Corrigé ET1 mai 09

BIO241
Examen terminal 1ère session (26 mai 2009)
Documents et calculatrices non autorisés
ATTENTION : Les parties A et B doivent être traitées sur des copies
séparées
7 pages
Notation sur 100 points
PARTIE A
Sujet I : Cours de Mr M. Robert-Nicoud
(20 points)
La Chymotrypsine – Structure et fonction
1/ Quelle est la réaction catalysée par la chymotrypsine (type de réaction,
nature du substrat, site d’action, produits de la réaction) ?
Décrire (formule développée) la région du substrat reconnue spécifiquement par
l’enzyme.
2/ Quelles sont les caractéristiques de la structure quaternaire de cette enzyme ?
Décrire la structure du domaine qui permet à l’enzyme de reconnaître de façon
spécifique son substrat.
3/ Quels sont les 3 acides aminés impliqués dans la réaction de catalyse au
niveau du site catalytique de la chymotrypsine ?
Donner les caractéristiques des groupements fonctionnels sur les chaînes
latérales de ces acides aminés.
4/ Dans quels types de réactions ces 3 acides aminés sont-ils impliqués lors de la
catalyse ?
Quel est l’acide aminé impliqué dans la formation d’un intermédiaire covalent
enzyme-substrat au cours de la catalyse ?
5/ La chymotrypsine est synthétisée
sous forme d’un précurseur inactif
(chymotrypsinogène).
Quels sont les mécanismes moléculaires impliqués dans l’activation de ce
précurseur ?
Sujet II : Cours de Mme F. Cornillon
(40 points)
On souhaite étudier une nouvelle protéase P isolée du tube digestif d'un insecte
amazonien. Cette protéase existe sous deux formes Pi et Pa ayant des séquences
en acides aminés identiques. Seule la forme Pa possède une activité protéasique.
Pour élucider le mode d'activation de la protéine Pi, inactive en protéine Pa,
active, une expérience à l'aide de DIFP a été réalisée.
La découverte de la neurotoxicité du DIPF (diisopropylphosphofluoridate) a
conduit à utiliser ce réactif comme agent inactivateur d'enzyme. Le DIPF réagit
avec une sérine du site actif, selon la réaction suivante :
1. Les deux protéases Pa et Pi sont incubées séparemment en présence de
enzyme à 37°C, puis dialysées pour éliminer l'excès de
32P-DIPF pendant 30 minutes
réactif radiomarqué. Les deux protéases sont alors analysées par électrophorèse
sur gel de polyacrylamide, en présence de SDS (sodium dodecyl sulfate) avec ou
sans 2-mercaptoéthanol.
a - Après coloration au bleu de Coomassie, la photographie du gel obtenu
donne le résultat suivant :
Piste 1
Piste 2
enzyme
Piste 3
Piste 4
Piste 5
Les marqueurs de poids moléculaire déposés dans la piste 1, sont les suivants
: βgalactosidase 120 000 g.mol-1 ; albumine du sérum de bœuf 70 000 g.mol-1 ;
ovalbumine 42 000 g.mol-1 ; trypsine 25 000 g.mol-1 ; myoglobine 16 000 g.mol-1
; peptone 9 000 g.mol-1.
La protéine Pi est déposée sur les pistes 2 et 3, respectivement en absence et
en présence de 2-mercaptoéthanol. De même, la protéine Pa est déposée sur les
pistes 4 et 5, respectivement en absence et en présence de 2-mercaptoéthanol.
Que pouvez-vous tirer de l'analyse de cette électrophorèse sur le mode
d'activation de la protéine P ? (5 points)
sachant que le 2-mercaptoéthanol réduit les ponts disulfure et que le SDS
dénature les protéines en les chargeant négativement de telle sorte qu'elles
migrent toutes vers l'anode selon leur MM
pistes 2 et 3 : bande à 90 000 g.mol-1. La protéine P sous forme inactive est
formée d'une seule chaine polypeptidique.
Pistes 4 : bande à 90 000 g.mol-1. et 5 : bandes à 60 000 et 30 000 g.mol-1.
La protéine P sous forme active est formée de 2 chaines polypeptidiques reliées
par au moins un pont S-S.
L'activation de Pi en Pa correspond à la rupture d'une liaison peptidique mais
avec maintient dans la forme active des deux chaines par un pont S-S.
b - Après autoradiographie du gel, les bandes radioactives sont révélées sur
un film photosensible par une coloration noire. Le résultat est le suivant :
Piste 1
Piste 2
Piste 3
Piste 4
Piste 5
Compléter votre analyse précédente (question a) de l'électrophorèse, par
l'étude des résultats obtenus par autoradiographie pour affiner vos conclusions
sur le mode d'activation de la protéine P. (5 points)
bandes noires dans les pistes 4 et 5 : seule la protéine sous forme active fixe
le DIFP radioactif ,
c'est une protéase à Ser active comme la chymotrypsine.
Dans la forme inactive, le site actif est inaccessible au DIFP.
bande noire de la piste 5 correspond à la chaine polypeptidique à 30 000
g.mol-1 : le site actif de l'enzyme contenant la ser active se situe sur la chaine à
30 000 g.mol-1
l'activation de l'enzyme par rupture d'une liaison peptidique induit un
changement de conformation rendant accessible le site actif situé sur la chaine à
30 000 g.mol-1
Schéma bienvenu
2. L'étude enzymatique de la protéine P s'effectue sur un substrat artificiel, le
para-nitrophénylacétate (pNPA) dont le produit d'hydrolyse absorbe à 410 nm
avec un coefficient d'extinction molaire à 410 nm de 4 000 M-1.cm-1.
a – Ecrire la réaction catalysée par la protéine P sur le substrat artificiel.
pNPA + H2O
pNP + acétate (1 point)
b – L’extrait enzymatique est trop concentré en activité pour être utilisé en
l’état. Une dilution au 300ème est nécessaire.
Quel sont les volumes respectifs en solution tampon et en extrait enzymatique
que vous devez prendre pour effectuer cette dilution sachant qu'un volume
minimum de 600 µL d'extrait dilué est nécessaire pour la suite de vos manipulations
?
2 µL d'extrait + 598 µL de tampon (1 point)
c - Le protocole expérimental pour mesurer l'activité enzymatique de
l'enzyme P est le suivant. Le spectrophotomètre est programmé pour faire
une cinétique pendant 3 minutes à 410 nm. Le zéro d’absorbance est fait
à 410 nm à l’aide d’1 mL de tampon phosphate de sodium 0,1 M pH 7.
Dans une cuve de 1 mL, 450 µL de tampon phosphate 0,1 M pH 7 et 500 µL de
pNPA à 1 mM sont mis en présence de 50 µL d’extrait enzymatique dilué et
homogénéisés rapidement avant de démarrer la cinétique.
Quelle critique apportez-vous au choix du contenu de la cuve utilisé pour faire le
zéro d'absorbance ?
Il ne contient pas de pNPA et donc ne permet pas de s'affranchir de l'absorbance
éventuelle du pNPA. (1 point)
Le résultat expérimental obtenu est le suivant :
Vo
d – Donner un titre à la courbe expérimentale obtenue et l'annoter. Vous la
rendrez avec votre copie. Commenter la courbe.
Titre : Détermination de la vitesse initiale de 50 µL de protéine P diluée au
1/300, pour une concentration en substrat pNPA de 0,5 mM à pH7,4 et t° 25°C.
A410nm = f(t)
(3 points)
annotations : tangente à l'origine tracée et légendée Vo ; valeur Vo = ∆A/∆t
=(1,2-0,4)/(1-0)= 0,8 min-1
(3points)
commentaires : hyperbole, pente à l'origine nous donne Vo, plateau reflète que
l'équilibre de la réaction est atteint.
(2 points)
e – Donner la définition de l'activité enzymatique en précisant les conditions
expérimentales idéales que l'on choisit pour effectuer sa mesure.
AE ( 1mL d'enzyme, pH optimum, t°optimale, à [Substrat] fixée si possible
saturante) = nbre de nmole de substrat transformé par unité de temps, en
nmol.s-1.mL-1 , ou nkatal.mL-1
(2 points)
f- Calculer l'activité enzymatique de 1mL de l'extrait enzymatique de départ dans
les conditions expérimentales proposées. Détailler vos calculs.
de protéine P diluée au 1/300) = Vo x vol réactionnel =
AE (50 µL
(0,8/4000x1x60)x1.10 -3 = 1/3. 10-8 mol.s-1
AE(1mL de protéine P diluée au 1/300) = AE (50 µL de protéine P diluée au
1/300) x20 = 20/3.10-8 mol.s-1
AE(1mL de protéine P non diluée) = AE(1mL de protéine P diluée au 1/300) x
300 = 20000 nKat.mL-1
(6 points)
Le dosage selon la méthode de Bradford des protéines présentes dans l'extrait
enzymatique est effectué selon le protocole suivant :
A 100 µL d’échantillon protéique dilué, ajouter 1 mL de réactif de Bradford.
Laisser 20 min. à température ambiante.
Lire l’absorbance à 595 nm contre un témoin ne contenant pas de protéines.
g - Donner le contenu du tube témoin.
réactif de Bradford (ou 100 µL de tampon + 1mL de réactif) (1 point)
L'extrait enzymatique est préalablement dilué au 1/10ème.
Les résultats expérimentaux obtenus sont les suivants :
Tube
Tampon phosphate de sodium
0,1 M pH 7 (µL)
Extrait enzymatique dilué (µL)
Réactif de Bradford (mL)
A à 595 nm
1
50
2
50
3
50
4
0
5
0
6
0
50
50
50
100
100
100
1
1
1
1
1
1
0,102 0,098 0,101 0,199 0,200 0,200
h - Quel est l'intérêt de faire plusieurs mesures ?
pour tester la reproductibilité du test (1 point)
i - Calculer la concentration en protéines de l'extrait enzymatique à l’aide de la
courbe d’étalonnage suivante, effectuée avec de la sérum albumine bovine.
Absorbance à 595 nm
0 ,8
0 ,7
0 ,6
0 ,5
0 ,4
0 ,3
0 ,2
0 ,1
0
0
2
4
6
8
10
12
14
16
Masse de SAB (en µg / tube)
pente de la courbe = 0,05 µg-1 / ou lecture sur le graphe (1 point)
moyenne des valeurs d'Abs pour 100 µL = 0,2 (1point)
0,2 / 0,05 = 4 µg dans les 100 µL d'échantillon dilué 1/10 donc 40 µg.mL-1 =
0,04 mg.mL-1 (2 points)
0,4 mg.mL-1 d'extrait non dilué (1point)
j – Donner la définition de l'activité spécifique.
définition : AS = AE(1mL de non dilué) / masse de prot dans 1mL de non dilué
(1 point)
k – Calculer l'activité spécifique de l'extrait enzymatique.
AS = 20000/0,4 = 5 104 nkat.mg-1
(3 points)
PARTIE B
Sujet I : Cours de Mme C. Breton
(20 points)
1- Catabolisme du pyruvate (8 pts)
Chez l’homme, quel est le destin du pyruvate en condition aérobie ?
a) Décrire les différents procédés mis en œuvre dans la cellule (indiquer la
localisation cellulaire) pour récupérer l’énergie métabolique contenue dans la
molécule de pyruvate. Vous pouvez vous aider d’un schéma.
Oxydation complète en CO2 + H2O
Le pyruvate est issu de la glycolyse qui se passe dans le cytosol.
Le pyruvate est ensuite exporté vers la mitochondrie
Les différentes étapes ont lieu dans la mitochondrie
- décarboxylation oxydative du pyruvate
avec production 1 acétyl-CoA, 1NADH,H+, 1 CO2
le groupement acétate de l’acétyl-CoA est ensuite oxydé dans le cycle de
Krebs. Cette oxydation s’accompagne de la formation de 2 CO2, 3
NADH,H+, 1 GTP (ATP), 1 FADH2
- l’énergie contenue dans les coenzymes réduits est récupérée au niveau de
la chaîne respiratoire. Les coenzymes réduits cèdent leurs deux électrons à
un système de transporteurs qui, par une cascade de réactions d'oxydoréduction, amène ces électrons jusqu'à l'accepteur final, qui est l'oxygène
moléculaire. Ce transfert d’e- est couplé à un gradient de protons à travers
la membrane mitochondriale. L’énergie de ce gradient sera récupérée pour
la synthèse d’ATP. Cette synthèse se fait au niveau d’un complexe
enzymatique appelé ATP synthase. La synthèse d’ATP couplée à ce
transport d’électrons est appelée Phosphorylation oxydative.
Production de 3 CO2, 1GTP, 4NADH, 1FADH2 par mole de pyruvate
b) Donner le bilan en ATP de l’oxydation d’une molécule de pyruvate (utiliser les
valeurs hautes de P/O)
Production nette 15 moles ATP / mole de pyruvate
2. Dans la glycolyse et le cycle de Krebs, les réactions de déshydrogénation
utilisent NAD+ comme accepteurs d’électrons. Il y a cependant une exception :
c’est la réaction catalysée par la succinate deshydrogenase qui utilise le
coenzyme lié FAD comme accepteur d’électrons.
Succinate + FAD
'
fumarate + FADH2
A l’aide des potentiels redox standards donnés ci-dessous, expliquez pourquoi le
coenzyme FAD est plus approprié comme accepteur d’électrons. (6 pts)
Fumarate + 2H+ + 2 e- € succinate
FAD + 2H+ + 2 e- € FADH2
NAD+ + 2H+ + 2 e- € NADH,H+
E°’ = 0,030 V
E°’ = 0,029 V
E°’ = -0,320 V
F : 96500 J/V.mol
∆E°’ = E°’(accepteur) – E°’ (donneur)
Dans le cas du NAD+,
∆E°’ = -0,32 -0,031 = -0,351 V
∆G°’ =-2x96500 x(-0,351)= + 67743 J/mol (~+67,7 KJ/mol)
Dans le cas du FAD,
∆E°’ = 0,029 -0,031 = - 0,002 V
∆G°’ = -2 x96500x(-0,002)= + 386 J/mol (~ +0,4 KJ/mol)
réaction très défavorable avec le NAD+ car très endergonique
réaction plus favorable avec le FAD car la valeur ∆G°’ est proche de 0. La réaction procédera
proche de l’équilibre. On peut s’attendre à ce qu’elle soit plus favorable également dans les
conditions cellulaires.
4. A des points clés des voies métaboliques, des enzymes vont agir en véritables
senseurs pour déterminer les besoins momentanés de la cellule et ajuster leur
activité catalytique en conséquence. Citer trois différents moyens pouvant
être mis en œuvre pour moduler (soit en l’augmentant, soit en
l’inhibant) l’activité de ces enzymes de régulation. (6 pts)
Réponses possibles :
- disponibilité des substrats et co-facteurs
- rétro-inhibition de l’enzyme par l’accumulation des produits de la réaction
- régulation génétique (synthèse et dégradation de l’enzyme)
- régulation allostérique (activateur et inhibiteur)
- modification covalente de l’enzyme (phosphorylation, zymogène
- inhibiteurs, activateurs
Sujet II – Cours de Mr Y. Markowicz (20 points)
Les alkylamines à longue chaîne sont des molécules constituées d’une chaîne aliphatique de 10 à 22
carbones liée à un groupement amine : CH3(CH2)xNH2. Présent dans le suif et les huiles végétales, ils
servent d’intermédiaires pour la production de surfactants cationiques ou amphotères, ou comme
agents de flottaison, agents dispersants pour des pigments ou inhibiteurs de corrosion. Dans les eaux
usées, ils s’adsorbent aux boues et se retrouvent concentrés dans les sédiments.
Des chercheurs ont identifié une nouvelle bactérie, Pseudomonas stutzeri ZN6, qui est capable de
cataboliser des alkylamines en anaérobie, donc dans les sédiments. Ils ont tout d’abord regardé si ces
bactéries étaient capables de croître dans différents milieux minimums, contenant de l’acétate ou un
alkylamine, supplémentés – ou non – par différentes molécules, en aérobie ou en anaérobie.
Aérobie
Milieu
minimum
Anaérobie
+ NH3
+ NO3
+ NH3
+ NO3
+ Fe3+
+ SO42-
+ NH3
+ NO3
+ acétate
-
+
-
-
-
-
-
-
+
+ alkylamine
+
+
+
-
-
+
-
-
+
-, pas de croissance ; +, croissance
Une autre expérience a consisté à étudier la croissance et l’évolution des concentrations en acétate,
nitrate et nitrite lors d’une culture en anaérobie de Pseudomonas stutzeri ZN6 dans un milieu
contenant de l’acétate et du nitrate.
Culture en anaérobie de Pseudomonas stutzeri
ZN6 dans un milieu minimum + acétate +
NO3 :
évolution des concentrations en acétate (▪),
nitrate (○) et nitrite (□) dans le milieu de
culture, et de la croissance bactérienne (•).
1) Pouvez-vous expliquer pourquoi la bactérie ne pousse pas en aérobie avec de l’acétate que si
le milieu est supplémenté par de l’ammoniaque, alors que, si on remplace l’acétate par un
alkylamine, elle pousse dans les trois conditions de culture testées ? (4 points)
2) Pouvez-vous expliquer pourquoi la bactérie ne pousse pas en anaérobie avec de l’alkylamine
(ou de l’acétate) qu’on lui donne de l’ammoniaque ou pas, mais pousse si on lui donne
(éventuellement en plus de l’ammoniaque) du nitrate ? (4 points)
3) Pouvez-vous expliquer pourquoi la bactérie ne pousse pas en anaérobie en présence de Fe3+
ou de SO42-, et ce quelle que soit la source de carbone ? Quelle conclusion pouvez-vous tirer
de cela quant à la caractérisation de cette bactérie vis-à-vis de l’oxygène ? (3 points)
4) Pouvez-vous dire ce que reflète, dans la figure, l’aspect des courbes montrant l’évolution de la
concentration en : acétate ? nitrate ? nitrite ? (6 points)
5) Pouvez-vous dire ce qu’il advient de l’azote du nitrite ? (3 points)
Réponses :
1) Pouvez-vous expliquer pourquoi la bactérie ne pousse pas en aérobie avec de l’acétate que si
le milieu est supplémenté par de l’ammoniaque, alors que, si on remplace l’acétate par un
alkylamine, elle pousse dans les trois conditions de culture testées ? (4 points)
Les bactéries ont besoin d’amines pour la biosynthèse des molécules qui nécessitent
un tel groupement (par exemple, les acides aminés). Quand on lui donne de l’acétate
mais pas d’ammoniaque, source naturelle d’amines, la bactérie ne pourra synthétiser
ces molécules, et ne croîtra donc pas.
Par contre, l’alkylamine possède un groupement amine qui permettra de fournir les
amines nécessaires aux biosynthèses.
2) Pouvez-vous expliquer pourquoi la bactérie ne pousse pas en anaérobie avec de l’alkylamine
(ou de l’acétate) qu’on lui donne de l’ammoniaque ou pas, mais pousse si on lui donne
(éventuellement en plus de l’ammoniaque) du nitrate ? (4 points)
On a vu que, quand la source de carbone est l’alkylamine, cette molécule peut
également servir de source d’azote (au même titre que l’ammoniaque), et que, quand la
bactérie pousse sur acétate, elle a absolument besoin d’ammoniaque comme source
d’azote. Si la bactérie ne pousse pas dans ces conditions, c’est que son problème n’est
pas lié à l’absence d’une source d’azote mais à un autre rôle joué par le nitrate.
Or, on sait que le nitrate est un accepteur potentiel d’électrons pour des respirations
anaérobies. Le fait que la bactérie ait besoin de nitrate en anaérobie mais s’en passe en
aérobie confirme que, ici, elle respire le nitrate.
3) Pouvez-vous expliquer pourquoi la bactérie ne pousse pas en anaérobie en présence de Fe3+
ou de SO42-, et ce quelle que soit la source de carbone ? Quelle conclusion pouvez-vous tirer
de cela quant à la caractérisation de cette bactérie vis-à-vis de l’oxygène ? (3 points)
Ces deux molécules sont des accepteurs d’électrons potentiels, mais on voit que la
bactérie ne sait pas les utiliser.
Les bactéries qui ne respirent que l’oxygène et le nitrate appartiennent à la catégorie
des bactéries aérobie stricte.
4) Pouvez-vous dire ce que reflète, dans la figure, l’aspect des courbes montrant l’évolution de la
concentration en : acétate ? nitrate ? nitrite ? (6 points)
La concentration en acétate diminue au fur et à mesure que la biomasse augmente :
l’acétate est catabolisé et sert de source de carbone.
La concentration en nitrate diminue au fur et à mesure que la biomasse et que la
concentration en nitrite augmentent : le nitrate est réduit en nitrite, il sert d’accepteur
pour les électrons issus du catabolisme de l’acétate.
La concentration en nitrite augmente dans un premier temps (production de nitrite via
la réduction du nitrate), puis diminue car le nitrite sert lui aussi d’accepteur d’électrons.
5) Pouvez-vous dire ce qu’il advient de l’azote du nitrite ? (3 points)
On a vu que la bactérie ne pouvait utiliser le nitrate comme source d’azote. Donc, sa
réduction n’est pas assimilatoire mais dissimilatoire : le nitrate est transformé en
nitrite, qui va permettre la production de diazote (N2) qui partira dans l’atmosphère.