle va cliver les grains d’amidons de l’intérieur vers l’extérieur de
l’amyloplaste. Le glucose formé sort de la cellule et est exporté vers l’embryon.
Cette importante activité enzymatique permet à l’embryon de consommer les
réserves énergétiques insolubles de l’albumen en les dégradant en matière soluble et
utilisable, essentiellement sous forme de glucose, afin de compléter sa croissance.
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