Sujet_ET1_2013-corrigé

BIO241
Examen terminal 1ère session (17 mai 2013)
Documents et calculatrices non autorisés
XX pages
Notation sur 100
_____________________________________________
PARTIE A
Protéines/Bioénérgétique/Enzymologie/Métabolisme
Question 1
6 pts
On dispose d’un mélange de 3 protéines, A, B et C, dont les caractéristiques sont données dans le
tableau ci-dessous. La protéine A est formée de 2 chaînes polypeptidiques (A-I et A-II) liées par des
ponts disulfure.
Protéine
MM (g.mol-1)
pHi
Protéine A
A-I
A-II
Protéine B
80.000
60.000
20.000
40.000
7
5
9
6,8
Protéine C
40.000
4,1
a- Le mélange protéique est analysé sur gel de polyacrylamide (SDS-PAGE) en présence de SDS. Les
échantillons sont traités en présence en en absence de 2-mercaptoéthanol (2-ME)?
- Rappeler le principe de cette technique, le rôle du SDS et du mercaptoéthanol.
Le SDS est un agent dénaturant (détergent anionique) qui dénature les protéines et les charge toutes
négativement. Les protéines sont séparées par cette technique selon leur PM. Le mercaptoéthanol
est un agent réducteur qui coupe les ponts disulfure.
- Quel sera le profil électrophorétique du mélange protéique? Reproduire sur votre copie la figure cidessous. Indiquer clairement l’échelle des PM utilisés, le sens de migration et la migration des
échantillons protéiques déposés, en respectant la légende.
Sur 2 points : 1 pt pour placer correctement l’échelle PM et sens de migration (haut PM en haut de
la figure et flèche vers le bas pour le sens de migration), 1 pt si profils corrects (bandes à 80 kDa et 40
kDa pour le puits 2 et bandes à 60, 40 et 20 kDa pour le puits 3)
b- Etablir un protocole de fractionnement chromatographique permettant de séparer les protéines
A, B et C . Justifier le protocole choisi.
Deux étapes : 1) gel filtration pour séparer A des protéines B & C (pcpe de séparation basé sur le PM),
puis récupérer la fraction correspondant au mélange B+C et les séparer par chromato échange ion
(pcpe de séparation basé sur la charge de la prot).
Question 2
6 pts
On dispose d’une série d’enzymes (E1 à E5) spécifiques du même substrat (S) et caractérisées par les
paramètres suivants :
Enzyme
Km (M)
Kcat (s-1)
E1
3.10-3
3.103
E2
2.10-3
4.103
E3
6.10-5
6.102
E4
7.10-3
7.102
E5
2.10-2
2.104
Laquelle de ces enzymes, utilisée à concentration égale, doit-on choisir pour obtenir l’activité la plus
élevée en présence du substrat (S) à la concentration de : Justifier votre réponse
Cas a) : [S] = 10-6M
Cas b) : [S] = 10-1M
cas a: la [S] étant très inférieure à tous les Km de la série d’enzymes, on se trouve dans des
conditions où V 0 est proportionnelle à (V M /Km), soit à conc [E] égale, à kcat/Km (rapport
déterminant l’efficacité catalytique). On choisit donc l’enzyme ayant la plus haute efficacité
catalytique, soit E3
Valeurs de kcat/Km (M-1. s-1):
E1 : 106 ; E2 : 2.106 ; E3 : 107, E4 : 105 ; E5 : 106
Cas b: la [S] étant saturante pour toutes les enzymes (car très supérieures aux valeurs individuelles
de Km), on se trouve dans des conditions où V 0 est égale à Vm, soit à conc [E] égale, à kcat (valeur
qui définit l’éfficacité cinétique en conc saturante de S). On choisit don l’enzyme ayant la pus haute
efficacité cinétique, soit E5.
Question 3
12 pts
Le tableau ci-dessous caractérise la purification d’une enzyme E à partir de son tissu d’origine. Trois
étapes sont utilisées (précipitation au sulfate d’ammonium suivies de deux étapes
chromatographiques)
a- A partir des valeurs données pour l’extrait brut dans le tableau, indiquer les unités (il s’agit
d’unités usuelles, vues en cours et TD) utilisées par l’expérimentateur pour déterminer l’AE, AS et AT
de ses échantillons.
3 pts
Etape
Vol
Protéines
(ml)
(mg/ml)
Activité
(AE)
enzymatique
Activité
(AS)
spécifique
Activité
(AT)
totale
Unité : nkat/ml Ez
Unité :nkat/mg prot
Unité :nkat.
1-Extrait brut
100
500
200
0,4
20000
2- Précipitation au
sulfate
d’ammonium
50
8
16
2
800
3-Chromato 1
5
5
100
20
500
4-Chromato 2
5
2
80
40
400
b- donner la formule générale permettant de calculer le rendement de chaque étape de purification
Rdt = (AT étape n+1/ AT étape n) x 100 ou (AT étape n/AT extrait brut)x100
c- donner la formule générale permettant de calculer l’enrichissement en enzyme à chaque étape de
purification
c’est le facteur de purification : Fp
Fp = AS étape n+1/ AS étape n ou AS étape n+1/AS extrait brut
d- Quelle étape du protocole de purification est responsable de la plus grosse perte en enzyme ?
Justifier votre réponse par le calcul.
Il faut calculer la perte après chaque étape en utilisant la formule Rdt = (AT étape n+1/ AT étape n) x
100
Réponse : Etape 2 (précipitation sulfate ammo) : car le rendement à cette étape est très faible. On ne
récupère que 4 % des protéines E
Rdt à cette étape= (800/20000)x100= 4%
e- Quelle étape du protocole de purification a contribué le plus efficacement à la pureté de la
préparation enzymatique ? Justifier votre réponse par le calcul.
Il faut calculer le facteur de purification après chaque étape en utilisant la formule Fp = AS étape
n+1/ AS étape n
Réponse : Etape 3 (chromato 1) : car Fp entre étapes 2 et 3 est de 10, c’est le plus élevé.
f- quelle technique complémentaire utiliseriez-vous pour juger de la qualité du protocole de
purification et de la pureté de l’enzyme ?
technique SDS-PAGE
Question 4
6 pts
a-L’oxydation complète du glucose en CO 2 et H 2 O est une source majeure d’énergie pour les
organismes aérobies. Cette réaction est principalement favorisée par sa large valeur négative de
variation d’enthalpie.
C 6 H 12 O 6 + 6O 2 →
∆H° = -2938 kJ.mol-1
6CO 2 + 6 H 2 O
∆S = +200 J.mol-1
A partir des données ci-dessus, calculer la valeur de la variation d’énergie libre standard de cette
réaction à 37°C.
∆G° = ∆H° - T∆S° = -2938000 – 310x 200 = - 3000 kJ/mol
b-Dans la réaction globale du métabolisme aérobie du glucose, 32 moles d’ATP sont formées à partir
d’ADP, pour chaque mole de glucose oxydée. Calculer la valeur ∆G°’ de cette réaction globale quand
l’oxydation du glucose est couplée à la formation d’ATP
(donnée : ∆G°’ d’hydrolyse de l’ATP à 37°C est -30 kJ.mol-1)
∆G°’= -3000 + (32x30)= -3000 + 960= -2040 kJ/mol
c-Quelle est l’efficacité du processus en terme de % de la variation d’énergie libre capturée sous
forme d’ATP ?
(960/3000 )x100= 32 %
Question 5
9 pts
a. Certaines réactions de la glycolyse sont considérées comme les étapes clé de régulation de cette
voie métabolique.
a1-Indiquer lesquelles. Ecrire les réactions (noms des réactants et noms des enzymes)
Réaction 1 : Glucose + ATP → Glucose-6-P + ADP (Hexokinase ou glucokinase)
Réaction 3 : Fructose-6P + ATP → Fructose-1,6-bisP + ADP (phosphofructokinase)
Réaction 10 : Phosphoenolpyruvate + ADP → Pyruvate + ATP (Pyruvate kinase)
a2-D’un point de vue thermodynamique, quel est l’intérêt de cibler ces réactions pour
réguler cette voie métabolique ?
ce sont les seules étapes avec un ∆G°’très négatif qui fonctionnent donc loin de l’équilibre et qui sont
considérées comme irréversibles
b- La réaction 5 de la glycolyse est appelée « réaction d’interconversion des trioses-phosphates ».
Cette réaction est catalysée par la Triose-phosphate isomérase (TIM), une enzyme dont on dit qu’elle
approche la perfection cinétique.
b1- Ecrire en détail cette réaction (avec les formules semi-développées des réactants).
DHAP ↔ GAP
CH2OP-CO-CH2OH ↔ COH-CHOH-CH2OP
b2- quel est l’intérêt principal de cette réaction ?
Quand le fru1,6-BP est scindé en deux trioses phosphate à l’étape 4, seul le GAP continue dans la
glycolyse. Cette étape a pour but de convertir DHAP en GAP, ainsi les 6C du glucose peuvent
continuer dans la glycolyse
b3- Que signifie le terme « perfection cinétique » pour une enzyme ?
Ce sont des enzymes extrêmement efficaces caractérisées par des valeurs de kcat/Km de l’ordre de
108 à 109 M-1.s-1. Leur efficacité n’est limitée que par la vitesse de diffusion des molécules de E et S
c. Chez l’homme, en condition anaérobie, le pyruvate subit une transformation.
c1. Donner le nom de cette transformation. Ecrire en détail la (ou les) réaction(s) ayant lieu
(noms des réactants et enzyme).
fermentation lactique
Pyruvate + NADH,H+  Lactate + NAD+ (LDH)
c2. Dans quel(s) type(s) cellulaire(s) ou tissu(s) cette réaction a‐t‐elle lieu ?
le GR et le muscle squelettique privé d’O2
c3. Quel est l’intérêt principal de cette réaction ?
régénérer le NAD
c4. Quel est le devenir du produit de la réaction ?
c’est un « déchet » du métabolisme qui peut être recyclé dans la néoglucogenèse
Question 6
6 pts
Chez l’homme, le transfert d'électrons le long de la chaîne respiratoire se fait à partir d'un donneur
d'électrons qui peut être soit le NADH,H+ soit le FADH 2 .
a- Indiquer avec un crayon de couleur, sur le schéma donné en annexe (à joindre à votre copie), le
chemin suivi par les électrons issus de la ré-oxydation du NADH,H+ et compléter les cadres non
remplis.
b- L’ATP synthase est un complexe protéique enzymatique qui permet de produire de l’ATP à partir
d’ADP et de Pi. Indiquer sa localisation cellulaire et quelle est la source directe d’énergie utilisée pour
cette synthèse ?
Membrane interne de la mitochondrie. Utilise l’énergie du gradient de protons généré par la chaîne
respiratoire
Métabolisme microbien – Partie sur 15 points (20 à 30 minutes)
1) Voici 3 molécules azotées : NO 3 -, NH 4 +, NO 2 -. Laquelle est la plus réduite ? la plus oxydée ? à la
fois oxydante et réductrice ? Justifiez chacune de vos réponses en quelques mots, en
mentionnant les formes réduite et/ou oxydée de chacune de ces molécules.
(3 points)
2) Une bactérie anaérobie aérotolérante est-elle capable de respirer l’oxygène ? Même question
pour une bactérie anaérobie facultative ? Justifiez chacune de vos réponses en quelques mots.
(1 point)
3) Deux espèces bactériennes ont été isolées d’un étang riche en sulfure de fer (FeS) et en nitrate
(NO 3 -). Les deux bactéries sont cultivées séparément dans un milieu contenant en particulier,
soit du sulfure de fer 8 mM, du nitrate 2 mM et du CO 2 (milieu FNC), soit du citrate de fer 8 mM,
du nitrate 2 mM et de l’acétate 1.5 mM (milieu FNA).
La bactérie A pousse sur milieu FNA mais
pas sur milieu FNC. Si, au cours de la
croissance, on dose l’acétate (carrés), le fer
ferreux (ronds noirs) et le fer ferrique (ronds
noirs), on observe les résultats présentés
dans la figure ci-contre. Si on remplace
l’acétate par du CO 2 dans le milieu FNA, la
bactérie ne pousse pas ; idem si on
remplace le CO 2 par de l’acétate dans le
milieu FNC.
La bactérie B pousse sur milieu FNC mais pas
sur milieu FNA. Si, dans le milieu FNC, on
remplace le CO 2 par de l’acétate (milieu
FNC*), elle pousse même légèrement plus
vite.
Dans les deux cas, le fait de cultiver les
bactéries à l’obscurité ou à la lumière n’a
aucune influence.
a) Définissez pour chacune des deux bactéries ses types trophiques (chaque réponse doit être
justifiée).
(3 points)
b) En vous basant sur les résultats présentés dans la figure ci-dessus, que pouvez-vous dire
quant au métabolisme de la bactérie A (préciser le devenir ou l’origine de chacun des trois
métabolites dosés) ?
(2 points)
c) Pourquoi la bactérie B pousse-t-elle mieux quand le milieu de culture qui contient de
l’acétate à la place du CO 2 ? Justifiez votre réponse en explicitant le devenir de chacune de
ces deux molécules, et les conséquences de leur utilisation quant à la production des
métabolites précurseurs nécessaires à la croissance bactérienne et au fonctionnement du
métabolisme central.
(3 points)
d) Pourquoi la bactérie A ne pousse-t-elle pas sur milieu FNC* ?
(3 points)
8
Réponses :
1) Voici 3 molécules azotées : NO 3 -, NH 4 +, NO 2 -. Laquelle est la plus réduite ? la plus oxydée ? à la
fois oxydante et réductrice ? Justifiez chacune de vos réponses en quelques mots, en
mentionnant les formes réduite et/ou oxydée de chacune de ces molécules.
(3 points)
La molécule la plus réduite est NH 4 + : elle peut donner ses électrons et être oxydée en nitrite.(1 point)
La molécule la plus oxydée est NO 3 - : elle peut accepter des électrons et être réduite en nitrite.(1 point)
La molécule à la fois oxydante et réductrice est NO 2 -, qui peut être oxydée en nitrate ou
réduite en ammoniaque (ou en N 2 ).
(1 point)
2) Une bactérie anaérobie aérotolérante est-elle capable de respirer l’oxygène ? Même question
pour une bactérie anaérobie facultative ? Justifiez chacune de vos réponses en quelques mots.
(1 point)
Une bactérie anaérobie aérotolérante n’utilise pas l’oxygène mais le tolère car elle est capable
de neutraliser le radical superoxyde.
(0,5 point)
Une bactérie anaérobie facultative est capable de respirer l’oxygène, mais aussi de respirer
d’autres molécules ou de fermenter.
(0,5 point)
3) Deux espèces bactériennes ont été isolées d’un étang riche en sulfure de fer (FeS) et en nitrate
(NO 3 -)…
a) Définissez pour chacune des deux bactéries ses types trophiques (chaque réponse doit être
justifiée).
(3 points)
La bactérie A est :
hétérotrophe (elle ne peut pas utiliser CO 2 comme source de carbone) ;
(0,5 point)
chimiotrophe (elle n‘utilise pas la lumière comme source d’énergie) ;
(0,5 point)
organotrophe (elle peut utiliser l’acétate comme source d’électrons, mais pas le fer
ferreux).
(0,5 point)
La bactérie B est :
autotrophe (elle peut utiliser CO 2 comme source de carbone) ;
(0,5 point)
chimiotrophe (elle n‘utilise pas la lumière comme source d’énergie) ;
(0,5 point)
lithotrophe (elle peut utiliser le fer ferreux comme source d’électrons).
(0,5 point)
b) En vous basant sur les résultats présentés dans la figure ci-dessus, que pouvez-vous dire
quant au métabolisme de la bactérie A (préciser le devenir ou l’origine de chacun des trois
métabolites dosés) ?
(2 points)
9
Au cours de la culture, la concentration en acétate diminue : l’acétate est oxydé, pour
produire des électrons, de l’énergie et des métabolites.
(1 point)
Les électrons sont transférés sur Fe3+, qui est réduit en Fe3+, ce qui explique la diminution
de la concentration en fer ferrique et l’augmentation symétrique de la concentration en
fer ferreux. Donc, la bactérie respire le fer !
(1 point)
c) Pourquoi la bactérie B pousse-t-elle mieux quand le milieu de culture qui contient de
l’acétate à la place du CO 2 ? Justifiez votre réponse en explicitant le devenir de chacune de
ces deux molécules, et les conséquences de leur utilisation quant à la production des
métabolites précurseurs nécessaires à la croissance bactérienne et au fonctionnement du
métabolisme central.
(3 points)
Il est essentiel pour la bactérie de disposer de 12 métabolites carbonés précurseurs,
qu’on trouve dans les trois ensembles de réactions du métabolisme central : glycolyse,
voie des pentoses phosphate, cycle de Krebs.
(1 point)
L’acétate peut entrer dans le catabolisme central au niveau du cycle de Krebs (l’acétate
est converti en acétyl-coA) : une partie des carbones va donc aller dans le « bon » sens,
avec la production de coenzymes réduits (dont la réoxydation engendrera un gradient de
protons, et donc une synthèse d’ATP), mais il faudra également envoyer des carbones en
sens inverse, ce qui coûte de l’énergie.
(1 point)
La génération des 12 métabolites nécessaires à la croissance à partir du CO 2 a un coût
énergétique qui n’est pas compensé par l’entrée de ce métabolite dans le métabolisme
central. Utiliser du CO 2 comme source de carbone coûte donc plus cher à la cellule, et
c’est autant d’énergie qui ne servira pas à la croissance.
(1 point)
d) Pourquoi la bactérie A ne pousse-t-elle pas sur milieu FNC* ?
(3 points)
Visiblement, il ne s’agit pas d’un problème de source de carbone, ni de source
d’électrons, puisque le milieu contient de l’acétate, et qu’on sait que la bactérie peut
utiliser ce métabolite.
(1 point)
Reste donc la question de l’accepteur d’électrons : ici, il n’y a que du nitrate. On peut
donc penser que la bactérie ne sait pas respirer le nitrate.
(1 point)
Une alternative aurait été de fermenter, auquel cas la bactérie aurait légèrement poussé.
Ce n’est pas le cas, donc la bactérie ne sait pas non plus fermenter.
(1 point)
10
N° anonymat:
Amphi:
Annexe : la chaîne respiratoire
H+
H+
H+
Espace
intermembranaire
FADH2
Matrice
Mitochondriale
FAD
½ O2
H2O
NAD+
NADH,H+
H+
H+
H+