Détection à l`ECL

L’électrophorèse des protéines sur gel d’acrylamide
SDS-PAGE (Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel
electrophoresis)
Électrophorèse monodimensionnelle
La technique du gel d'électrophorèse en conditions dénaturantes ("sodium
dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis" ou SDS-PAGE) a été
décrite par Ulrich Laemmli en 1970.
C'est l'une des techniques (et donc l'un des articles) les plus cité(e)s dans la
littérature scientifique :Laemmli, U. K. (1970) "Cleavage of structural proteins
during the assembly of the head of bacteriophage T4” Nature 227, 680 - 685 .
principe
L'électrophorèse a pour but de séparer des molécules chargées au travers d'un
gel (un polymère) sous l'effet d'un champ électrique.
Cette technique permet, entre autre, de :

déterminer le nombre de sous-unités d'une protéine et de déterminer leur
masse molaire respective

d'évaluer le degré de purification d'une protéine

de séparer des protéines pour les révéler par la technique du Western blot (réaction
avec un ou des anticorps)

de séparer des protéines sur des gels bi-dimensionnels (technique de départ en
protéomique), selon 2 paramètres : point isoélectrique (isofocalisation) puis
masse molaire
1ère étape: Préparation de l’échantillon
On fait bouillir un mélange de protéines dans un tampon Tris-glycine en présence :
d'un agent réducteur : le b-mercaptoéthanol qui réduit les ponts disulfures.
 d'un détergent ionique fort : le sodium dodecyl sulfate (SDS) qui enveloppe les
chaînes polypeptidiques des protéines de charges négatives. Ces charges se repoussent et
déplient les chaînes polypeptidiques.
En conséquence :
les protéines sont dénaturées : elles ont perdu leur structure tridimensionnelle native
 les protéines n'ont plus de pont disulfure : elles sont sous une forme monomérique
2ème étape: Préparation du Gel d'électrophorèse
C'est un gel réticulé, obtenu par polymérisation :
d'acrylamide qui forme des chaînes et de bis-acrylamide qui ponte les chaînes
d'acrylamide .
La réaction de polymérisation est :
initiée par la formation de radicaux libres par le persulfate d'ammonium catalysée
par le TEMED (N,N,N',N'-tétramethyl-1-,2-diaminométhane - toxique)
Plus le pourcentage d'acrylamide est élevé, plus la densité des chaînes est élevée et les
mailles du réseau sont serrées.
En conséquence :
 plus le pourcentage d'acrylamide est élevé, moins les molécules volumineuses
peuvent migrer
 une protéine globulaire (assimilable à une sphère) migre d'autant moins que sa
masse molaire est élevée
Pourcentage d'acrylamide
Gamme de séparation en kDa
7,5
45 - 400
10
22 - 300
12
13 - 200
15
2,5 - 100
2ème étape: Préparation du Gel d'électrophorèse
 Le gel est coulé entre des plaques de verre fixées sur un support
et un peigne est enchâssé entre ces plaques.
 Après polymérisation du gel, le peigne est retiré formant ainsi des
puits.
 La taille et le nombre des dents des peignes sont variables ce qui
permet de déposer des volumes allant de 20 µL à 200µL d'échantillon
de protéines à séparer.
 Les plaques de verre contenant le gel polymérisé sont placées dans
une cuve d'électrophorèse.
 Du tampon d'électrophorèse conducteur (électrolytes) est mis dans
la cuve
3ème étape: séparation des protéines en conditions
dénaturantes
 Les échantillons de protéines dénaturées sont déposés dans les puits.
 la migration s'effectue sous l'action d'un champ électrique :voltage :
100 V - 150 V (16 à 20 mA pendant 1 heure)
Séparation des protéines
 Après migration, le gel est démoulé.
 Les protéines sont fixées dans le gel par une solution qui contient du méthanol
et de l'acide acétique qui dénaturent de manière irréversible les protéines dans
les mailles du gel.
 Les protéines sont révélées par une coloration : par exemple avec le bleu de
Coomassie ou le nitrate d'argent (plus sensible).
On obtient différentes bandes pour chaque piste de la figure ci-contre (la flèche
indique le sens de migration).
La masse molaire des protéines est déterminée à l'aide de marqueurs qui sont des
protéines standards de masses molaires connues (piste de droite).
Exemple de marqueurs :
myosine (205 kDa)
b galactosidase (116 kDa)
phosphorylase b (97,4 kDa)
albumine (66 kDa)
Source : E. Jaspard (2004)
ovalbumine (45
kDa)
anhydrase carbonic(29 kDa)
détermination de la masse molaire d’une protéine
La mobilité relative est le rapport :
distance de migration d'une bande
distance de migration du front de migration
La droite : log (masse molaire) = f(mobilité relative) permet de
déterminer la masse molaire d'une protéine inconnue.
Électrophorèse bidimensionnelle
1ère étape: séparation des protéines en fonction de leur charge:
 L’échantillon est dissous dans une solution contenant de mercaptoéthanol (détergent non ionique)
et l’urée (agent dénaturant)
cette solution solubilise, dénature et dissicie les chaines
polypeptidiques sans modifier leur charge.
 L’électrophorèse des protéines se fait dans un tube étroit de gel de polyacrylamide, où un gradient
de PH est établi
 Chaque protéine migre vers la position du gradient correspondant à son point isoélectrique et s’y
immobilise:
focalisation isoélectrique.
À PH élevé la
protéine est
chargée
négativement
À bas PH la
protéine est
chargée
positivement
2ème étape: séparation des protéines en fonction de leur taille:
 Le gel étroit est plongé dans le SDS, puis placé au bord d’un bloc de gel de polyacrylamide-SDS
 Chaque chaine polypeptidique migre pour former une tache séaprée.
technique d’immunoblotting
•
•
•
•
Elle permet de déterminer les caractéristiques des antigènes protéiques
sur des extraits :
- leur présence,
- leur quantité dans les préparations analysées
- leur poids moléculaire en se référant à des marqueurs de poids
moléculaires connus.
•
Elle comporte 6 étapes :
•
1° Etape : Préparation de l’échantillon
•
2° Etape : Séparation des protéines par électrophorèse sur
gel SDS-polyacrylamide
•
3° Etape : Transfert des protéines du gel vers la membrane
•
4° Etape : Blocage des sites de liaisons non spécifiques sur
l’immunoblot
•
5° Etape : Addition de l’anticorps : Ac I
•
6° Etape : Ac II, Détection du complexe Ag-Ac
étape 3: Transfert des bandes protéiques sur une
membrane de nitrocellulose
L’étape 1 et l’étape 2 ont été déjà étudiées au cours du SDS-PAGE
Gel
 Transfert humide

Transfert semi-sec
Feuille de nitrocellulose
ou de nylon chargé ou non
préparation du Transfert des bandes protéiques
sur une membrane de nitrocellulose
Présentation du gel après migration
des protéines
Préparation du transfert
Papier Whatman
Feuille de nitrocellulose
Gel
Transfert humide
Gel
Papier Whatman
Appareil Biorad
Feuille de
Nitrocellulose
Gel
Papier Whatman
Feuille de
Nitrocellulose
Transfert humide
Electrode
+
Electrode Tampon Tris Glycine
25 mM Tris, 190 mM Gly
pH 8.
Transfert 3 h à 150 mA
2,5 mA/cm2
Papier filtre
Support
Gel
Membrane
Appareil Biorad
Transfert toujours sous tension
Transfert semi-sec
Vis de serrage
Papier filtre cathode -
Gel
Membrane
Papier filtre anode +
Support
Transfert 30 mn
2,5 mA/cm2
Appareil de transfert semi-sec
Appareil Millipore
Préparation du transfert
Appareil de transfert semi-sec sous tension
Coloration optionnelle de l’immunoblot (visualisation
des protéines)
•Détermination du poids moléculaire des Ag en comparant sur un
puits voisin la migration des marqueurs de PM connu.
•Nitrocellulose : Rouge ponceau
- coloration labile
- décoloration avec Na Cl 90/00
Étape 4: Blocage des sites de liaisons non
spécifiques
•
Blocage avec des protéines :
– poudre de lait 5%,
– BSA 3%.
•
Traitement par des solutions détergentes :
– Tween 20 0,2%.
Étape 5: Addition de l’anticorps primaire après
décoloration de la feuille
Incubation avec l’anticorps primaire
Étape 6: Addition de l’anticorps secondaire
couplé au traceur
Ig de chèvre dirigées contre les Ig de lapin
(Ces Ig de chèvre sont couplées au traceur
exp: la peroxydase)
Anticorps primaire produit chez le lapin
Etape 7 : Révélation
anticorps primaire et secondaire couplé à une enzyme le plus souvent
-par colorimétrie(La concentration de protéine est évaluée
densitométrie, évaluation de l'intensité de la bande ou
spectrophotométrie).
-par chimiluminescence (la +sensible) ECL
-par autoradiographie
-par fluorescence
soit :
- au DAB
- au 4-Cl 1-N
- à l’ECL
Limite de détection : 1 à 10 ng de protéine
par
par
Étape 7:Révélation de l’activité de la
péroxydase par le DAB (oxydé)
Détection à l’ECL
Chimioluminescence
On ajoute sur le blot un mélange contenant
H2O2, le substrat luminol et un enhancer (activateur).
La PO agit comme un catalyseur pour l’oxydation du luminol.
Ce luminol oxydé émet des photons qui vont impressionner
l’Hyperfilm-ECL, un film photosensible ou une caméra (voir
appareil suivant).
Travailler en cassette dans le noir
Étape 7:Révélation de l’activité PO
Détection à l’ECL
Bilan final: révélation de l’activité PO (péroxydase)
PO
Luminol oxydé
H2O2
2-
2H2O
O2
+
Luminol
+
Enhancer
Photons
Hyperfilm
ECL
Ou caméra
Détection à l’ECL
Appareil Genegnome commercialisé par Syngene
Détection à l’ECL
PC
Caméra
Immunoblott
Détection à l’ECL
Extraits protéiques de cerveau de souris adulte
Avantages de l’ECL Western blotting
• Haute sensibilité (10 fois plus sensible que les
méthodes colorimétriques)
• Détection rapide
– 10 s à 1 mn pour un film,
– 5 à 10 mn pour la caméra
• Faible bruit de fond
• Quantification possible avec une caméra