Sujet_ET1_2013

BIO241 Examen terminal 1ère session (17 mai 2013) Documents et calculatrices non autorisés 7 pages Notation sur 60 _____________________________________________
PARTIE A
Protéines/Bioénergétique/Enzymologie/Métabolisme
45 pts Question 1 6 pts On dispose d’un mélange de 3 protéines, A, B et C, dont les caractéristiques sont données dans le tableau ci‐dessous. La protéine A est formée de 2 chaînes polypeptidiques (A‐I et A‐II) liées par des ponts disulfure. Protéine MM (g.mol‐1) pHi Protéine A A‐I A‐II Protéine B 80.000 60.000 20.000 40.000 7 5 9 6,8 Protéine C 40.000 4,1 a‐ Le mélange protéique est analysé sur gel de polyacrylamide (SDS‐PAGE) en présence de sodium dodecyl sulfate (SDS). Les échantillons sont traités en présence et en absence de 2‐mercapto‐
éthanol (2‐ME). a1. Rappeler le principe de cette technique, le rôle du SDS et du 2‐mercaptoéthanol. a2. Quel sera le profil électrophorétique du mélange protéique? Reproduire sur votre copie la figure ci‐dessous. Indiquer clairement l’échelle des PM utilisés, le sens de migration et la migration des échantillons protéiques déposés, en respectant la légende. 1 b‐ Etablir un protocole de fractionnement chromatographique permettant de séparer les protéines A, B et C. Justifier le protocole choisi. Question 2 6 pts On dispose d’une série d’enzymes (E1 à E5) spécifiques du même substrat (S) et caractérisées par les paramètres suivants : Enzyme Km (M) Kcat (s‐1) E1 3.10‐3 3.103 E2 2.10‐3 4.103 E3 6.10‐5 6.102 E4 7.10‐3 7.102 E5 2.10‐2 2.104 Laquelle de ces enzymes, utilisée à concentration égale, doit‐on choisir pour obtenir l’activité la plus élevée en présence du substrat (S) à la concentration de : a) : [S] = 10‐6M b) : [S] = 10‐1M Justifier votre réponse. 2 Question 3 12 pts Le tableau ci‐dessous caractérise la purification d’une enzyme E à partir de son tissu d’origine. Trois étapes sont utilisées (précipitation au sulfate d’ammonium suivie de deux étapes chromatographiques). a‐ A partir des valeurs données dans le tableau, indiquer les unités (unités usuelles, vues en cours, TD et TP) utilisées par l’expérimentateur pour déterminer l’AE, AS et AT de ses échantillons. Etape Vol d’extrait Protéines
Activité enzymatique
Activité spécifique Activité totale
(mg/ml) Unité :…………………….. Unité :…………… Unité :………… 500 200
0,4
20 000
2‐ Précipitation au 50 sulfate d’ammonium 8 16
2
800 3‐ Chromatographie 1 5
5 100
20
500 4‐ Chromatographie 2 5
2 80
40
400 (ml) 1‐ Extrait brut 100 b‐ Donner la formule générale permettant de calculer le rendement de chaque étape de purification. c‐ Donner la formule générale permettant de calculer l’enrichissement en enzyme à chaque étape de purification. d‐ Quelle étape du protocole de purification est responsable de la plus grosse perte en enzyme ? Justifier votre réponse par le calcul. e‐ Quelle étape du protocole de purification a contribué le plus efficacement à la pureté de la préparation enzymatique ? Justifier votre réponse par le calcul. f‐ Quelle technique complémentaire utiliseriez‐vous pour juger de la qualité du protocole de purification et de la pureté de l’enzyme ? Question 4 6 pts a‐ L’oxydation complète du glucose en CO2 et H2O est une source majeure d’énergie pour les organismes aérobies. Cette réaction est principalement favorisée par sa large valeur négative de variation d’enthalpie. C6H12O6 + 6O2 → 6CO2 + 6 H2O H° = ‐2938 kJ.mol‐1 So = +200 J.mol‐1 3 A partir des données ci‐dessus, calculer la valeur de la variation d’énergie libre standard de cette réaction à 37°C. b‐ Dans la réaction globale du métabolisme aérobie du glucose, 32 moles d’ATP sont formées à partir d’ADP, pour chaque mole de glucose oxydée. Calculer la valeur G°’ de cette réaction globale quand l’oxydation du glucose est couplée à la formation d’ATP. (donnée : G°’ d’hydrolyse de l’ATP à 37°C est ‐30 kJ.mol‐1) c‐ Quelle est l’efficacité du processus en terme de % de la variation d’énergie libre capturée sous forme d’ATP ? Question 5 9 pts a‐ Certaines réactions de la glycolyse sont considérées comme les étapes clé de régulation de cette voie métabolique. a1. Indiquer lesquelles. Ecrire en détail les réactions (noms des réactants et noms des enzymes). a2. D’un point de vue thermodynamique, quel est l’intérêt de cibler ces réactions pour réguler cette voie métabolique ? b‐ La réaction 5 de la glycolyse est appelée « réaction d’interconversion des trioses‐phosphates ». Cette réaction est catalysée par la triose‐phosphate isomérase (TIM), une enzyme dont on dit qu’elle approche la perfection cinétique. b1. Ecrire en détail cette réaction (avec les formules semi‐développées des réactants). b2. Quel est l’intérêt principal de cette réaction ? b3. Que signifie le terme « perfection cinétique » pour une enzyme ? c‐ Chez l’homme, en condition anaérobie, le pyruvate subit une transformation. c1. Donner le nom de cette transformation. Ecrire en détail la (ou les) réaction(s) ayant lieu (noms des réactants et enzyme). c2. Dans quel(s) type(s) cellulaire(s) ou tissu(s) cette réaction a‐t‐elle lieu ? c3. Quel est l’intérêt principal de cette réaction ? c4. Quel est le devenir du produit de la réaction ? Question 6 6 pts Chez l’homme, le transfert d'électrons le long de la chaîne respiratoire se fait à partir d'un donneur d'électrons qui peut être soit le NADH,H+ soit le FADH2. 4 a‐ Indiquer avec un crayon de couleur, sur le schéma donné en annexe (à joindre à votre copie), le chemin suivi par les électrons issus de la ré‐oxydation du NADH,H+ et compléter les cadres non remplis. b‐ L’ATP synthase est un complexe protéique enzymatique qui permet de produire de l’ATP à partir d’ADP et de Pi. Indiquer sa localisation cellulaire et quelle est la source directe d’énergie utilisée pour cette synthèse. §§§§§§§§§§§§§§§§§§§ PARTIE B : Métabolisme bactérien
15 pts
1) Voici 3 molécules azotées : NO3‐, NH4+, NO2‐. Laquelle est la plus réduite ? la plus oxydée ? à la fois oxydante et réductrice ? Justifiez chacune de vos réponses en quelques mots, en mentionnant les formes réduite et/ou oxydée de chacune de ces molécules. (3 points) 2) Une bactérie anaérobie aérotolérante est‐elle capable de respirer l’oxygène ? Même question pour une bactérie anaérobie facultative ? Justifiez chacune de vos réponses en quelques mots. (1 point) 3) Deux espèces bactériennes ont été isolées d’un étang riche en sulfure de fer (FeS) et en nitrate (NO3‐). Les deux bactéries sont cultivées séparément dans un milieu contenant en particulier, soit du sulfure de fer 8 mM, du nitrate 2 mM et du CO2 (milieu FNC), soit du citrate de fer 8 mM, du nitrate 2 mM et de l’acétate 1,5 mM (milieu FNA). La bactérie A pousse sur milieu FNA mais pas sur milieu FNC. Si, au cours de la croissance, on dose l’acétate (carrés), le fer ferreux (ronds noirs) et le fer ferrique (ronds noirs), on observe les résultats présentés dans la figure ci‐contre. Si on remplace l’acétate par du CO2 dans le milieu FNA, la bactérie ne pousse pas ; idem si on remplace le CO2 par de l’acétate dans le milieu FNC. La bactérie B pousse sur milieu FNC mais pas sur milieu FNA. Si, dans le milieu FNC, on remplace le CO2 par de l’acétate (milieu FNC*), elle pousse même légèrement plus vite. Dans les deux cas, le fait de cultiver les bactéries à l’obscurité ou à la lumière n’a aucune influence. 5 a) Définissez pour chacune des deux bactéries ses types trophiques (chaque réponse doit être justifiée). (3 points) b) En vous basant sur les résultats présentés dans la figure ci‐dessus, que pouvez‐vous dire quant au métabolisme de la bactérie A (préciser le devenir ou l’origine de chacun des trois métabolites dosés) ? (2 points) c) Pourquoi la bactérie B pousse‐t‐elle mieux dans le milieu de culture qui contient de l’acétate à la place du CO2 ? Justifiez votre réponse en explicitant le devenir de chacune de ces deux molécules, et les conséquences de leur utilisation quant à la production des métabolites précurseurs nécessaires à la croissance bactérienne et au fonctionnement du métabolisme central. (3 points) d) Pourquoi la bactérie A ne pousse‐t‐elle pas sur milieu FNC* ? (3 points) 6 7