Caractérisation et mode d`action de la warnéricine RK, un peptide

THÈSE
Pour l’obtention du Grade de
DOCTEUR DE L’UNIVERSITE DE POITIERS
FACULTÉ DES SCIENCES FONDAMENTALES ET APPLIQUÉES
(Diplôme National - Arrêté du 7 août 2006)
Ecole Doctorale : Sciences pour l’Environnement Gay Lussac
Secteur de Recherche :
Aspects moléculaires et cellulaires de la biologie
Présentée par :
Julien VERDON
CARACTÉRISATION ET MODE D’ACTION DE LA
WARNÉRICINE RK, UN PEPTIDE ANTI-LEGIONELLA
Directeur de Thèse : Yann HÉCHARD
Soutenue le 25 Novembre 2009, devant la Commission d’Examen :
Rapporteurs :
Examinateurs :
Mme Sylvie REBUFFAT
Professeur, Muséum National d'Histoire Naturelle, Paris
M. Erick DUFOURC
Directeur de Recherche, CNRS, Université de Bordeaux
Mme Carmen BUCHRIESER
Directeur de Recherche, Institut Pasteur, Paris
M. François VANDENESCH
Professeur, Faculté de Médecine Laennec, Lyon
M. Thierry BERGÈS
Professeur, Université de Poitiers
M. Jean-Marc BERJEAUD
Maître de Conférences, Université de Poitiers
M. Yann HÉCHARD
Maître de Conférences, Université de Poitiers
THÈSE
Pour l’obtention du Grade de
DOCTEUR DE L’UNIVERSITE DE POITIERS
FACULTÉ DES SCIENCES FONDAMENTALES ET APPLIQUÉES
(Diplôme National - Arrêté du 7 août 2006)
Ecole Doctorale : Sciences pour l’Environnement Gay Lussac
Secteur de Recherche :
Aspects moléculaires et cellulaires de la biologie
Présentée par :
Julien VERDON
CARACTÉRISATION ET MODE D’ACTION DE LA
WARNÉRICINE RK, UN PEPTIDE ANTI-LEGIONELLA
Directeur de Thèse : Yann HÉCHARD
Soutenue le 25 Novembre 2009, devant la Commission d’Examen :
Rapporteurs :
Examinateurs :
Mme Sylvie REBUFFAT
Professeur, Muséum National d'Histoire Naturelle, Paris
M. Erick DUFOURC
Directeur de Recherche, CNRS, Université de Bordeaux
Mme Carmen BUCHRIESER
Directeur de Recherche, Institut Pasteur, Paris
M. François VANDENESCH
Professeur, Faculté de Médecine Laennec, Lyon
M. Thierry BERGÈS
Professeur, Université de Poitiers
M. Jean-Marc BERJEAUD
Maître de Conférences, Université de Poitiers
M. Yann HÉCHARD
Maître de Conférences, Université de Poitiers
« Cherchons comme cherchent ceux qui doivent trouver et trouvons comme trouvent ceux qui doivent
chercher encore. Car il est écrit : celui qui est arrivé au terme ne fait que commencer. »
Saint Augustin
Remerciements
Cette étude a été effectuée dans l’équipe de Microbiologie de l’Eau du laboratoire de
Chimie et Microbiologie de l’Eau, UMR CNRS 6008, dirigée par Monsieur le Professeur
Bernard Legube. Je tiens à lui adresser mes sincères remerciements pour m’avoir permis de
réaliser ces travaux au sein de son laboratoire. Merci également à Monsieur le Professeur
Jacques Frère de m’avoir accueilli dans son équipe.
J’adresse tous mes remerciements à Madame Sylvie Rebuffat, Professeur au MNHN
dans l’Unité de Chimie et Biochimie des Substances Naturelles et Monsieur Erick Dufourc,
Directeur de Recherche CNRS à l’Université de Bordeaux, de m’avoir fait l’honneur d’être
rapporteurs de ce travail. Qu’ils trouvent ici l’expression de ma profonde gratitude.
Je remercie également très chaleureusement Madame Carmen Buchrieser, Directeur
de Recherche à l’Institut Pasteur de Paris, Monsieur François Vandenesch, Professeur à
l’Université de Lyon et Monsieur Thierry Bergès, Professeur à l’Université de Poitiers,
d’avoir accepté participer à ce jury de thèse et d’évaluer ce travail.
Je tiens à remercier tout particulièrement mon directeur de thèse, Yann Héchard,
pour m’avoir guidé et soutenu dans mon apprentissage. Merci pour toutes ces discussions
enrichissantes, pour la confiance qu’il m’a accordée et pour sa franchise. Qu’il trouve ici
l’expression de ma reconnaissance.
Je ne sais comment remercier Jean-Marc Berjeaud, alias “JMB”, pour sa
disponibilité, sa patience et son aide. Il m’a appris toutes ses recettes et astuces de biochimie
et m’a transmis ses connaissances notamment en pédagogie. Merci pour son savoir-faire, sa
présence et tous nos échanges scientifiques et personnels (Dieu seul sait s’il y en a eu...). Si
j’en suis là aujourd’hui, c’est en grande partie grâce à lui.
Un grand merci à Christian Lacombe dit Cricri, mon binôme d’enseignement, pour
nos longues discussions scientifiques et pédagogiques. J’espère avoir un jour l’occasion de
lui rendre ce qu’il m’a apporté.
Mes remerciements vont également à toutes les personnes avec lesquelles j’ai eu la
chance de pouvoir collaborer au cours de cette étude, et en particulier Michael Steinert pour
m’avoir mis en contact avec tous les autres collaborateurs, Roland Benz et Elke Maier pour
m’avoir permis d’apprendre la technique des black lipids, Cornélius Faber et Mirjam Falge
pour leur travail sur la RMN ainsi que Heike Bruhn pour m’avoir enseignée la techniques
des liposomes. Je remercie également Tobias Sahr pour avoir pris le temps de faire les
microarrays ainsi qu’à toute l’équipe de Carmen Buchrieser pour leur accueil et leur
gentillesse. Merci également à Thierry Ferreira pour m’avoir lancé sur le chemin des
phospholipides et à Franck Morel pour son aide en cytométrie en flux.
J’exprime mes remerciements à tous les membres du laboratoire de Chimie et
Microbiologie de l’Eau et plus particulièrement à certaines personnes. Merci à Nico, mon
(trop) tardif collègue de bureau. Je ne compte plus tout ce que l’on a pu échanger durant ces
années de thèse et quel bonheur ça a été. Nous avons évolué, “vieilli” ensemble et je pense
qu’on s’en est plutôt bien tiré. Merci à Didi mon jeune padawan. Petit à petit du rang de
maître “Jedi” tu te rapproches et moi, Yoda, de veiller sur toi je continuerai. Que la force
soit avec toi ! Merci à Nono, coéquipier dans la vie et au foot. J’ai beaucoup apprécié ta
franchise légendaire mais aussi tout ce que l’on a partagé ensemble. Merci à Mathieu, le
râleur du labo. Merci pour ces bons moments partagés, au foot ou au labo. Merci à Titi, ma
grande sœur au labo, qui m’a montré pleins d’astuces pour survivre dans cet environnement
hostile. Merci à Jérôme dit « le chimiste » pour nos longues discussions tant scientifiques que
personnelles et les heures passées devant la GC-MS. Reste comme ça, t’es un mec génial !
Je tiens à exprimer mes remerciements à Marie-Claude pour son aide précieuse au
laboratoire, à Karine sans qui je serai toujours enchevêtré dans les problèmes administratifs,
à Christophe pour son aide à la préparation des milieux de culture, à Stéphanie pour ces
bons moments en TP, à Daniel pour le travail en spectrométrie de masse et pour ses
imitations de Véro. Merci également pour le partage de votre bonne humeur dans les
moments difficiles.
Un grand merci aux stagiaires que j’ai encadré et qui ont du me supporter pendant
leur passage au labo, Didi (encore !!!), Vanessa (ma gothique préférée), Mathieu (la
curiosité incarnée), Céline (le pessimisme incarnée), Romain (dit « le boulet ») et tous les
étudiant(e)s avec qui j’ai partagé souvent plus que des heures de cours.
Merci à tous les moniteurs de ma promo qui restera de loin la meilleure promo du
CIES centre. Marc, Adeline, Fred & Arnaud, Romain, Soizic, EG, Marie, Marie-laure, Alex
et tous les autres, merci pour toutes ces soirées et ces bons moments qui représentent quelque
chose d’inestimable à mes yeux.
Merci également aux thésards (ou récents docteurs !) qui m'ont accompagnés depuis 3
ans, surtout au sein de notre regrettée ADBEP. Merci à Domi (courage, c’est presque la fin),
Ludi, Fred, Manu (et sa petite famille) et tous les autres
Mention particulière à Sylvain et lulu (dit bibou et mimou) qui, au fil des galères, sont
devenus des gens très important à mes yeux et avec qui j’ai partagé beaucoup de choses dont
un goût prononcé pour le pédalo. Merci à vous deux pour ce que vous êtes.
Je tiens également à remercier Karline, mon doudou, et ma famille, notamment mes
parents, mes sœurs, qui ont supporté mes “sautes d’humeur”, ainsi que mes ami(e)s, Flo,
Manu, Sylvain et tous les autres en particulier pour leur présence et leur soutien durant ces 3
années. Merci à tous les membres du club de foot de Savigny (jeunes et anciens) pour les bons
moments passés ensemble et les efforts fournis tous les weekends.
Enfin, j’adresse mes remerciements à l’AFSSET et au Ministère de l’Enseignement
supérieur et de la Recherche pour leur soutien financier sans lequel cette thèse n’aurait pu se
faire ainsi qu’au CIES centre pour leurs formations enrichissantes dans le cadre de mon
monitorat.
Sommaire
Liste des abréviations................................................................................................................. 1
Liste des Figures ......................................................................................................................... 3
Liste des Tableaux ...................................................................................................................... 5
INTRODUCTION GENERALE.......................................................................................... 7
Partie 1. Etude bibliographique ............................................................................... 11
Chapitre I.
Peptides Antimicrobiens........................................................................ 13
I.1
Généralités................................................................................................................. 13
I.2
Peptides antimicrobiens produits par les invertébrés et les vertébrés ........................ 14
I.2.1
Les peptides en hélice α amphiphile ...................................................................................... 15
I.2.2
Les peptides en feuillet β stabilisés par des ponts disulfures ................................................ 17
I.2.3
Les peptides riches en acides aminés particuliers.................................................................. 17
I.2.4
Les peptides dérivés de larges protéines ............................................................................... 17
I.3
Peptides antimicrobiens produits par les bactéries ..................................................... 18
I.3.1
Peptides antimicrobiens produits par les bactéries à Gram négatif ...................................... 18
I.3.2
Peptides antimicrobiens produits par les bactéries à Gram positif........................................ 19
I.3.3
Classe I : Lantibiotiques .......................................................................................................... 20
I.3.3.1
Classe II : Peptides thermiquement stables et non modifiés............................................. 21
I.3.3.2
Classe III : Protéines thermosensibles................................................................................ 21
I.3.3.3
Classe IV: Bactériocines cycliques ...................................................................................... 22
I.3.4
Peptides antimicrobiens produits par les bactéries du genre Staphylococcus ...................... 22
♦ Publication 1 : δ‐hemolysin, an uptade on a membrane‐interacting peptide...................... 22
I.3.4.1
Peptides antimicrobiens produits par les staphylocoques coagulase positif .................... 29
I.3.4.2
Peptides antimicrobiens produits par les staphylocoques coagulase négatif ................... 30
1 I.3.4.2.1
Peptides antimicrobiens produits par S. warneri ....................................................... 30
I.3.4.2.2
Peptides antimicrobiens produits par S. epidermidis ................................................. 32
Chapitre II.
Mécanismes d’action et résistance........................................................ 35
II.1
Généralités................................................................................................................. 35
II.2
Bases structurales de l’activité des peptides antimicrobiens ....................................... 35
II.2.1
Hélicité (α) .............................................................................................................................. 36
II.2.2
Charge (Q)............................................................................................................................... 37
II.2.3
Hydrophobicité (H) ................................................................................................................. 38
II.2.4
Amphiphilie et moment hydrophobe (µ) ............................................................................... 39
II.2.5
Angle polaire (Ф) .................................................................................................................... 40
II.3
Mécanismes d’actions des peptides antimicrobiens.................................................... 41
II.3.1
Interactions initiales peptide/enveloppe ............................................................................... 41
II.3.1.1
Interactions non spécifiques ............................................................................................. 41
II.3.1.2
Interactions spécifiques .................................................................................................... 45
II.3.2
Perturbation de la membrane cytoplasmique ....................................................................... 45
II.3.2.1
Modèle du tonneau (barrel‐stave model)......................................................................... 47
II.3.2.2
Modèle du pore torique (toroïdal pore) ........................................................................... 47
II.3.2.3
Modèle du tapis (carpet model)........................................................................................ 49
II.3.2.4
Modèle detergent‐like ...................................................................................................... 51
II.3.3
Perturbation du fonctionnement de la cellule ....................................................................... 52
II.3.3.1
Inhibition de la synthèse du peptidoglycane .................................................................... 53
II.3.3.2
Inhibition de fonctions intracellulaires ............................................................................. 54
II.4
Mécanismes de résistances......................................................................................... 55
II.4.1
Dégradation protéolytique des peptides antimicrobiens....................................................... 56
II.4.2
Mécanismes de piégeage ....................................................................................................... 57
II.4.3
Transport actif des peptides antimicrobiens.......................................................................... 57
II.4.4
Modifications des propriétés de surface................................................................................ 58
2
Chapitre III.
III.1
Legionella.............................................................................................. 61
Généralités................................................................................................................. 61
III.1.1
Historique ............................................................................................................................... 61
III.1.2
Taxonomie .............................................................................................................................. 61
III.1.3
Morphologie et caractères biochimiques............................................................................... 62
III.1.4
Analyse génomique ................................................................................................................ 63
III.2
Écologie...................................................................................................................... 64
III.2.1
Interaction avec un biofilm..................................................................................................... 64
III.2.2
Interaction avec des protozoaires .......................................................................................... 66
III.3
La légionellose............................................................................................................ 69
III.3.1
Sources de contaminations .................................................................................................... 69
III.3.2
Symptômes............................................................................................................................. 70
III.3.3
Épidémiologie......................................................................................................................... 70
III.3.4
Traitements ............................................................................................................................ 72
III.4
Enveloppe de Legionella ............................................................................................. 73
III.4.1
Lipopolysaccharide ................................................................................................................. 73
III.4.2
Peptidoglycane ....................................................................................................................... 74
III.4.3
Phospholipides membranaires ............................................................................................... 75
III.4.3.1
Structure .......................................................................................................................... 75
III.4.3.2
Biosynthèse...................................................................................................................... 77
III.4.4
Acides Gras ............................................................................................................................. 79
III.4.4.1
Structure .......................................................................................................................... 79
III.4.4.2
Biosynthèse...................................................................................................................... 82
III.4.5
Quinones isoprénoïdes........................................................................................................... 85
III.4.5.1
Structure .......................................................................................................................... 85
III.4.5.2
Quinones bactériennes .................................................................................................... 87
3
Molécules à activité anti‐Legionella............................................................................ 87
III.5
III.5.1
Agents de désinfection ........................................................................................................... 88
III.5.1.1
Agents oxydants............................................................................................................... 88
III.5.1.2
Agents non oxydants........................................................................................................ 89
III.5.2
Molécules biologiques anti‐Legionella ................................................................................... 89
Partie 2. Matériel et Méthodes ............................................................................... 91
Chapitre I.
Techniques de microbiologie ................................................................. 93
I.1
Souches bactériennes ................................................................................................. 93
I.2
Milieux de culture ...................................................................................................... 94
I.2.1
Culture de Legionella.............................................................................................................. 94
I.2.2
Culture de S. warneri RK......................................................................................................... 94
I.2.3
Culture des autres souches bactériennes............................................................................... 95
I.2.4
Culture d’amibes .................................................................................................................... 95
I.2.5
Culture de cellules THP‐1........................................................................................................ 95
I.3
Evaluation de l’activité antimicrobienne et hémolytique ............................................ 95
I.3.1
Détermination de la concentration minimale inhibitrice ....................................................... 95
I.3.2
Détermination de la perméabilisation membranaire............................................................. 96
I.3.3
Détermination du pouvoir hémolytique................................................................................. 96
Chapitre II.
II.1
Techniques séparatives et analytiques .................................................. 99
Étude des protéines.................................................................................................... 99
II.1.1
Préparation d’extrait brut du surnageant de S. warneri RK ................................................... 99
II.1.2
Chromatographie d’affinité pour l’hydroxyapatite ................................................................ 99
II.1.3
Chromatographie en phase liquide ...................................................................................... 100
II.1.3.1
Chromatographie d’interaction hydrophobe.................................................................. 100
II.1.3.2
Chromatographie liquide haute performance en phase inverse .................................... 100
II.1.4
Spectrométrie de masse ESI‐MS........................................................................................... 100
4
II.1.5
II.2
Dosage des peptides............................................................................................................. 100
Étude des lipides ...................................................................................................... 101
II.2.1
Extraction des lipides totaux ................................................................................................ 101
II.2.2
Analyse des acides gras par GC‐MS ...................................................................................... 102
II.2.3
Analyse des phospholipides par chromatographie sur couche mince ................................. 102
II.2.4
Dosage des phospholipides .................................................................................................. 103
Chapitre III.
Techniques de biologie moléculaire......................................................105
III.1
Extraction plasmidique ............................................................................................. 105
III.2
Bactéries compétentes ............................................................................................. 105
III.3
Électroporation ........................................................................................................ 106
III.4
Extraction d’ARN ...................................................................................................... 106
III.5
Microarrays .............................................................................................................. 107
Chapitre IV.
Techniques de biophysique...................................................................109
IV.1
Technique des black lipids ........................................................................................ 109
IV.2
Dichroïsme circulaire et RMN ................................................................................... 110
Partie 3. Résultats ......................................................................................................... 111
Chapitre I.
I.1
Purification et activités biologiques de la warnéricine RK.....................113
Publication 2 : Characterization of anti‐Legionella activity of warnericin RK and delta‐
lysin I from Staphylococcus warneri............................................................................................. 113
I.2
Résultats complémentaires ...................................................................................... 117
I.2.1
Suivi de croissance de L. pneumophila ................................................................................. 117
I.2.2
Suivi de production de la warnéricine RK............................................................................. 117
I.2.3
Activité inhibitrice de la warnéricine RK............................................................................... 121
I.2.4
Activité cytotoxique de la warnéricine RK............................................................................ 122
5
Chapitre II.
II.1
Mode d’action de la warnéricine RK .....................................................125
Publication 3 : Detergent‐like activity and α helical structure of warnericin RK, an anti‐
Legionella peptide....................................................................................................................... 125
II.2
Résultats complémentaires ...................................................................................... 129
II.2.1
Relation entre perméabilisation et viabilité ......................................................................... 129
II.2.2
Activité inhibitrice de la mélittine ........................................................................................ 131
II.2.3
Action de la warnéricine RK et de la δ‐hémolysine I sur des cellules adhérées ................... 132
Chapitre III.
III.1
Analyse de l’enveloppe de L. pneumophila...........................................135
Publication 4 : Fatty acid composition relationships with resistance to warnericin RK, an anti‐Legionella peptide........................................................................................................... 135
III.2
Résultats complémentaires ...................................................................................... 139
III.2.1
Activité de perméabilisation de détergents sur la souche adaptée ..................................... 139
III.2.2
Activité hémolytique de la warnéricine RK en présence de phospholipides........................ 141
III.2.3
Analyse de la composition en phospholipides de L. pneumophila....................................... 143
III.2.4
Modifications de la composition de l’enveloppe ................................................................. 144
III.2.4.1
Résistance de mutants de L. pneumophila à la warnéricine RK..................................... 145
III.2.4.2
Inhibition de la biosynthèse des acides gras à longue chaîne........................................ 147
III.2.4.2.1
Analyse des effets de la cérulénine sur la composition en acide gras de L. pneumophila ................................................................................................................................ 148
III.2.4.2.2
Activité de la warnéricine RK en présence de cérulénine ...................................... 150
Partie 4. Discussion ...................................................................................................... 153
CONCLUSION GENERALE ET PERSPECTIVES .................................................... 161
Références bibliographiques.................................................................................................. 167
Annexes .................................................................................................................................. 195
Curriculum Vitae..................................................................................................................... 215
6
Liste des abréviations
aa : Acides aminés
agr : « Accessory gene regulator »
ACN : Acétonitrile
BCA : Acide bicinchoninique
BCYE : « Buffered charcoal yeast extract »
BHI « Brain heart infusion »
BYE « Buffered yeast extract »
CCM : Chromatographie sur couche mince
CL : Cardiolipide
CMI Concentration minimale inhibitrice
Da : Dalton
DCM : Dichlorométhane
DO600nm : Densité optique à 600 nm
DMPC : « Dimyristoylphosphatidylcholine »
DPPC : « Dipalmitoylphosphatidylcholine »
DPhPC : « Diphytanoylphosphatidylcholine »
EB : Extrait brut
EDTA : Acide éthylène diamine tétra acétique
EGCG : Épigallocatechine gallate
ESI-MS : Spectrométrie de masse en électrospray
FAS : « Fatty acid synthase »
GC-MS : Chromatographie gazeuse couplée à un spéctromètre de masse
GFP : « Green fluorescent protein »
INH : Isoniazide
IP : Iodure de propidium
IP50 : Indice de perméabilisation à 50%
HPLC : Chromatographie liquide haute performance
LLAP : « Legionella-like amoebal pathogens »
LCME : Laboratoire de Chimie et de Microbiologie de l'Eau
LPS : Lipopolysaccharide
NAG : Acide N-acétyl-glucosamine
1
NAM : Acide N-acétyl-muramique
PA : Acide phosphatidique
pb : Paires de bases
PBS : « Phosphate buffer saline »
PC : Phosphatidylcholine
PE : Phosphatidyléthanolamine
PEG : Polyéthylène glycol
PG : Phosphatidylglycérol
PMA : « Phorbol 12-myristate 13-acetate »
PI : Phosphatidylinositol
POPC : « 1-palmitoyl-2-oleoylphosphatidylcholine »
PS : Phosphatidylsérine
P/L : Peptide/lipide
RMN : Résonnance magnétique nucléaire
rpm : Rotation par minute
RT-PCR « Reverse transcription-polymerase chain reaction »
SARM : Staphylococcus aureus résistant à la méthicilline
SCN : Staphylocoque coagulase négatif
SCP : Staphylocoque coagulase positif
SDS : « Sodium dodecyl sulfate »
SM : Sphingomyéline
TAR : Tours aéroéfrigérante
TBE : Tris-Borate-EDTA
TFA : Acide trifluoroacétique
TLM : Thiolactomycine
UFC : Unité formant colonie
v/v : volume/volume
Caractérisation et mode d’action de la warnéricine RK, un peptide anti-Legionella
2
Liste des Figures
Figure 1 : Rôles biologiques des peptides antimicrobiens impliqués dans la défense immunitaire de
l’hôte...................................................................................................................................................... 15
Figure 2 : Structures tertiaires de peptides antimicrobiens.................................................................... 16
Figure 3 : Hélicité et répartition des régions hydrophobes et hydrophiles dans la structure des peptides
antimicrobiens ....................................................................................................................................... 36
Figure 4 : Représentation en hélice α de peptides antimicrobiens indiquant le moment hydrophobe et
l’angle polaire ........................................................................................................................................ 39
Figure 5 : Enveloppe des bactéries à Gram positif ................................................................................ 42
Figure 6 : Enveloppe des bactéries à Gram négatif ............................................................................... 43
Figure 7 : Structure du LPS bactérien ................................................................................................... 44
Figure 8 : La voie de translocation auto-induite des peptides antimicrobiens à travers la membrane
externe des bactéries à Gram négatif ..................................................................................................... 44
Figure 9 : Modèles de perméabilisation de la membrane par des peptides antimicrobiens................... 46
Figure 10 : Modèle du pore torique désordonné ................................................................................... 48
Figure 11: Modèle du tapis .................................................................................................................... 50
Figure 12 : Modèle detergent-like ......................................................................................................... 51
Figure 13 : Cibles des peptides antimicrobiens ..................................................................................... 53
Figure 14 : Mécanismes de résistance des bactéries aux peptides antimicrobiens ................................ 56
Figure 15 : Voie d’aminoacylation ARNt-dépendante du phosphatidylglycérol membranaire chez S.
aureus .................................................................................................................................................... 59
Figure 16 : Développement et relarguage de Legionella dans un système de distribution d’eau.......... 65
Figure 17 : Cycle de vie et d’infection de L. pneumophila ................................................................... 67
Figure 18 : Evolution du nombre de cas de la légionellose en France entre 1988 et 2008 ................... 71
Figure 19 : Structure des principaux phospholipides bactériens ........................................................... 76
Figure 20 : Voie de biosynthèse des phospholipides chez E. coli ......................................................... 78
Figure 21 : Structures des acides gras au sein des phospholipides membranaires et leur rôle dans la
fluidité membranaire ............................................................................................................................. 80
Figure 22 : La voie de biosynthèse de type II des acides gras bactériens ............................................. 83
Caractérisation et mode d’action de la warnéricine RK, un peptide anti-Legionella
3
Figure 23 : Structures des principaux groupes de quinones isoprénoïdes ............................................. 86
Figure 24 : Courbes étalons des standards de phospholipides............................................................. 103
Figure 25 : Carte du plasmide pLAW330 et du transposon Tn903dIIlacZ ......................................... 105
Figure 26 : Principe de la technique des black lipids .......................................................................... 109
Figure 27 : Croissance de L. pneumophila Lens ................................................................................. 117
Figure 28 : Croissance de S. warneri RK à 37°C ................................................................................ 118
Figure 29 : Cinétique de production de la warnéricine RK suivie par chromatographie HPLC/UV en
phase inverse ....................................................................................................................................... 119
Figure 30 : Activité de la warnéricine RK sur des cellules THP-1 différenciées ................................ 123
Figure 31 : Activité de la warnéricine RK sur des trophozoïtes d’Acanthamoeba sp. ........................ 124
Figure 32 : Corrélation entre le pourcentage de cellules IP- et le nombre d’UFC/ml ......................... 130
Figure 33 : Action de la warnéricine RK et de la δ-hémolysine I sur des cellules de L. pneumophila
GFP adhérées....................................................................................................................................... 133
Figure 34 : Perméabilisation induite par différents détergents sur L. pneumpohila Lens WT et adaptée
............................................................................................................................................................. 140
Figure 35 : Analyse des phospholipides par chromatographie sur couche mince monodimensionnelle
............................................................................................................................................................. 143
Figure 36 : Activité inhibitrice de la warnéricine RK contre L. pneumophila Corby ......................... 145
Figure 37: Activité inhibitrice de la warnéricine RK contre L. pneumophila Philadelphia ................ 146
Figure 38 : Structure de la cérulénine et action sur FabB ................................................................... 147
Figure 39 : Croissance de L. pneumophila Lens en présence de différentes concentrations de
cérulénine ............................................................................................................................................ 148
Figure 40 : Activité inhibitrice de la warnéricine RK contre L. pneumophila en présence de cérulénine
............................................................................................................................................................. 151
Caractérisation et mode d’action de la warnéricine RK, un peptide anti-Legionella
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Liste des Tableaux
Tableau 1 : Classification des bactériocines produites par les bactéries à Gram positif ....................... 20
Tableau 2 : Peptides antimicrobiens produits par Staphylococcus et leur spectre d’activité ................ 28
Tableau 3 : Composition en acides gras de L. pneumophila dans différentes conditions de culture .... 82
Tableau 4 : Enzymes identifiées du système FAS de type II ................................................................ 84
Tableau 5 : Composition en ubiquinone de 23 espèces de Legionella .................................................. 85
Tableau 6 : Souches bactériennes utilisées au cours de l’étude ............................................................ 93
Tableau 7 : Concentration des peptides purifiés dans le surnageant de culture de S. warneri RK ..... 120
Tableau 8 : Activité inhibitrice de la warnéricine RK ......................................................................... 122
Tableau 9 : Activité inhibitrice de la mélittine .................................................................................... 132
Tableau 10 : Activité hémolytique de la warnéricine RK en présence de phospholipides.................. 142
Tableau 11 : Pourcentage relatif des phospholipides des souches sauvage et adaptée de L. pneumophila
............................................................................................................................................................. 144
Tableau 12 : Influence de la cérulénine sur la composition en acides gras de L. pneumophila Lens . 149
Caractérisation et mode d’action de la warnéricine RK, un peptide anti-Legionella
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Caractérisation et mode d’action de la warnéricine RK, un peptide anti-Legionella
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INTRODUCTION GENERALE
Caractérisation et mode d’action de la warnéricine RK, un peptide anti-Legionella
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Caractérisation et mode d’action de la warnéricine RK, un peptide anti-Legionella
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Au laboratoire de Chimie et de Microbiologie de l’Eau (LCME), l’une des
thématiques de recherche est axée sur l’étude de composés actifs contre Legionella, l’agent
responsable de la légionellose. C’est une bactérie d’origine hydrotellurique retrouvée aussi
bien dans les environnements naturels (lacs, rivières) que dans les environnements artificiels
(tours aéroréfrigérantes, réseaux d’eau chaude sanitaire…). Elle possède un mode de vie
parasitaire, se développant au sein de protozoaires tels que les amibes et, de manière
opportuniste, à l’intérieur des macrophages alvéolaires. L’inhalation d’aérosols contaminés
par ce germe est la voie de contamination humaine avérée. Depuis la première épidémie de
légionellose référencée à Philadelphie en 1976, de nombreuses autres épidémies se sont
déclarées partout dans le monde. Cependant, la mise en place de meilleurs outils de détection
et de diagnostic a permis de limiter le nombre de cas et d’améliorer le taux de survie des
patients. Malgré tout, la légionellose reste un problème de santé publique d’actualité avec,
chaque année en France, environ 1400 cas et un peu plus d’une centaine de décés.
En 2005, une souche bactérienne possédant une activité inhibitrice contre Legionella a
été isolée au LCME. Il s’agit d’un Staphylococcus warneri qui a été nommé Staphylococcus
warneri RK. L’une des molécules responsable de cette activité est un peptide de 22 acides
aminés qui ne possède aucune homologie de séquence avec des peptides déjà décrits dans la
littérature. Ce peptide antimicrobien, nommé warnéricine RK, possède une activité
spécifiquement orientée contre Legionella qui a été brevetée en 2006. Deux autres peptides,
possédant la même activité, ont également été isolés ; il s’agit de deux homologues d’une
exotoxine produite par Staphylococcus, nommée δ-hémolysine. Cette toxine est très étudiée
puisqu’il s’agit d’un peptide hémolytique dépourvue d’activité antimicrobienne. Cette
particularité a conduit les chercheurs à étudier son mode d’action et à le comparer à celui
d’autres peptides à activité antimicrobienne connue tels que la mélittine. C’est la première
fois que des peptides avec une activité spécifique anti-Legionella sont décrits dans la
littérature.
Au regard de l’ensemble de ces données, il nous est apparu que l’étude du mode
d’action de la warnéricine RK, en comparaison de celui de la δ-hémolysine, constituait un axe
de recherche intéressant qui permettrait de comprendre la spécificité d’action de ces peptides.
Cette étude se replace dans un contexte de santé publique. En effet, l’intérêt pour les peptides
antimicrobiens ne cesse de croître dans la mesure où beaucoup pensent qu’ils pourraient
constituer une nouvelle gamme de composés thérapeutiques et ainsi offrir une solution
Caractérisation et mode d’action de la warnéricine RK, un peptide anti-Legionella
9
alternative aux traitements antibiotiques qui engendrent des phénomènes de résistance chez
les microorganismes.
Ainsi, les objectifs de notre étude sont, dans un premier temps, de caractériser les
activités biologiques de la warnéricine RK et, dans un deuxième temps, d’analyser son mode
d’action. Pour cela, la comparaison avec les données bibliographiques sur la δ-hémolysine
devrait permettre de comprendre l’activité spécifique anti-Legionella de ces peptides.
Pour réaliser ces objectifs, nous avons développé trois grands axes de recherche au
cours de cette étude :
♦ Le premier axe a été consacré à la purification de la warnéricine RK et à la
caractérisation de ses activités biologiques. Les résultats obtenus ont permis de déterminer
l’étendue de son spectre d’action contre des souches bactériennes sélectionnées et également
d’évaluer son activité contre L. pneumophila. Les prédictions de structure secondaire réalisées
à partir de la séquence primaire de la warnéricine RK ont orienté les recherches sur un mode
d’action similaire à celui de la δ-hémolysine.
♦ La deuxième axe a consisté à étudier le mode d’action de la warnéricine RK. La
majorité des expériences menées ont été réalisées en collaboration avec trois laboratoires
allemands possédant une expertise dans le domaine de l’intéraction peptide/membrane et dans
lesquels j’ai pu effectuer un stage. Ainsi, l’action de la warnéricine RK a été mesurée sur des
membranes artificielles et sur des membranes naturelles. La structure du peptide dans un
environnement mimant la membrane a été analysée par dïchroïsme circulaire et résonnance
magnétique nucléaire (RMN).
♦ Le troisième axe a été orienté vers l’analyse de l’enveloppe de L. pneumophila et
plus particulièrement vers l’analyse des lipides membranaires. Les outils mis en place au
laboratoire ont permis d’étudier et de modifier la composition en lipides de L. pneumophila
tout en mesurant l’impact de ces changements sur l’action de la warnéricine RK.
Caractérisation et mode d’action de la warnéricine RK, un peptide anti-Legionella
10
Partie 1. Etude bibliographique
Caractérisation et mode d’action de la warnéricine RK, un peptide anti-Legionella
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Caractérisation et mode d’action de la warnéricine RK, un peptide anti-Legionella
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Mon travail de thèse a porté sur la caractérisation et l’étude du mode d’action d’un
peptide antimicrobien produit par Staphylococcus warneri et actif contre les bactéries du
genre Legionella. Ainsi, l’étude bibliographique décrira les peptides antimicrobiens et plus
particulièrement ceux produits par les bactéries du genre Staphylococcus dans un premier
chapitre, le mode d’action des peptides antimicrobiens ainsi que les mécanismes de résistance
mis en place dans un deuxième chapitre et finalement, les bactéries du genre Legionella dans
un troisième chapitre.
Chapitre I.
I.1
Peptides Antimicrobiens
Généralités
La plupart des organismes vivants sont constamment exposés à des pathogènes
potentiellement très dangereux par contact, ingestion ou inhalation. Leur survie dépend d’un
réseau de mécanismes de défense de l’hôte qui comprend plusieurs composantes regroupées
sous le terme d’immunité (Reddy et al., 2004). Durant l’invasion de pathogènes, la première
ligne de défense inclut les mécanismes de la réponse immunitaire innée qui est suivie, chez
les vertébrés, par la réponse immunitaire acquise avec l’activation spécifique des cellules T et
B par des antigènes (Fearon & Locksley, 1996). La réponse immunitaire innée est notamment
basée sur l’action de peptides endogènes, appelé peptides antimicrobiens. Ces molécules sont
universellement distribuées (mammifères, oiseaux, amphibiens, insectes, plantes et
microorganismes) (Nissen-Meyer & Nes, 1997). Les peptides antimicrobiens constituent une
première ligne de défense idéale car leur production est jusqu'à 100 fois plus rapide que celle
des protéines du système immunitaire et leur diffusion est également plus rapide que celle des
protéines et des cellules de l’immunité. Dans la suite de ce chapitre, le terme peptide
antimicrobien fera référence aux composés protéiques de masse moléculaire inférieure à 10
kDa et possédant une activité antimicrobienne reconnue.
Les bactéries produisent également des peptides dont le rôle principal est
probablement de détruire les bactéries en compétition nutritionnelle avec la souche
productrice (Boman, 1996). Le premier peptide antimicrobien découvert est la colicine V,
identifiée par Gratia en 1925, lorsqu’il a démonté l’existence d’une substance inhibitrice pour
E. coli Ф dans le dialysat de milieu de culture d'E. coli V (Cascales et al., 2007). Peu après, la
nisine fût isolée à partir d’une autre bactérie, Lactococcus lactis subsp. lactis (Rogers, 1928).
Caractérisation et mode d’action de la warnéricine RK, un peptide anti-Legionella
13
Il a fallu ensuite attendre un peu moins de soixante années avant la description d’un peptide
antimicrobien produit par un organisme supérieur. Ce fut la cécropine, isolée d’un insecte : le
lépidoptère Hyalophora cecropia (Steiner et al., 1981). Actuellement, plusieurs centaines de
peptides antimicrobiens ont été décrits dans la littérature (Hancock & Chapple, 1999; Reddy
et al., 2004). Le champ d’investigation des peptides antimicrobiens grandit rapidement et, afin
d’améliorer la recherche et l’échange d’informations, plusieurs bases de données ont vu le
jour. Actuellement, il en existe 11 (http://aps.unmc.edu/AP/links.php). Par exemple, l’APD2
(Antimicrobial Peptide Database 2) regroupait, en juin 2009, 1459 séquences relatives à des
peptides antimicrobiens d’organismes supérieurs et de bactéries (Wang et al., 2009)
(http://aps.unmc.edu/AP/main.php). Une autre base de données, l’AMSDb, rassemble la
plupart des séquences de peptides antimicrobiens eucaryotes connues avec 895 séquences
enregistrées (http://www.bbcm.univ.trieste.it/~tossi/pag1.htm) (Tossi & Sandri, 2002).
Les cinquante dernières années ont vu l’utilisation massive des antibiotiques naturels,
semi-synthétiques ou synthétiques aux propriétés antimicrobiennes, dans le traitement
d’infections graves. Cependant, cette ère pourrait arriver à son terme suite à l’augmentation de
la résistance des microoragnismes aux antibiotiques (Hancock, 1997). En 1994,
l’Organisation Mondiale de la Santé a décrété que cette résistance croissante aux antibiotiques
était devenue un problème majeur de santé publique. Ce danger potentiel a amené les
scientifiques à revoir la façon d’utiliser les antibiotiques et à chercher d’autres agents
antimicrobiens dont la structure et le mode d’action, différents de ceux des antibiotiques,
permettraient de pallier à ces phénomènes de résistance. Ainsi, l’intérêt pour les peptides
antimicrobiens n’a cessé de croître depuis quelques années dans la mesure où beaucoup
pensent qu’ils pourraient constituer une nouvelle gamme de composés thérapeutiques
(Hancock & Chapple, 1999).
I.2
Peptides antimicrobiens produits par les invertébrés et les vertébrés
Chez les organismes supérieurs (plantes, insectes, amphibiens, crustacés, oiseaux,
poissons et mammifères), les peptides antimicrobiens font partie de la réponse immunitaire
innée (Zasloff, 2002). Ils jouent un rôle important dans la réponse immunitaire, d’une part en
agissant directement sur les microorganismes pathogènes afin de les éliminer et, d’autre part,
en modulant la réponse, en recrutant et en activant des cellules immunitaires telles que les
monocytes ou les lymphocytes (Figure 1) (Hancock & Sahl, 2006).
Caractérisation et mode d’action de la warnéricine RK, un peptide anti-Legionella
14
Figure 1 : Rôles biologiques des peptides antimicrobiens impliqués dans la défense
immunitaire de l’hôte (Hancock & Sahl, 2006)
La diversité des peptides antimicrobiens est telle qu’il est difficile de les classer
(Zasloff, 2002). Néanmoins, ils sont souvent répartis en quatre grands groupes : les peptides
en hélice α amphiphile, les peptides en feuillet  stabilisé par un ou plusieurs ponts disulfures,
les peptides linéaires riches en acides aminés particuliers et les peptides dérivés de larges
protéines (Boman, 1995; Bulet et al., 2004; Hancock & Sahl, 2006; Tang et al., 1999).
I.2.1
Les peptides en hélice α amphiphile
C’est le groupe de peptides antimicrobiens le plus étudié avec environ 290 peptides
décrits. Ces peptides sont généralement cationiques et possèdent 40% à 60% de résidus
hydrophobes (Tossi et al., 2000). Ils sont de petite taille (inférieure à 40 résidus), ne possèdent
pas de résidu cystéine et possèdent parfois un coude au milieu de la molécule. Ils ne sont
généralement pas structurés en milieu aqueux mais ces peptides adoptent une structure
secondaire caractérisée par la présence d’une ou plusieurs hélices α amphiphiles au contact de
la membrane ou dans un environnement mimant la membrane (en présence de TFE, de
liposomes ou de micelles de SDS par exemple) (Figure 2A) (Brogden, 2005).
Caractérisation et mode d’action de la warnéricine RK, un peptide anti-Legionella
15
Figure 2 : Structures tertiaires de peptides antimicrobiens (d’après (Bulet et al., 2004;
Hancock & Sahl, 2006; Tang et al., 1999)). Structure en hélice α de la magainine 1 (A),
structure en feuillet  de la défensine RK1 du lapin (B), structure en épingle à cheveux de la
thanatine d’insecte (C), structure mixte en hélice α et en feuillet  de la défensine 1 de la
moule (D), structure cyclique de la rhésus θ défensine 1 de primate (E), structure désorganisée
de l’indolicine bovine (F). Les ponts disulfures sont représentés en jaune.
Cette catégorie regroupe des peptides retrouvés chez divers organismes tels que
l’Homme (cathélicidine LL-37), les insectes (cécropines, mélittine), les nématodes (cécropine
P1), les amphibiens (magainines) ou encore les champignons (alaméthicine) (Andersson et
al., 2003; Payne et al., 1970; Raghuraman & Chattopadhyay, 2007; Zanetti, 2004; Zasloff,
1987). Parmi les peptides antimicrobiens cationiques et amphiphiles les plus étudiés, on note
les peptides antimicrobiens isolés d’amphibiens et d’insectes tels que les magainines, les
cécropines, et la mélittine. Ainsi, la mélittine, le composant toxique principal du venin de
l'abeille de miel européenne, Apis mellifera, est un peptide cationique de 26 acides aminés
(aa) qui possède un effet lytique aussi bien sur les cellules procaryotes que sur les cellules
eucaryotes. La région C-terminale (résidus 21-26) est hydrophile en raison de la présence
d'acides aminés chargés positivement tandis que le reste de la molécule (résidus 1-20) est
principalement hydrophobe (Habermann, 1972; Raghuraman & Chattopadhyay, 2007).
Caractérisation et mode d’action de la warnéricine RK, un peptide anti-Legionella
16
I.2.2
Les peptides en feuillet  stabilisés par des ponts disulfures
Dans ce groupe sont retrouvés des peptides cationiques et anioniques (environ 380
peptides) qui contiennent des paires de résidus cystéines qui sont oxydés pour former des
ponts disulfures internes. Les défensines forment les principaux représentants de cette classe
(Brogden, 2005). Le nombre de résidus cystéines est variable (entre 2 et 8) ainsi que leur
appariement ce qui donne naissance à plusieurs types de structures. Il y a les peptides ayant
une conformation en feuillet  avec trois ponts disulfures (la plupart des défensines de
vertébrés) (Figure 2B), ceux qui possèdent une conformation en épingle à cheveux (par
exemple, les brévinines des amphibiens et l’androctonine du scorpion) (Figure 2C) ou encore
les peptides qui adoptent une conformation mélangeant hélice α et feuillet  comme c’est le
cas pour les défensines d’invertébrés et de plantes (Figure 2D) (Bulet et al., 2004). Un
peptide cyclique contenant 3 ponts disulfures (6 cystéines) a été découvert dans les leucocytes
de primate et nommé rhésus θ défensine 1 (RTD-1) (Figure 2E) (Tang et al., 1999).
I.2.3
Les peptides riches en acides aminés particuliers
Une petite famille de peptides linéaires (plus de 40) est caractérisée par la
prédominance d’un ou deux acides aminés. Il y a les peptides riches en tryptophane comme
l’indolicidine isolée de neutrophiles bovins (Figure 2F) (Selsted et al., 1992), les peptides
riches en proline principalement isolés d’insectes (drosocine, pyrrhocoricine) (Otvos, 2002),
les peptides riches en glycine (diptéricine) mais aussi des peptides riches en proline et
arginine comme Bac 5, Bac 7 et les apidaecines (Boman, 1995). Il existe aussi de petits
peptides riches en histidine, les histatines (3-4 kDa) qui sont retrouvés dans les sécrétions
salivaires humaines et de primates (De Smet & Contreras, 2005). La plupart de ces peptides
sont cationiques (Boman, 1995) mais certains sont anioniques à pH neutre comme la
maximine H5 isolée d’amphibiens qui est riche en acides aminés hydrophobes et en acide
aspartique (Lai et al., 2002).
I.2.4
Les peptides dérivés de larges protéines
Ces peptides sont issus du clivage de plus larges protéines et possèdent une activité
antimicrobienne (Brogden, 2005). La buforine I, par exemple, isolée de l’estomac d’une
grenouille asiatique Bufo bufo gargarizans résulte du clivage de la liaison Tyr39-Ala40 de
l’histone 2A par des pepsines (Kim et al., 2000). Un autre exemple est la lactoferricine
Caractérisation et mode d’action de la warnéricine RK, un peptide anti-Legionella
17
bovine, un peptide antimicrobien cationique produit après le clivage de la lactoferrine par une
pepsine gastrique (Ulvatne & Vorland, 2001).
I.3
Peptides antimicrobiens produits par les bactéries
Les peptides antimicrobiens synthétisés par voie ribosomique chez les bactéries sont
des molécules de nature protéique ou partiellement protéique, douées d’une activité
antagoniste vis-à-vis de souches phylogénétiquement proches des souches productrices, ou
occupant les mêmes niches écologiques. Leur synthèse, par voie ribosomique, les différencie
des antibiotiques qui résultent d’un assemblage enzymatique. Deux grands groupes de
peptides antimicrobiens sont distingués avec, d’une part, les peptides antimicrobiens produits
par les bactéries à Gram négatif, représentés par les microcines, et d’autre part, les peptides
antimicrobiens produits par les bactéries à Gram positif, et notamment les peptides
antimicrobiens de bactéries lactiques (Nissen-Meyer & Nes, 1997). La plupart de ces peptides
antimicrobiens sont nommés bactériocines. Le terme bactériocine a été introduit en 1953 par
Jacob et al. lorsqu’ils ont constaté que l’activité inhibitrice décrite en 1925 par Gratia n’était
pas limitée aux Enterobacteriaceae (Cascales et al., 2007).
Dans la suite de l’étude, le terme bactériocine fera référence aux peptides
antimicrobiens produits par les bactéries à Gram positif, lesquelles possédent un gène
d’immunité pour se protéger de l’action antimicrobienne de leur propre peptide (Jack et al.,
1995).
I.3.1
Peptides antimicrobiens produits par les bactéries à Gram négatif
Les peptides antimicrobiens produits par les bactéries à Gram négatif sont représenté
par les microcines (taille inférieure à 10 kDa) produites par des bactéries appartenant à la
famille des Enterobacteriaceae et surtout E. coli (Dirix et al., 2004). Le terme microcine a été
conçu pour distinguer une nouvelle classe de peptides antibactériens des colicines qui sont des
protéines à activité antimicrobienne produites par E. coli (Duquesne et al., 2007).
Les microcines regroupent actuellement 10 peptides qui se répartissent en deux
classes, les microcines de classe I et les microcines de classe II, qui diffèrent l’une de l’autre
de part leur mode d'action (Pons et al., 2002). Les microcines de classe I ciblent des enzymes
intervenant dans la structuration et la synthèse d’ADN/ARN tandis que celles de classe II
interagissent avec les membranes bactériennes.
Caractérisation et mode d’action de la warnéricine RK, un peptide anti-Legionella
18
Les microcines de classe I ont une masse moléculaire comprise entre 1 et 3 kDa et
arborent de nombreuses modifications post-traductionnelles. Elles sont codées par plusieurs
gènes (4 à 7) portés par un plasmide. Le gène d’immunité n’est cependant pas localisé à côté
du gène de structure. Les membres de cette famille sont MccB17, MccC7/C51 et MccJ25
(Duquesne et al., 2007).
Les microcines de classe II nécessitent la présence du gène chromosomique tolC
(codant pour un transporteur membranaire de la membrane externe) pour être fonctionnelles
(Pons et al., 2004). Elles se subdivisent en deux sous groupes, les microcines de classe IIa et
IIb, selon la localisation des gènes. Les microcines de classe IIa (MccV originellement
nommé ColV, MccL et Mcc24) sont codées par 4 gènes plasmidiques ayant une organisation
conservée entre les différentes microcines. Les microcines de classe IIb (MccE492, MccH47,
MccI47 et MccM) sont codées par des gènes chromosomiques, contrairement aux autres
microcines précédemment décrites (Duquesne et al., 2007).
I.3.2
Peptides antimicrobiens produits par les bactéries à Gram positif
La production de peptides antimicrobiens par les bactéries à Gram positif a été
largement étudiée et en particulier les bactériocines produites par les bactéries lactiques. En
effet, au cours des 20 dernières années, les travaux sur ces bactériocines ont été conduits, avec
pour objectif, de développer de nouvelles techniques de protection alimentaire pouvant limiter
la détérioration des aliments et les risques d’infections alimentaires. C’est par exemple le cas
de la nisine qui est le seul peptide antimicrobien autorisé en tant que conservateur alimentaire
(Galvez et al., 2007).
Afin de regrouper les peptides antimicrobiens des bactéries à Gram positif, plusieurs
classifications ont été proposées dans différentes revues (Cotter et al., 2005; Daw & Falkiner,
1996; Diep & Nes, 2002; Hechard & Sahl, 2002; Héchard & Sahl, 2002; Heng & Tagg, 2006;
McAuliffe et al., 2001), toutes inspirées de la classification établie en 1993 par Klaenhammer
pour les bactériocines de bactéries lactiques (Klaenhammer, 1993).
La classification suivante (Tableau 1) est proposée par Bastos et al. (Bastos et al., 2009)
d’après les classifications de Klaenhammer en 1993 et de Heng en 2006 (Heng & Tagg,
2006).
Caractérisation et mode d’action de la warnéricine RK, un peptide anti-Legionella
19
Tableau 1 : Classification des bactériocines produites par les bactéries à Gram positif
(Bastos et al., 2009)
Classification
Caractéristiques
Sous-classe
Exemples
Classe I
(lantibiotiques)
Peptides contenant des acides
aminés modifiés
Type A (linéaire)
Type B (globulaire)
Type C (multicomposant)
Pep5, Epidermine, Nukacine ISK-1
Mersacidine
Staphylococcine C55
Classe II
Peptides contenant des acides
aminés non modifiés
IIa (pediocin-like)
IIb (multicomposant)
IIc (divers)
Pédiocine PA-1
Auréocine A70, Lactacine F
Auréocine A53, Lactococcine A,
Divergicine A
Classe III
Protéines sensible à la chaleur
Type IIIa (bactériolysines)
Type IIIb (non lytique)
Lysostaphine
Helvéticine J
Classe IV
Peptides cycliques
-
Entérocine AS-48
I.3.3
Classe I : Lantibiotiques
Il s'agit de peptides (entre 19 et 38 acides aminés, de masse inférieure à 5 kDa)
contenant des acides aminés inhabituels obtenus par modifications post-traductionnelles. Ces
modifications sont réalisées par déshydratation de la sérine et de la thréonine respectivement
en déshydroalanine et déshydrobutyrine, qui peuvent ensuite former une liaison thioéther avec
la cystéine afin de générer, respectivement, la lanthionine et la β-méthyl-lanthionine. Ces
modifications couvrent entre 24% et 58% du peptide (Willey & van der Donk, 2007). Pour
souligner la présence de ce type inhabituel d'acides aminés, les bactériocines de classe I ont
été nommées lantibiotiques pour lanthionine containing antibiotics (Schnell et al., 1988). La
structure des lantibiotiques varie essentiellement en fonction de la localisation des ponts
établis entre les acides aminés modifiés, ce qui permet de distinguer deux sous-classes. La
sous-classe A est constituée par les lantibiotiques linéaires, et la sous-classe B, par les
lantibiotiques globulaires. En plus de ces deux catégories, des lantibiotiques à deux
composants ont également été identifiés (McAuliffe et al., 2001) et regroupés dans une
troisième sous classe, la sous-classe C (Bastos et al., 2009).
Caractérisation et mode d’action de la warnéricine RK, un peptide anti-Legionella
20
I.3.3.1
Classe II : Peptides thermiquement stables et non modifiés
Cette classe est constituée de peptides (entre 20 et 60 acides aminés) de masse
inférieure à 10 kDa, thermostables et sans modifications post-traductionnelles. Ils sont
généralement synthétisés sous forme de prépeptides. Cette catégorie est la plus largement
représentée et son étude a conduit à la création de trois sous-classes :
♦ Sous-classe IIa : les bactériocines de sous-classe IIa présentent une activité antiListeria et sont caractérisées par une séquence conservée, surnommée motif anti-Listeria,
YGNGVxC (x représentant un acide aminé quelconque) (Ennahar et al., 2000).
♦ Sous-classe IIb : la classe IIb correspond aux bactériocines dont l’activité dépend de
l’action conjuguée de deux peptides non-modifiés. L’un des peptides peut avoir une faible
activité, l’ajout du second permettant une forte augmentation ainsi qu’un élargissement du
spectre d’activité (Nes et al., 1996).
♦ Sous-classe IIc : la sous-classe IIc a d’abord été proposée pour les bactériocines
activées par réduction de groupements thiols (Klaenhammer, 1993) puis elle a été dédiée aux
bactériocines de classe II dont l'export est sous la dépendance du système général de sécrétion
(système Sec). Cependant, il a été montré depuis que les bactériocines activées par réduction
de groupements thiols pouvaient agir avec leur résidu cystéine oxydé et, d’autre part, une
bactériocine de classe IIa, sécrétée selon un mécanisme sec-dépendant a été découverte. Il
s’agit de l’entérocine P (Ennahar et al., 2000). Ceci remet fortement en question la pertinence
de cette classe. Héchard et Sahl (2002) ont proposé de réserver la sous-classe IIc à toutes les
bactériocines différentes des bactériocines de sous-classes IIa et IIb (Hechard & Sahl, 2002).
Cette proposition a été reprise en 2005 par Cotter et al. (Cotter et al., 2005).
I.3.3.2
Classe III : Protéines thermosensibles
Les bactériocines de classe III sont des protéines thermosensibles. Ces bactériocines
sont subdivisées en deux sous-classes selon leur activité : la classe IIIa qui correspond aux
bactériolysines telles que la lysostaphine (Bastos et al., 2009) et la classe IIIb qui correspond
aux bactériocines non lytiques telles que l’helvéticine J (Joerger & Klaenhammer, 1990).
Caractérisation et mode d’action de la warnéricine RK, un peptide anti-Legionella
21
I.3.3.3
Classe IV: Bactériocines cycliques
En 2002, les bactériocines de classe IV correspondaient à des molécules peptidiques
portant une (ou plusieurs) composantes non-protéique, lipidique et/ou oligosaccharidique,
nécessaires à leur activité biologique. Cependant, de telles bactériocines n’ont pas encore été
purifiées avec leur partie glucidique ou lipidique ce qui laisse penser qu’elles n’existent pas
(Riley & Wertz, 2002). Cette quatrième classe regroupe désormais des bactériocines cycliques
telles que l’entérocine AS-48 produite par Enterococcus faecalis subsp. liquefaciens (Bastos
et al., 2009).
I.3.4
Peptides antimicrobiens produits par les bactéries du genre
Staphylococcus
Dans notre équipe, une souche de S. warneri a été isolée sur un critère d’inhibition de
la croissance de la bactérie pathogène Legionella pneumophila (Héchard et al., 2005). Cette
activité antimicrobienne est médiée par au moins une molécule de nature peptidique dont le
spectre d’activité apparaît comme spécifique des bactéries du genre Legionella. La fraction
active contient deux peptides de masse moléculaire respective 2613,8 Da et 2449,4 Da. Une
comparaison avec les masses moléculaires de peptides antimicrobiens déjà décrits dans les
bases de données suggère qu’il s’agit de nouvelles molécules (Hechard et al., 2005; Héchard
et al., 2005). La warnéricine RK a été brevetée en 2006 pour son activité anti-Legionella, sous
la référence WO/2007/077316. De plus, ce brevet fait mention de deux autres peptides à
activité anti-Legionella produits par S. warneri RK : les δ-hémolysine I et II (Héchard &
Berjeaud, 2006).
Les hémolysines (α, , δ et γ) sont des molécules qui possèdent une activité
cytotoxiques sur différentes cellules eucaryotes (Dinges et al., 2000). Elles font parties d’un
ensemble de molécules complétant l’arsenal de virulence des bactéries du genre
Staphylococcus, en plus des facteurs antimicrobiens sécrétés. La δ-hémolysine est un petit
peptide qui se structure en une hélice α amphiphile et qui ne posséde pas ou peu d’activité
antimicrobienne contrairement à d’autres molécules adoptant la même structuration
secondaire telle que la mélittine par exemple (Dhople & Nagaraj, 1993; Kreger et al., 1971).
♦ Publication 1 : δ-hemolysin, an uptade on a membrane-interacting peptide
La revue ci-après regroupe les données récentes concernant la structure, les activités
biologiques et le mode d’action de la δ-hémolysine. Les travaux menés au laboratoire durant
Caractérisation et mode d’action de la warnéricine RK, un peptide anti-Legionella
22
ma thèse ont permis de confirmer la très faible activité antimicrobienne du peptide contre les
bactéries déjà testées dans la littérature mais également de lui découvrir une forte activité
spécifique dirigée contre les bactéries du genre Legionella (voir publication 1 :
Characterization of anti-Legionella activity of warnericin RK and delta-lysin I from
Staphylococcus warneri). La synthèse des données concernant le mode d’action de la δhémolysine s’intègre parfaitement à la compréhension du mode d’action de la warnéricine
RK.
Caractérisation et mode d’action de la warnéricine RK, un peptide anti-Legionella
23
Caractérisation et mode d’action de la warnéricine RK, un peptide anti-Legionella
24
PUBLICATION 1
Revue
δ-hemolysin, an update on a membrane-interacting
peptide
PEPTIDES
2009
Caractérisation et mode d’action de la warnéricine RK, un peptide anti-Legionella
25
Caractérisation et mode d’action de la warnéricine RK, un peptide anti-Legionella
26
Peptides 30 (2009) 817–823
Contents lists available at ScienceDirect
Peptides
journal homepage: www.elsevier.com/locate/peptides
Review
d-hemolysin, an update on a membrane-interacting peptide
Julien Verdon, Nicolas Girardin, Christian Lacombe, Jean-Marc Berjeaud, Yann Héchard *
Université de Poitiers, Laboratoire de Chimie et Microbiologie de l’Eau, CNRS UMR 6008, 40 avenue du recteur Pineau, 86022 Poitiers Cedex, France
A R T I C L E I N F O
A B S T R A C T
Article history:
Received 15 October 2008
Received in revised form 17 December 2008
Accepted 18 December 2008
Available online 27 December 2008
d-hemolysin is a hemolytic peptide produced by Staphylococcus, and it has been studied for nearly 50
Keywords:
Antimicrobial
Pore
Hemolysis
Staphylococcus
Bacteria
Erythrocyte
Detergent
Curvature strain
years. Therefore, it has become a model in the study of peptides interacting with membranes. In this
review, we report some recent findings and compare them with previous works. d-hemolysin is a 26
amino acid peptide, somewhat hydrophobic and presenting a zero net charge. Study of its structure has
shown that d-hemolysin is a-helical and amphipathic, such as many antimicrobial peptides (e.g.
magainin and melittin). However, d-hemolysin had not displayed any reported antimicrobial activity
until a recent publication showed its high potency against Legionella. Its mode of action is based on direct
interaction with target membranes. In accordance with its concentration, d-hemolysin may slightly
perturb a membrane or lead to cell lysis. Peptide charge plays an important role in its interaction with
membranes, as is shown in the study of peptide variants. Some positively charged variants become
highly hemolytic and even active against Escherichia coli and Staphylococcus aureus. Finally, it has
recently been demonstrated that peptide preferentially binds to lipid-disordered domains. It has been
postulated that as a result, enrichment in lipid-ordered domains might increase peptide concentration in
lipid-disordered domains and thereby improve its activity.
ß 2008 Elsevier Inc. All rights reserved.
Contents
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
Introduction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Expression . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Physicochemical properties . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Structure . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
4.1.
Structure in solution . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
4.2.
Structure in membrane mimetic environment . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
4.3.
Three-dimensional structure . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Biological activities . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
5.1.
Hemolytic and other lytic activities . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
5.2.
Antimicrobial activity. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Mode of action . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
6.1.
Action below the threshold concentration . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
6.2.
Action above the threshold concentration . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
6.3.
Influence of membrane lipid composition . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Structure/function relationship studies of d-hemolysin. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Acknowledgements. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
References . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
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1. Introduction
* Corresponding author. Tel.: +33 5 49 45 40 07; fax: +33 5 49 45 35 03.
E-mail address: [email protected] (Y. Héchard).
0196-9781/$ – see front matter ß 2008 Elsevier Inc. All rights reserved.
doi:10.1016/j.peptides.2008.12.017
d-hemolysin, also named d-toxin or d-lysin, is a well-known
peptide produced by various Staphylococcus strains. It was
originally reported in 1947 in strains of Staphylococcus aureus
grown on sheep blood agar [54]. Several d-hemolysin variants
818
J. Verdon et al. / Peptides 30 (2009) 817–823
were later described as being produced by different Staphylococcus
species (e.g. S. epidermis, S. intermedius). d-hemolysin belongs to
the hemolysin family. This family of peptides was discovered in the
late 19th century in a culture of Staphylococcus that showed
hemolytic activity. The latter was initially attributed to ahemolysin but, through neutralization of this peptide, it was
shown that hemolysis is also due to other peptides. Three other
hemolysins, produced by Staphylococcus, were named a-, b- and ghemolysins in the order of their discovery (see Ref. [55] for an early
review). a-hemolysin acts by creating pores in a target membrane;
b-hemolysin presents shingomyelinase C activity; d-hemolysin
permeabilizes the target membrane and g-hemolysin, which is a
two-component toxin, also acts by creating pores [13]. As proteins,
these hemolysins (MW ranging from 26 to 34 kDa) share no
structural similarities with d-hemolysin, which is a 26 amino acid
peptide [16]. This peptide is responsible for erythrocyte lysis and is
likewise active against a wide range of cells and organelles [50].
Unlike many hemolytic peptides, d-hemolysin is poorly active
against bacteria [11]. However, a recent study has shown that dhemolysin does present an anti-Legionella activity [53].
This review is focused on d-hemolysin, as a model peptide in the
study of membrane interactions.
2. Expression
The gene encoding d-hemolysin (hld) is part of the agr
(accessory gene regulator) locus in S. aureus. Interestingly, the
agr locus regulates many virulence genes and has been extensively
studied. The locus consists in five genes (agrBDCA and hld) in two
divergent transcripts, RNA II and RNA III. RNA II encodes agrBDCA
and RNA III encodes hld, the d-hemolysin gene (Fig. 1). AgrC
encodes the histidine kinase and agrA the response regulator of a
two-component regulatory system. AgrD encodes a peptide, which
is maturated and secreted through AgrB. The resulting peptide is an
auto-inducing one, which in turn activates AgrC and AgrA. Once
activated, the response regulator AgrA enhances RNA II and RNA III
expression through their cognate promoter P2 and P3. RNA III not
only encodes hld but also acts as the effector of the agr system. RNA
III regulates expression of various genes at both the transcriptional
and the translational level. RNA III even regulates its own
expression. The translation of RNA III into d-hemolysin is delayed
(1 h) following the appearance of RNA III in mid-exponential
phase. This delay may be due to interaction of the 30 -end of RNA III
Table 1
Natural d-hemolysin variants produced by different Staphylococcus strains.
Peptide name
d-hemolysin
d-lysin
d-toxin
d-lysin-I
d-lysin-II
d-hemolysin
a
Sequencea
Ref.
MAGDIISTIVDFIKLIAETVKKFTK
MAGDIVGTIGEFVKLIIETVQKFTQK
MAADIISTIGDLVKWIIDTVNKFKK
MAADIISTIGDLVKLIINTVKKFQK
MTADIISTIGDFVKWILDTVKKFTK
MAQDIISTIGDLVKWIIDTVNKFTKK
[20]
[49]
[29]
[49]
[49]
[16]
Species
S.
S.
S.
S.
S.
S.
intermedius
simulans
epidermidis
warneri
warneri
aureus
Sequences deduced from genes are in italics.
with the ribosome binding site, consequently blocking access to
ribosomes [3]. In recently published work, inhibition of the rot
transcription factor translation was proposed as a key feature of
agr function [19].
Expression of RNA III and, as a result, of d-hemolysin depends
on bacteria concentration. Accordingly, the agr system is a
quorum-sensing system. The auto-inducing peptide (AgrD)
induces agr locus expression in a cell-density dependent manner.
Thus, d-hemolysin is produced in the late-exponential phase.
3. Physicochemical properties
The first d-hemolysin sequence was obtained by amino acid
sequencing from human isolate of S. aureus [16], and 4 years later,
the first variant of the d-hemolysin family was described [17]. To
date, different d-hemolysins have been described in various
Staphylococcus strains, with slight differences in their sequences
(Table 1). The S. aureus d-hemolysin is a 26 amino acid peptide of
2.9 kDa. Early studies suggested that d-hemolysin was a protein
ranging from 68,000 to 200,000 Da and consisted in at least five
subunits. The molecular weight of the subunit was initially
estimated at approximately 21,000 Da, as determined after
dissociation in nonionic detergents and assayed by sucrose
gradient ultracentrifugation. However, through gel permeation
under denaturating conditions, it came to appear that the
minimum molecular weight for the peptide subunit was
<6000 Da [21].
d-hemolysin does not contain histidine, arginine, proline,
tyrosine or cysteine [16,17,21,24]. The same amino acid composition is also encountered in all d-hemolysin natural homologues
isolated from various species. Only three residues (Ile, Thr and Lys)
account together for about 45% of the total amino acids. The Lys-
Fig. 1. Schematic representation of the staphylococcal two-component regulatory system agr. d-hemolysin gene, hld, is encoded by RNA III, of which the expression is
regulated by the response regulator AgrA.
J. Verdon et al. / Peptides 30 (2009) 817–823
819
4. Structure
concentration domain above 2 mM, tetrameric peptide at 2 mM,
16 monomers at 10 mM, 38 monomers at 60 mM and very
large asymmetrical species at 446 mM (100 monomers).
Decreasing concentrations below 2 mM of d-hemolysin allow
dissociation into monomers and at 0.1 mM concentration, it was
calculated that about 50% of d-hemolysin is monomeric. The
self-associated species are fundamentally a-helical (70%) with a
buried and highly immobilized Trp at position 15. At the lowest
concentration studied, the a-helix content sharply decreases to
35% while tryptophan fluorescence shows that this Trp residue
is exposed to buffer. The authors proposed a structural model
for aggregated species with stacked antiparallel amphipathic
rods (Fig. 2A). Following probing by tryptophan fluorescence of
the environment close to both the hydrophilic and the
hydrophobic faces of d-hemolysin, it was concluded that the
first step of self-association is driven by hydrophobic interactions between apolar faces of a-helices, while further oligomerization gets their polar face involved through electrostatic
interactions [47].
4.1. Structure in solution
4.2. Structure in membrane mimetic environment
An analysis of the secondary structure, by circular dichroism
(CD), concluded that d-hemolysin adopts an a-helical conformation with varying helical content, in aqueous buffer. dhemolysin is partially folded with a-helix content: 42% in water,
45% in methanol, 24% in 6 M urea [9]. The folding is
concentration-dependent: 75% helical at concentrations above
2 mM but only 35% helical at a 0.25 mM concentration [52]. It
displayed spectra characteristics of helical conformation at
1 mM with no discernible concentration dependence in the
range of 1–6 mM [10].
Thiaudiere et al. [52] proposed a general framework for the
behavior of S. aureus d-hemolysin in solution (Fig. 2A). Their
experiments suggest an isodesmic aggregation in the high
FTIR spectroscopy shows that d-hemolysin exhibits predominantly a-helical secondary structure in phosphatidylcholine
bilayers [8,26]. It appears that the peptide retains its helical
conformation in lipid micelles, monolayers, bilayers or discoidal
particles, though its state of aggregation probably differs in each of
these systems. X-ray diffraction studies have shown that, in the
discoidal particles formed at high peptide concentrations, a ring of
d-hemolysin molecules surrounds a disk-shaped lipid bilayer [26].
Discoidal lipid particles were also identified as regards other
amphipathic a-helical peptides such as melittin [15] and glucagon
[41].
Whatever the initial secondary structure in a solution, CD
experiments showed that the d-hemolysin a-helix content is as
high as 78%, 68% or 74% on binding to PC/PS vesicles [52], to PC
liposomes or to PE/PG (3:1) liposomes, respectively [10].
Consistent with the CD experiment results, NMR studies reported
a-helical structure to extend from residues 5 to 23, when bound to
dodecylphosphocholine micelles [25].
Tryptophan fluorescence of d-hemolysin is also sensitive to
binding to lysoPC micelles and the changes in emission lmax are
biphasic; at a lipid/peptide molar ratio below 3, a blue shift
indicates that Trp15 is buried, while further lipid additions induce
partial reexposure of the Trp [52]. At low peptide concentration
(Fig. 2B) in the bilayer, dimers with antiparallel a-helices lie flat at
the interface between acyl chains and polar headgroups of the
lipids, as shown by light scattering and time-resolved fluorescence
spectroscopy experiments [47]. At high peptide concentration
(Fig. 2B), self-association is favored, inducing disruption of the
membrane.
d-hemolysin amphipathic structure accounts for its ability to
form aggregates in water and stable monolayers at the air–water
interface, to bind to membranes, and to be soluble in both water
and organic solvents.
Lys basic doublet seems to characterize the S. aureus and S.
epidermidis d-hemolysins, while the S. intermedius, S. warneri and S.
simulans peptides contain only one C-terminal lysine residue. With
four basic and three acidic residues and a negative C-terminus, S.
aureus d-hemolysin has a zero net charge at neutral pH. S. aureus dhemolysin contains 14 hydrophobic and 4 polar yet nonionizable
amino acid residues. This peptide composition leads to a somewhat hydrophobic peptide. d-hemolysin is soluble in water, in
various buffers, in chloroform–methanol (2:1), methanol and 75%
ethanol but insoluble in chloroform, acetone and ether [24]. dhemolysin is resistant to heat inactivation at 80 8C for 1 h.
Proteolytic enzymes, mainly pronase and trypsin, are potent
inhibitors [24].
d-hemolysin might also present a N-terminal formylmethionine residue, as suggested when comparing the peptide mass
obtained by amino acid sequence and by mass spectroscopy
[16,30,53].
4.3. Three-dimensional structure
Fig. 2. Interaction models for the d-hemolysin in solution or with membranes, in a
concentration-dependent manner. (A) Self-association in aqueous solution. (B) Selfassociation in membrane: at high peptide density in the membrane (top)
transmembrane peptides can border pores or membrane fragments. Light grey
areas indicate the hydrophobic face of the amphipathic helices.
The tri-dimensional structure of the S. aureus d-hemolysin
(Fig. 3) was provided in methanol solution [7,48] and in methanol/
water (2:1) solution [7], by using high resolution NMR. It was
shown that residues 2–20 form a stable helix while the residues at
the carboxyl terminus are unordered [48]. d-hemolysin adopts an
a-helical structure between residues 8 and 22 in methanol and
between residues 5 and 24 in methanol/water, with the terminal
regions being relatively flexible [7].
820
J. Verdon et al. / Peptides 30 (2009) 817–823
6.1. Action below the threshold concentration
Fig. 3. Three-dimensional structure of d-hemolysin. Ribbon representation of a
NMR model structure from the 1DTC PDB file [7]. The figure is drawn using the
DeepView/Swiss-PDBviewer software. Non-polar residues are colored in black.
5. Biological activities
5.1. Hemolytic and other lytic activities
d-hemolysin was detected in strains of S. aureus grown on sheep
blood agar, to which a and b anti-hemolysins were added. dhemolysin has a broader hemolytic range than other hemolysins
secreted by S. aureus [13,55]. Soluble d-hemolysin lysed erythrocytes from horse, rabbit, human, guinea pig, pig, calf, sheep, goat,
cat and chicken [24]. b-hemolysin and d-hemolysin exhibited a
synergistic effect on sheep erythrocytes [24,27].
d-hemolysin not only lyses erythrocytes but also other
mammalian cells, as well as subcellular structures such as
membrane-bound organelles. It also lyses and disrupts, bacterial
protoplasts, spheroplasts, lysosomes and lipid spherules [24].
5.2. Antimicrobial activity
d-hemolysin displays limited or nonexistent antimicrobial
activity against bacteria [11,24]. Only one single strain, B.
megaterium KM, was reported to be sensitive to 63 mg/ml of dhemolysin, and two bacterial strains (M. lysodeikticus and a Group
A Streptococcus C203s) were sensitive at a higher peptide
concentration (500 mg/ml) [24]. However, it was also reported
that d-hemolysin is active against spheroplasts and protoplasts. It
might be hypothesized that the lack of antimicrobial activity is due
to a difference of envelope composition between bacteria and
erythrocyte, such as lipopolysaccharide or cell wall. Thus, the
peptide is unable to perturb the negatively charged bacterial cell
surface and to form channels in the bacterial plasma membrane
[11]. However, d-hemolysin analogues, in which D residues are
replaced by K residues, display antimicrobial activity against E. coli
and S. aureus [10]. This finding confirms the hypothesis that
peptide charge assumes an important role in its antimicrobial
activity.
On the other hand, we recently reported some antimicrobial
activity of d-hemolysins of S. warneri against Legionella [53]. All
tested strains of the Legionella genus were highly sensitive (MIC
3.12 mg/ml) to d-hemolysin, while bacteria from other genus were
resistant at least up to 50 mg/ml. These results showed that while
d-hemolysin might have an antimicrobial activity, it is restricted to
specific bacterial strains or genus, such as Legionella.
6. Mode of action
The mechanism of d-hemolysin action has been widely studied.
At an early date it was reported that interaction of the peptide with
the cell surface accounts for lysis in sensitive erythrocytes [6]. The
speed of cell lysis supports this hypothesis. Since that time, various
studies have purportedly explained the mode of action of dhemolysin or related amphipathic a-helical peptides. Lastly, these
studies demonstrate that d-hemolysin leads to two distinct sets of
events either below or above a threshold concentration
[14,26,31,34]. Obviously, the threshold concentration may vary
with lipid composition of the target membrane and peptide
environment.
At low d-hemolysin concentration, dimers with antiparallel ahelices may lie flat at the interface between acyl chains and the
polar headgroups of the lipids, as shown in a model compatible
with light scattering and time-resolved fluorescence spectroscopy
experiments [47]. This dimerization and orientation has likewise
been shown for other a-helical peptides [4,28]. After interacting
with the membrane, d-hemolysin can aggregate to form pore in
lipid bilayers. According to Mellor et al., two classes of channels are
formed by d-hemolysin in planar lipid bilayers: ‘‘small’’ class
events, with conductance of 70–100 pS and ‘‘large’’ class events,
with conductance of 420–470 pS [31]. The channels are selective
for cations over anions and the level of selectivity is stronger for
‘‘small’’ than for ‘‘large’’ channels. Ion channel formation occurred
at a d-hemolysin concentration of approximately 0.3 mM [31]. The
authors proposed a model for the d-hemolysin channel consisting
in a hexameric cluster. This channel was expected to be cationselective because it was lined by three negatively charged
aspartate residues [31]. However, in a model of d-hemolysin
membrane channels based on crystal structure determination, it
appears unlikely that ‘‘large’’ channels are hexamers [39]. In fact, it
was proposed that ‘‘small’’ channels (70–110 pS) are octamers,
while ‘‘large’’ channels are larger oligomers.
Pokorny et al. have proposed a sinking raft model to explain the
d-hemolysin mode of action [32,34]. Indeed, d-hemolysin induced
a graded dye (carboxyfluorescein) efflux in POPC vesicles and a
lipid flip-flop at the same rate constants as dye efflux [32]. These
findings suggest that dye efflux occurred concomitantly with
peptide translocation as follows. Peptide self-association on the
membrane surface perhaps induced a curvature strain across the
bilayer, thereby disturbing membrane stability. Then, d-hemolysin
may have sunk across the membrane bilayer as a small aggregate,
most likely as a trimer or a tetramer. The authors hypothesized
that peptides might be oriented parallel to the membrane, such as
has been shown with cecropin A in biophysical studies [45]. This
would lead to both dye efflux and lipid flip-flop [34]. Translocation
occurs until equilibrium of peptide concentration across the
membrane is reached. At that point, membrane curvature strain
disappears, peptide translocation occurs only rarely and dye efflux
stops [32–34]. Finally, it is not clear whether d-hemolysin is
inserted in the membrane: in a parallel manner, as suggested by
Pokorny et al.; in a perpendicular manner, as in classical torroidal
pore; or in a disordered manner, as proposed recently for melittin
[44].
6.2. Action above the threshold concentration
Early studies hypothesized that d-hemolysin acts as a
surfactant to disrupt cell membrane [6]. d-hemolysin was shown
to have an effect similar to Triton X-100, i.e. immediate leakage of
large molecules [51]. The addition of small quantities of peptide
(lipid-to-peptide molar ratio 1000/1) had only minor effects on
bilayers. In contrast, increasing the peptide concentration to molar
lipid-to-peptide ratios lower than 125/1 promoted the formation
of two populations of lipid particles, which could be separated by
centrifugation [26]. Small-angle X-ray scattering measurements
confirmed that the pellet consisted in multilamellar vesicles, while
disk-shaped lipid-peptide aggregates were found in the supernatant. The disk-shaped structure was also reported for other
peptides, such as melittin, at high peptide concentration [37].
Although d-hemolysin and melittin have different structures, the
structural parameters of discoidal aggregates remain similar for
both peptides [15]. Several studies have drawn attention to a
detergent-like mode of action, which has recently been reviewed
[5]. They tend to suggest that lytic peptides, like detergents, may
J. Verdon et al. / Peptides 30 (2009) 817–823
have concentration-dependent effects on membrane structure:
inducing bilayer perturbations of long-range order at low peptide
concentrations, and exhibiting a detergent-like solubilization of
the membrane at high peptide concentrations [5].
To summarize, d-hemolysin activity may be modeled, taking
into account the different results described above (Fig. 4). It would
appear that, as with other helical peptides, d-hemolysin displays
concentration-dependent activity. At a low concentration, below
the threshold, d-hemolysin is adsorbed parallel to the membrane
plane (Fig. 4A) and translocates across the membrane as a transient
structure (Fig. 4B). The membrane is weakened by the peptide,
which probably induces a curvature strain. The transient structure
may induce both ionic efflux and lipid flip-flop. At a high
concentration, above the threshold, d-hemolysin induces a
detergent-like solubilization of the membrane, leading to the
formation of disk-shaped structures or micelles (Fig. 4C) and,
finally, cell lysis.
6.3. Influence of membrane lipid composition
As stated above, the mode of action may depend not only on
peptide concentration, but also on lipid composition of the
membrane [5]. Aggregates of d-hemolysin interact strongly with
zwitterionic or negatively charged lipids [52]. The predominant
lipid components in the outer leaflet of eukaryotic membranes are
sphingomyelin, cholesterol and POPC. Raft domains are liquidordered domains, rich in cholesterol and sphingomyelin [40,46],
while POPC is responsible for liquid-disordered domains. Mixtures
821
including these lipids have been shown to exhibit separation
between liquid-disordered and liquid-ordered domains [1,42,43].
Vesicles made with various amounts of these lipids were used so as
to study interaction with d-hemolysin. Fluorescence microscopy
was unable to demonstrate the presence of domains in sphingomyelin/Chol/POPC mixtures. However, fluorescence resonance
energy transfer experiments, associated with Monte Carlo
simulations, have confirmed that domains are actually formed
within this system [18]. It would appear that d-hemolysin binds
strongly to liquid-disordered domains and poorly to cholesterol
and sphingomyelin liquid-ordered raft domains [33,36]. Also, in
these vesicles the rate of carboxyfluorescein efflux, upon dhemolysin treatment, increases as the POPC content decreases. It
has been hypothesized that this rate increased as a consequence of
d-hemolysin concentration increase in liquid-disordered domains.
It was ultimately proposed that d-hemolysin action on eukaryotic
cells may be attributed to the exclusion of the peptide from liquidordered domains rather than to a specific interaction between the
peptide and lipids [33,36]. It has been also shown that the presence
of cholesterol in lipid bilayers or temperature decrease, leading to
liquid-ordered domains, significantly influences melittin activity
[37,38]. It has recently been suggested that d-hemolysin activity on
vesicles is likewise related to phospholipid acyl chain structure,
such as different acyl chain length and saturation [35]. In fact,
bilayer composition has influenced dye release in a complex
manner depending on the lipid used. The complexity may
plausibly be attributed to interplaying parameters related to lipid
acyl chain structure, i.e. bilayer bending and lateral pressure.
Fig. 4. Putative model proposed for d-hemolysin membrane activity describing the sequence of events in function of peptide concentration. The a-helices are shown as cross
sections, the lighter parts representing the polar faces and the darker parts the hydrophobic faces. (A) At low concentrations d-hemolysin adsorbs on the surface of the
membrane in a parallel manner, perturbing the bilayer (circles). (B) Membrane-bounded peptides (monomers and dimers) may induce a local curvature strain of the
membrane (top). Some peptides self-associate in transient structures across the membrane. They likely form aggregates of peptides and various organisations have been
proposed. They might be oriented parallel, perpendicular or disordered (bottom). Those aggregates disturb the membrane. It has been proposed that aggregate translocation
might release the local strain and induce both cytoplasmic efflux and lipid flip-flop. (C) Increasing the peptide concentration above a threshold results in a detergent-like
solubilization of the membrane. Three populations of lipid particles are shown, representing the gradual membrane disintegration: lamellar structure, disk-shaped structure
and micelle structure.
J. Verdon et al. / Peptides 30 (2009) 817–823
822
7. Structure/function relationship studies of d-hemolysin
A number of variants (Table 2) of the S. aureus d-hemolysin have
been synthesized so as to explore the impact of modifications of
amino acid sequence on its physicochemical (helicity, selfaggregation, interaction with lipids) or biological features (hemolytic and antimicrobial activities) [2,10–12,22,23,52].
Three of these peptides (d-hemolysin F, M and L) were used by
Kerr et al. [23] to analyze the channel-forming capacity as a
function of structure. They are characterized by movement of
tryptophan from position 15 to 16 and by replacement of bbranched hydrophobic residues with leucine. They retain the
marked amphipathy of native d-hemolysin. d-hemolysins M and L
also possess a net positive charge, which results from loss of the
formyl blocking group at the N-terminus. In addition, dhemolysins M and L differ from d-hemolysins native and F in
that glycine-10 is replaced by leucine. Furthermore, d-hemolysin
L is three residues shorter at the N-terminus than the other
peptides. All these analogs were variably able to bind to lipids
vesicles and to form self-aggregates in aqueous buffer. Interestingly, Kerr et al. [23] showed that the channel pore-forming
property and hemolytic activity are unrelated. Indeed, the
modified d-hemolysin F, which had higher ability to form
channels in the target membrane, displayed weaker hemolytic
activity. In contrast, d-hemolysin L showed enhanced lytic activity
Table 2
Synthetic d-hemolysin variants used in structure–function relationship studies.
Peptide name
d-hemolysin
Sequence
Ref.
n-26, C
n-25
n-22
n-20
n-18
n-16, D
f-MAQDIISTIGDLVKWIIDTVNKFTKK
MAQDIISTIGDLVKWIIDTVNKFTKK
AQDIISTIGDLVKWIIDTVNKFTKK
IISTIGDLVKWIIDTVNKFTKK
STIGDLVKWIIDTVNKFTKK
IGDLVKWIIDTVNKFTKK
DLVKWIIDTVNKFTKK
[2,10,23]
[2,10]
[10]
[10]
[10]
[10]
[2,10]
f-26K
n-26K
n-25K
n-22K
n-20K
n-18K
n-16K
f-MAQKIISTIGKLVKWIIKTVNKFTKK
MAQKIISTIGKLVKWIIKTVNKFTKK
AQKIISTIGKLVKWIIKTVNKFTKK
IISTIGKLVKWIIKTVNKFTKK
STIGKLVKWIIKTVNKFTKK
IGKLVKWIIKTVNKFTKK
KLVKWIIKTVNKFTKK
[10]
f-26P
n-26
n-25
n-22P
n-20P
n-18P
n-16P
f-MAQDIISTIGDLPKWIIDTVNKFTKK
MAQDIISTIGDLPKWIIDTVNKFTKK
AQDIISTIGDLPKWIIDTVNKFTKK
IISTIGDLPKWIIDTVNKFTKK
STIGDLPKWIIDTVNKFTKK
IGDLPKWIIDTVNKFTKK
DLPKWIIDTVNKFTKK
[10]
f-26KP
n-26KP
n-25KP
n-22KP
n-20KP
n-18KP
n-16KP
f-MAQKIISTIGKLPKWIIKTVNKFTKK
MAQKIISTIGKLPKWIIKTVNKFTKK
AQKIISTIGKLPKWIIKTVNKFTKK
IISTIGKLPKWIIKTVNKFTKK
STIGKLPKWIIKTVNKFTKK
IGKLPKWIIKTVNKFTKK
KLPKWIIKTVNKFTKK
[10]
F
M, G
L
f-MLQDLLSSLGDLLKSWLDTLNKFTKK
MLQDLLSSLGDLLKSWLDTLNKFTKK
DLLSSLGDLLKSWLDTLNKFTKK
[2,23]
[2,23]
[23]
H
I
E
Fmoc-MLQDWLSSLGDLLKSLLDTLNKFTKK
MLQDWLSSLGDLLKSLLDTLNKFTKK
f-MAQDIISTIGD
[2]
1
2
3
4
IISTIGDLVKWIIDTV
IISTIGKLVKWIIDTV
IISTIGDLVKWIIKTV
IISTIGKLVKWIIKTV
[12]
but no channel-formation activity. The net positive charge of dhemolysin L is not responsible for its higher hemolytic activity;
after all, peptide M displayed the same charge with an
intermediary lytic activity. In conclusion, channel formation that
occurs at low peptide concentration, and hemolysis that requires
higher d-hemolysin concentration, would tend to be distinct
events [23].
Dhople and Nagaraj have studied the hemolytic and antimicrobial activity of d-hemolysin and several variants [10–12].
The first study was performed with a peptide corresponding to the
2–26 segment of d-hemolysin that displayed the same hemolytic
activity as the native peptide [11]. This result demonstrated that
the formyl extension of the N-terminal methionine is unnecessary
in hemolysis. The second study is focused on the activity of the 5–
20 segment, IISTIGDLVKWIIDTV, which was shown to occur in an
a-helical conformation by NMR study [48], and also on the
activity of analogs, in which aspartic residues were sequentially
replaced by lysine [12]. Interestingly, the native 5–20 segment has
no hemolytic activity, whereas analogs, which are positively
charged, all have the ability to disrupt erythrocytes. Using model
membranes, the authors showed that the permeabilizing abilities
of these segments are strictly correlated to their hemolytic
activity.
Recently, Dhople and Nagaraj [10] have synthesized several
analogs wherein, the N-terminal residues were sequentially
deleted and the aspartic acids replaced by lysines (K series) and/
or the valine-13 replaced by a proline (P and KP series). In this
study, hemolytic and antimicrobial activity of the synthetic
peptides was measured and their conformations analyzed by
circular dichroism. The relationships found between structural
features and hemolytic activity of the modified d-hemolysins
showed that (i) an entire sequence of the peptide is unnecessary for
the activity. Indeed, the shorter segments of d-hemolysin in which
all the charged amino acids D and K are present show greater
hemolytic activity than the parent toxin; (ii) the formation of
peptide aggregates in the medium is not a pre-requisite for
hemolytic activity. Maximum hemolytic activity was observed for
the n-22 analog, which was shown to be monomeric at
concentrations where hemolysis is observed; (iii) when a proline
residue is present in the analogs, hemolytic activity was detected
only for full-length peptides, in which aspartic residues were
replaced by lysins. These are the only peptides with a propensity to
fold into helical structure in the presence of vesicles composed of
zwitterionic lipids. Thus, hydrophobicity and charged residues D
and K in the shorter a-helical segments are sufficient to exhibit
hemolytic activity.
In conclusion, although d-hemolysin is a hemolytic peptide,
which has been repeatedly described over the years, recent
findings have highlighted our vision of its mode of action.
Firstly, this peptide is a classical amphipathic a-helical peptide
and yet, in contrast to other related peptides, d-hemolysin has
not been described as antimicrobial. However, its antimicrobial
activity has recently been demonstrated on the Legionella genus.
Its spectrum of antimicrobial activity remains narrow, and as of
now there is no evidence to explain the sensitivity of some
bacteria. It has been suggested that sensitivity to antimicrobial
peptides may be linked to heterogeneity in the membrane of
bacteria. Secondly, this peptide shows concentration-dependent
activity, leading to membrane disruption at higher concentrations, and a charge-dependent activity, as positively-charged
variants are highly effective. Thirdly, it has been suggested that
d-hemolysin strongly interacts with liquid-disordered domains
rather than liquid-ordered raft-domains. Consequently, enrichment in liquid-ordered domains is believed to increase dhemolysin concentration in liquid-disordered domains, thereby
increasing its activity.
J. Verdon et al. / Peptides 30 (2009) 817–823
Acknowledgements
Julien Verdon is supported by a grant from the French Minister
of Research. Nicolas Girardin is supported by a Cifre Grant from
Veolia.
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Dans la suite de ce chapitre, nous nous intéresserons aux peptides antimicrobiens
produits par les bactéries du genre Staphylococcus. Ces bactéries sont des coques à Gram
positif répandus dans la nature bien que majoritairement retrouvés sur la peau, les glandes
cutanées et les membranes des muqueuses de mammifères et d’oiseaux. Certains peuvent
développer un style de vie de pathogène s’ils parviennent à entrer dans les tissus de l’hôte. De
plus, certaines espèces de Staphylococcus sont retrouvées comme agent étiologique
d’infections humaines et animales. Par exemple, S. aureus résistant à la méthicilline (SARM)
est devenu un important pathogène nosocomial (Emori & Gaynes, 1993).
Les Staphylococcus sont généralement divisés en deux groupes sur la base de la
production de coagulase, une enzyme impliquée dans la coagulation de la fibrine : les
staphylocoques coagulase positif (SCP) et les staphylocoques coagulase négatif (SCN). Ils
produisent des peptides antimicrobiens dont la plupart sont des bactériocines qui
appartiennent majoritairement à la classe I (Pep5, épidermine, épilancine K7, épicidine 280,
staphylococcine C55/Bac R1 et la nukacine ISK-1) ou à la classe II (auréocine A70 et A53).
A ce jour, une seule bactériocine de Staphylococcus, la lysostaphine, a été décrite comme
appartenant aux bactériocines de classe III (Tableau 2) (Bastos et al., 2009).
Dans un souci de simplicité, les peptides antimicrobiens seront présentés par la suite
selon l’espèce bactérienne productrice.
Caractérisation et mode d’action de la warnéricine RK, un peptide anti-Legionella
27
Tableau 2 : Peptides antimicrobiens produits par Staphylococcus et leur spectre
d’activité (modifié d’après (Bastos et al., 2009))
Peptides
antimicrobiens
Espèce
productrice
Pep5
Microorganismes notables sensibles
Références
Bactéries à Gram positif
Bactéries à Gram négatif et Mycobatéries
S. epidermidis
S. aureus, SCN, Corynebacterium
-
Fontana et al. , 2006,
Nascimento et al. , 2006
Epicidine 280
S. epidermidis
SCN
-
Heidrich et al. , 1998
Epidermine/
Staphylococcine 1580
S. epidermidis
S. aureus, S. epidermidis, Streptococcus
sp., Corynebacterium sp.,
propionibacterium acnes
-
Fontana et al. , 2006,
Nascimento et al. , 2006
Epilancine K7
S. epidermidis
SCN
-
Nascimento et al. , 2006
Epilancine 15X
S. epidermidis
Enterococcus sp., Staphylococcus sp.,
Streptococcus sp.
-
Ekkelenkamp et al. , 2005
Nukacine ISK-1
S. warneri
L. sakei, Leuconostoc mesenteroides,
Pediococcus pentosaceus
-
Asaduzzaman et al. , 2006
Staphylococcine T/
Gallidermine
S. cohnii/ S.
gallinarum
Staphylococcus sp., Streptococcus sp.,
Corynebacterium sp., Listeria sp.,
Clostridium sp.
Neisseria sp., Moraxella sp.
Furmanek et al. , 1999
Simulancine 3299
S. simulans
S. agalactiae, Corynebacterium sp.
-
Nascimento et al. , 2005
SWLP-1
S. warneri
S. aureus, S. epidermidis
-
Petersen et al. , 2009
Warnéricine RB4
S. warneri
Alicyclobacillus acidoterrestris
-
Minamikawa et al. , 2005
Warnéricine RK
S. warneri
-
Legionella sp.
Hechard et al. , 2005
Hechard et al. , 2006 (brevet)
Warnérine
S. warneri
L. monocytogenes , M. luteus , S. aureus
Klebsiella pneumoniae, Salmonella typhimurium,
Vibrio cholerae
Prema et al. , 2006
Warnérine IEGM KL-1
S. warneri
Corynebacterium sp., Micrococcus sp.,
Staphylococcus sp., Streptococcus sp.,
Rhodococcus sp.
-
Korobov et al. , 2003
Korobov et al. , 2005
Auréocine A70
S. aureus
L. monocytogenes, S. aureus, S.
agalactiae, Corynebacterium sp.
-
Oliveira et al. , 1998
Nascimento et al. , 2006
Auréocine A53
S. aureus
L. monocytogenes, S. aureus, S.
agalactiae, Corynebacterium sp.
M. bovis
Oliveira et al. , 1998
Nascimento et al. , 2006
Bac 1829,
Staphilococcine
C55/BacR1
S.aureus
S. aureus, Streptococcus suis,
Corynebacterium diphteriae,
Corynebacterium renale
Haemophilus parasuis, Bordetella pertussis,
Bordetella bronchoseptica, Moraxella bovis,
Pasteurella multocida
Crupper and Iandolo, 1996
Crupper et al. , 1997
Navaratna et al. , 1998
Staphylococcine 188
S. aureus
S. aureus, E. faecalis, S. pneumoniae,
C. diphteriae
E. coli, S. enterica serovar typhi, Shigella
dysenteria, Mycobacterium tuberculosis
Saeed et al. , 2004
Bac 201
S. aureus
S. aureus, E. faecalis, S. agalactiae
N. meningitidis
Iqbal et al. , 2001
Staphylococcine IYS2
S. aureus
S. aureus, Streptococcus salivarius, P.
acnes, L. monocytogenes, Actinomyces
israeli
-
Nakamura et al. , 1983
Lysostaphine
S. simulans
S. aureus, S. epidermidis
-
Schindler et al. , 1964
Climo et al. , 1998
-, aucune activité détectée
Caractérisation et mode d’action de la warnéricine RK, un peptide anti-Legionella
28
I.3.4.1
Peptides antimicrobiens produits par les staphylocoques coagulase
positif
Seuls trois peptides antimicrobiens produits par S. aureus ont été entièrement
caractérisés : l’auréocine A70, l’auréocine A53 ainsi que la staphylococcine C55/BacR1
(Tableau 2) (Bastos et al., 2009). Les auréocines A70 et A53 ont été purifiées à partir de
deux souches différentes de S. aureus isolées de lait commercial (Giambiagi-Marval et al.,
1990).
Les déterminants génétiques codant la production de l’auréocine A70 sont localisés
sur un plasmide de 8 kb, pRJ6. Il y a deux unités transcriptionelles distinctes : une première
composée de quatre gènes (aurABCD) qui codent quatre peptides hautement cationiques (pI
allant de 9,85 à 10,04) et hydrophobes et une deuxième composée d’un seul gène, aurT, qui
code une protéine de type transporteur ATP-dépendant. Une troisième unité transcriptionnelle
potentielle a été décrite. Elle possède deux cadres ouverts de lecture dont l’un possède un
gène codant une protéine de 138 acides aminés qui serait impliquée dans l’immunité (de
Oliveira et al., 1998; Netz et al., 2001). C’est la première bactériocine à quatre composants
décrite dans la littérature et elle est produite sans maturation (Netz et al., 2001). Les
bactériocines les plus fréquemment purifiées chez S. aureus sont des variants naturels de
l’auréocine A70 (Nascimento et al., 2002; Nascimento et al., 2005).
L’auréocine A53 est un peptide cationique (pI de 10,5) de 51 acides aminés contenant
10 résidus lysine et 5 résidus tryptophane. Elle est purifiée sous forme formylée avec une
masse de 6021,5 Da. Elle adopte en solution aqueuse une structure en hélice α (36%) et en
feuillet  (18%) (Netz et al., 2002). Elle est codée par un plasmide de 10,4 kb, pRJ9 qui
contient plusieurs cadres ouverts de lecture dont 4 ont été identifiés : un gène de structure,
aucA et 3 gènes codant pour des transporteurs de type ABC, aucFEG (Giambiagi-Marval et
al., 1990). Récemment, deux bactériocines présentant des homologies de séquence (environ
45%) avec l’auréocine A53 ont été découvertes chez des bactéries lactiques. La lacticine Z
(Iwatani et al., 2007) et la lacticine Q (Fujita et al., 2007) produite par deux souches de L.
lactis.
La staphylococcine C55 a, dans un premier temps, été partiellement purifiée par
Dajani et al., entre 1969 et 1970 (Dajani & Wannamaker, 1969; Dajani et al., 1970), avant
d’être caractérisée par Navaratna et al. en 1998 (Navaratna et al., 1998). C’est la première
bactériocine de S. aureus à avoir été entièrement séquencée et c’est également la première
Caractérisation et mode d’action de la warnéricine RK, un peptide anti-Legionella
29
bactériocine à deux composants décrite chez les bactéries du genre Staphylococcus. La
staphylococcine C55 est un lantibiotique composé de deux peptides, C55α et C55, de masse
respective 3339 Da et 2993 Da (Navaratna et al., 1998). Les déterminants génétiques sont
portés par un plasmide de 32 kb. Il y a 6 gènes identifiés, sacαA, sacA, sacM1, sacT, sacM2
et sacJ qui correspondent aux gènes de structure, d’immunité et de transporteur de type ABC
(Navaratna et al., 1998; Navaratna et al., 1999; O'Connor et al., 2007).
I.3.4.2
Peptides antimicrobiens produits par les staphylocoques coagulase
négatif
Les peptides antimicrobiens les mieux caractérisés produits par les SCN appartiennent
majoritairement aux bactériocines de classe I (lantibiotiques) ou de classe II (Bastos et al.,
2009). Les espèces majoritaires produisant ces molécules sont S. epidermidis et S. warneri
(Tableau 2).
I.3.4.2.1 Peptides antimicrobiens produits par S. warneri
S. warneri est un SCN commensale de la peau. Environ 50% des individus portent ce
microorganisme qui représente 1% de la population staphylococcique normale (Kloos, 1980).
Peu de cas d’infection à S. warneri sont reportés dans la littérature et ils impliquent souvent la
peau ou les tissus mous (Wood, 1992). La bactérie a cependant été impliquée dans quelques
cas de discites c'est-à-dire d’une atteinte infectieuse, inflammatoire ou traumatique d'un
disque intervertébral (Announ et al., 2004). S. warneri produit un grand nombre de
staphyloccines différentes ; il y en a actuellement 6 décrites dans la littérature.
♦ La nukacine ISK-1 est une bactériocine isolée en 1997 à partir d’une bactérie
provenant de riz fermenté, originellement décrite comme un Pediococcus (Kimura et al.,
1997). Quelques années plus tard, la souche a été identifiée comme étant un S. warneri
(Ishizaki et al., 2001). La nukacine ISK-1 est une bactériocine de classe IA synthétisée sous la
forme d’un peptide précurseur similaire aux lantibiotiques de type lacticine-481. Le peptide
mature est constitué de 27 acides aminés, incluant deux résidus lanthionines, un résidu 3methyllanthionine ainsi qu’un résidu déshydrobutyrine pour une masse moléculaire de 2960,1
Da (Sashihara et al., 2000). Au niveau génétique, les gènes codant la nukacine ISK-1 sont au
moins au nombre de 6. Le gène de structure nukA code un peptide précurseur de 57 acides
aminés, les 30 premiers résidus formant une séquence signal. Le gène nukM code une enzyme
de 947 acides aminés impliquée dans la modification post-traductionnelle des lantibiotiques
de type lacticine-481. Le gène nukT code un transporteur membranaire de la famille ABC,
Caractérisation et mode d’action de la warnéricine RK, un peptide anti-Legionella
30
impliqué dans la sécrétion de la bactériocine (Aso et al., 2004). L’immunité vis-à-vis de la
nukacine ISK-1 est réalisée par un transport coopératif entre les protéines codées par les gènes
nuk F, E, G et H. La bactériocine est d’abord capturée de façon spécifique par la protéine
NukH puis transportée dans l’espace extracellulaire par NukFEG (Aso et al., 2005; Okuda et
al., 2008a; Okuda et al., 2008b). Les lysines en position 1 à 3 jouent un rôle crucial dans
l’interaction membranaire de la nukacine ISK-1 et donc dans son activité antimicrobienne
(Asaduzzaman et al., 2006). Son spectre d’activité est dirigé, entre autre, contre Lactobacillus
sakei, Pediococcus pentosaceus et Leuconostoc mesenteroides (Asaduzzaman et al., 2006).
En 2008, un variant naturel de la nukacine ISK-1 a été isolé à partir d’un
Staphylococcus hominis KQU-131 issu de poisson fermenté et nommé nukacine KQU-131.
Elle ne diffère de la nukacine ISK-1 que par trois acides aminés, un résidu dans la séquence
signal et deux dans le peptide mature (Wilaipun et al., 2008).
♦ La warnérine IEGM KL-1 est un peptide antimicrobien produit par S. warneri IEGM
KL-1, purifié suite à la recherche de composés antimicrobiens actifs contre S. epidermidis.
C’est un peptide de 2999 Da (Korobov et al., 2005) qui possède un spectre d’activité dirigé
essentiellement contre des bactéries à Gram positif tels que Staphylococcus, Micrococcus,
Streptococcus, Corynebacterium et Rhodococcus (Korobov et al., 2003). Son action dépend
de l’état énergétique de la cellule cible. En effet, la composante électrique Δψ du potentiel
électrochimique transmembranaire des ions H+ influence l’effet antimicrobien de la warnérine
IEGM KL-1 de façon importante. Son activité antimicrobienne décroit lorsque le potentiel
décline. Les cellules en phase stationnaire de croissance ou cultivées à faible température, qui
ont une activité métabolique réduite et donc un plus faible Δψ, se trouvent être beaucoup
moins sensibles à l’action du peptide (Korobov et al., 2005).
♦ La warnérine est un peptide antimicrobien produit par trois isolats de S. warneri
(nommés FM10, FM20 et FM 30) issus d’échantillons de viande. Son poids moléculaire
estimé est de 2500 Da. La production maximale du peptide se fait au bout de 12 heures
d’incubation à 37°C à pH 6,5. Il possède un spectre d’activité assez large, inhibant la
croissance de bactéries à Gram positif et négatif. Cependant, de façon intéressante, S. aureus
est fortement inhibé par les trois souches tandis que d’autres souches telles que M. luteus, L.
monocytogenes, K. pneumoniae, S. typhimurium et V. cholerae sont sensibles à la souche
FM20 mais peu, voir pas du tout, aux souches FM10 et FM30. L’effet inhibiteur de la souche
FM20 est ainsi plus élevé que celui des deux autres souches (Prema et al., 2006).
Caractérisation et mode d’action de la warnéricine RK, un peptide anti-Legionella
31
♦ SWLP1 (« Staphylococcus warneri lantibiotic peptide 1 ») est un lantibiotique de 30
acides aminés ayant une masse de 2998,6 Da. Le peptide contient notamment trois ponts
thioéthers comme la nukacine ISK-1 mais, par contre, comporte un résidu déshydroalanine et
trois résidus déshydrobutyrine contrairement à cette dernière. SWLP1 possède une grande
homologie de séquence avec l’épilancine K7 produite par S. epidermidis. Le peptide dispose
d’un fort potentiel dans le traitement d’infections de bactéries à Gram positif puisqu’il est
inhibiteur de certaines souches de S. epidermis et S. aureus multirésistantes aux antibiotiques
(Petersen et al., 2009).
♦ La warnéricine RB4 a été purifiée en 2005, après la nukacine ISK-1, à partir de S.
warneri RB4 isolé de boules de riz. Il s’agit d’une bactériocine de 27 acides aminés possédant
la même séquence primaire que celle de la nukacine ISK-1, excepté pour 7 résidus encore non
identifiés. Son poids moléculaire est de 2958,2 Da. Cependant, la warnéricine RB4 possède
des activités différentes de celles de la nukacine ISK-1. En effet, elle est inactivée par la
trypsine et son spectre d’action est spécifique d’Alicyclobacillus acidoterrestris, A.
acidocaldarius et de M. luteus. Les auteurs pensent qu’il s’agit d’un variant naturel de la
nukacine ISK-1 (Minamikawa et al., 2005).
I.3.4.2.2 Peptides antimicrobiens produits par S. epidermidis
S. epidermidis fait parti de la microflore naturelle de la peau et des muqueuses
humaines.
Il
est
rarement
impliqué
dans
des
infections
chez
des
personnes
immunocompétentes mais, depuis quelques années, la bactérie est devenue la cause de
nombreuses infections nosocomiales. Son potentiel infectieux se matérialise par sa présence
sous forme de biofilms sur les dispositifs médicaux implantés tels les cathéters et les
pacemakers (Ziebuhr et al., 2006). Pep5 et l’épidermine sont les staphylococcines de S.
epidermidis les plus étudiées de part leur rôle potentiel dans la destruction de souches de
Staphylococcus multirésistantes aux antibiotiques. Ces peptides partagent cette caractéristique
avec la lysostaphine produite par S. simulans biova staphylolyticus et l’auréocine A53.
Plusieurs études utilisent ces deux microorganismes ou leur peptides antimicrobiens dans des
tests d’inhibitions de souches pathogènes (Nascimento et al., 2006; Wu et al., 2003). Par
exemple, Pep5 et l’épidermine réduisent la colonisation de cathéters en silicone par S.
epidermis préalablement isolés d’infections (Fontana et al., 2006).
♦ L’épidermine est le plus petit lantibiotique de type A décrit à ce jour. C’est un
peptide de 22 acides aminés qui possède une masse de 2164,4 Da et 4 ponts disulfures
Caractérisation et mode d’action de la warnéricine RK, un peptide anti-Legionella
32
(Schnell et al., 1988). Il est codé par un plasmide de 54 kb qui porte 11 gènes nécessaires à sa
production (Bastos et al., 2009). De plus sa maturation au niveau du peptide précurseur est
dépendante du système de quorum sensing agr (accessory gene regulator) (Kies et al., 2003).
L’épidermine possède des variants naturels tels que la gallidermine produite par S. gallinarum
(Kellner et al., 1988), la staphylococcine 1580 isolée chez S. epidermidis (Sahl, 1994) et la
staphylococcine T produite par S. cohnii (Furmanek et al., 1999).
♦ Pep5 est produit par un isolat clinique de S. epidermidis, la souche 5 (Sahl &
Brandis, 1981). C’est un lantibiotique de 34 acides aminés qui possède une masse de 3488 Da
(Kaletta et al., 1989). Il est codé par 6 gènes regroupés sur un plasmide de 20 kb, pED503
(Meyer et al., 1995). Son spectre d’activité est fortement dirigé contre les souches de SCN
ainsi que S. aureus ce qui en fait un très bon candidat dans la lutte des infections aux SARM
(Nascimento et al., 2006). L’épicidine 280 (3130 Da), produite par S. epidermidis BN 280, est
considérée comme un variant naturel de Pep5 puisque les deux peptides possèdent 75%
d’homologie de séquence et une organisation génétique similaire (Heidrich et al., 1998).
Caractérisation et mode d’action de la warnéricine RK, un peptide anti-Legionella
33
Caractérisation et mode d’action de la warnéricine RK, un peptide anti-Legionella
34
Chapitre II.
II.1
Mécanismes d’action et résistance
Généralités
Les modes d’action des peptides antimicrobiens sont très divers et seront abordés,
dans cette étude, selon deux axes. Dans un premier temps, les peptides antimicrobiens doivent
s’adsorber sur la cellule bactérienne et traverser l’enveloppe. Plusieurs mécanismes de
perméabilisation découlant d’études de peptides de référence tels que l’alaméthicine, la
magainine 2, la mélittine ou encore la δ-hémolysine seront présentés (Bechinger & Lohner,
2006; He et al., 1996; Matsuzaki et al., 1996). Ensuite, les peptides vont soit entrainer une
déstabilisation de la membrane bactérienne soit pénétrer dans la cellule et perturber son
fonctionnement par action sur des cibles intracellulaires (Brogden, 2005; Friedrich et al.,
2000; Hale & Hancock, 2007; Yeaman & Yount, 2003).
II.2
Bases structurales de l’activité des peptides antimicrobiens
Les peptides antimicrobiens présentent une grande variété d’origine et de structure,
comme montré précédement. Beaucoup de données sont disponibles dans la littérature sur les
relations entre structure du peptide et mode d’action mais peu de données sont disponibles
concernant les bases moléculaires expliquant les différences marquées dans l’activité et la
sélectivité des peptides antimicrobiens. Par exemple, les différences de sensibilité d’un seul
microorganisme à un panel très diversifié de peptides antimicrobiens indique que des
paramètres tels que la structure du peptide (le contenu en hélice par exemple), la charge,
l’hydrophobicité globale, l’amphiphilie, les tailles des régions hydrophobes et hydrophile
(angle polaire) sont importants (Brogden, 2005). De plus, comme noté par Tossi et al.,
beaucoup de ces paramètres sont liés les uns aux autres et la modification d’un paramètre
entraîne généralement des changements chez les autres (Tossi et al., 2000). Alternativement,
les différences de sensibilité d’un panel de microorganismes à un seul peptide antimicrobien
indiquent que la composition de la surface microbienne et de la membrane cytoplasmique sont
également des paramètres importants.
Dans la partie suivante, plusieurs aspects structuraux des peptides influant sur
l’activité antimicrobienne et la sélectivité seront développés.
Caractérisation et mode d’action de la warnéricine RK, un peptide anti-Legionella
35
II.2.1
Hélicité (α)
L’hélice α est un motif abondant chez les peptides antimicrobiens (Figure 3). Cette
structure, caractérisée par des régions hydrophobes et hydrophiles bien distinctes de part et
d’autre de l’axe de l’hélice, permet une interaction optimale avec la structure amphiphile des
phospholipides composant les membranes biologiques (Brogden, 2005).
Figure 3 : Hélicité et répartition des régions hydrophobes et hydrophiles dans la
structure des peptides antimicrobiens (Dathe & Wieprecht, 1999). Les zones grisées
correspondent à des zones hydrophiles, les zones noires correspondent à des zones
hydrophiles et cationiques. Les zones hydrophobes forment le reste de l’hélice. N représente
le nombre de résidus du peptide. Q représente la charge totale du peptide calculée à pH 7.
La substitution de certains acides aminés L par leurs énantiomères correspondants
(acides aminés D) est une technique qui permet de perturber l’hélicité d’un peptide sans pour
autant modifier d’autres paramètres tels que la charge globale, la longueur ou
l’hydrophobicité (Dathe & Wieprecht, 1999). Ainsi, la substitution de deux résidus L
consécutifs de la magainine 2 a permis à Wieprecht et al. d’observer qu’une diminution
importante de l’hélicité (de 75% à 25%) de la magainine 2 provoquait une chute de sa
capacité à perméabiliser des vésicules lipidiques neutres ou légèrement négatives. En
revanche, la perméabilisation n’est pas affectée avec des vésicules contenant des lipides
fortement négatifs (Wieprecht et al., 1996). De même, un analogue du peptide synthétique
KLAL, qui possède une hélicité diminuée par rapport au peptide original, agit moins bien sur
Caractérisation et mode d’action de la warnéricine RK, un peptide anti-Legionella
36
des vésicules faiblement négatives, indiquant que le domaine hydrophobe de l’hélice est
capital pour la liaison à la membrane et sa perméabilisation (Dathe et al., 1996).
II.2.2
Charge (Q)
La plupart des peptides antimicrobiens caractérisés dans la littérature possèdent une
charge nette positive allant de +2 à +9 (Hancock & Sahl, 2006). Cette cationicité est
importante et leur permet d’interagir avec la membrane bactérienne et d’autres cibles chargées
négativement (Mavri & Vogel, 1996). En effet, les membranes bactériennes sont riches en
phospholipides acides (phosphatidylglycérol (PG), phosphatidylsérine (PS) et cardiolipide
(CL)) qui leur confèrent une charge globale négative. De plus, les lipopolysaccharides (LPS)
des bactéries à Gram négatif et les acides teichoïques des bactéries à Gram positif contribuent
à l’apport de charges négatives supplémentaires (Yeaman & Yount, 2003). Beaucoup d’études
ont ainsi montré une forte corrélation entre la cationicité des peptides et leur activité
antimicrobienne (Dathe et al., 2001; Dhople & Nagaraj, 2005; Matsuzaki et al., 1997; Nielsen
et al., 2007; Park et al., 2004). Augmenter la cationicité d’un peptide a généralement pour
effet d’accroître son potentiel antimicrobien. Par exemple, accroître la charge nette de la
magainine 2 de +3 à +5 à pour résultat d’augmenter l’activité antimicrobienne contre les
bactéries à Gram négatif et positif. La δ-hémolysine possède une forte activité hémolytique et
peu d’activité antimicrobienne ; cependant la substitution de résidus chargés négativement par
des résidus lysines (positifs) accroît son pouvoir antimicrobien (Dhople & Nagaraj, 1995). Ce
phénomène est dû au renforcement des interactions électrostatiques entre peptides et
enveloppe (Dathe et al., 2001). Il y a cependant une limite car une trop forte charge nette
positive (+6 et +7 pour la magainine 2) résulte en une augmentation importante de l’activité
hémolytique et une perte de l’activité antimicrobienne (Dathe et al., 2001). Cette perte
d’activité antimicrobienne pourrait être due en partie à de trop fortes interactions qui
empêcheraient la translocation du peptide.
Les interactions électrostatiques permettent une accumulation du peptide à la surface
de la membrane qui est suffisamment importante pour déstabiliser la bicouche lipidique. En
diminuant l’effet des interactions électrostatiques par une diminution des charges négatives,
l’affinité des peptides diminue. Ce sont alors les interactions hydrophobes qui interviennent
(Dathe & Wieprecht, 1999).
Caractérisation et mode d’action de la warnéricine RK, un peptide anti-Legionella
37
II.2.3
Hydrophobicité (H)
L’hydrophobicité d’un peptide, définie comme le pourcentage de résidus hydrophobes,
influe sur la capacité intrinsèque du peptide à se mouvoir depuis une phase aqueuse vers une
phase hydrophobe (Dathe & Wieprecht, 1999). La plupart des peptides antimicrobiens
possèdent environ 50% de résidus hydrophobes (Hancock & Scott, 2000). Les interactions
hydrophobes, en plus d’autres forces telles que les interactions électrostatiques, jouent un rôle
majeur dans la partition des peptides au sein des bicouches lipidiques membranaires. Il s’agit
donc d’un paramètre clef modulant l’activité des peptides antimicrobiens (Dathe &
Wieprecht, 1999; Yeaman & Yount, 2003). Un peptide antimicrobien doit posséder deux
particularités au regard de son hydrophobicité pour être actif (Dathe & Wieprecht, 1999) :
- une solubilité suffisante dans un environnement aqueux pour permettre un transport
rapide vers sa cible (en particulier dans le cadre de la réponse immunitaire contre des
agents microbiens)
- posséder la capacité d’interagir avec la région hydrophobe de la bicouche
membranaire pour la déstabiliser et la perméabiliser.
Une insuffisance ou au contraire un excès d’hydrophobicité conduisent respectivement à une
affinité trop faible pour les lipides ou à l’agrégation voire la précipitation en milieu aqueux.
Deux études ont analysé l’impact de l’hydrophobicité sur les activités d’analogues de
la magainine 2 et du peptide KLAL tout en fixant les autres paramètres structuraux (Dathe et
al., 1997; Wieprecht et al., 1997a). L’augmentation de l’hydrophobicité est fortement corrélée
à une augmentation de l’hémolyse et, dans une moindre mesure, à une augmentation de
l’activité antimicrobienne. De plus, les auteurs ont mis en évidence que l’augmentation de
l’hydrophobicité réduisait la spécificité de l’activité antimicrobienne.
Les effets de l’hydrophobicité portent principalement sur le pouvoir de perméabilisation des
membranes neutres (phosphatidylcholine). Son influence sur la perméabilisation de
membranes négatives contenant des phospholipides anioniques (phosphatidylglycérol) est
beaucoup moins marquée. Les auteurs l’expliquent en postulant qu’alors, les interactions
électrostatiques compensent la diminution des interactions hydrophobes (Dathe & Wieprecht,
1999).
Caractérisation et mode d’action de la warnéricine RK, un peptide anti-Legionella
38
II.2.4
Amphiphilie et moment hydrophobe (µ)
L’amphiphilie d’un peptide reflète l’abondance relative et la polarisation des ses
domaines hydrophobes et hydrophiles. Une mesure quantitative de l’amphiphilie d’un peptide
est le moment hydrophobe, µ, calculé comme la somme vectorielle des indices
d’hydrophobicité de chaque résidu formant une hélice α idéale (Figure 5) (Eisenberg, 1984).
Figure 4 : Représentation en hélice α de peptides antimicrobiens indiquant le moment
hydrophobe et l’angle polaire (Dathe & Wieprecht, 1999). L’angle de la zone de l’hélice
composée de résidus chargés est noté Ф. Le moment hydrophobe est symbolisé par μ. Les
résidus cationiques sont en noir, les résidus polaires sont en gris et les résidus apolaires sont
en blanc. Le Ф n’a pas été pas représenté pour la mélittine car les auteurs ont considérés
uniquement les 21 premiers résidus du peptide.
Une corrélation complète du µ avec l’activité des peptides antimicrobiens est difficile
a établir notamment à cause de deux facteurs (Dathe & Wieprecht, 1999). Premièrement, chez
beaucoup de peptides antimicrobiens tels que la mélittine, les résidus hydrophobes et
hydrophiles ne sont pas distribués de façon régulière le long de la chaîne (Figure 4). Il y a de
ce fait des variations des valeurs du µ selon les régions du peptide. Deuxièmement, le µ est
calculé sur la base d’une hélice idéale mais l’hélicité des peptides liés à la membrane est
souvent considérablement inférieure à 100%.
Caractérisation et mode d’action de la warnéricine RK, un peptide anti-Legionella
39
En augmentant le µ d’analogues de la magainine 2, les auteurs ont observé une
augmentation de la fixation à la surface membranaire en raison d’une augmentation des
interactions hydrophobes entre les hélices des peptides et les chaînes acylées des
phospholipides (Wieprecht et al., 1997c). Ainsi, ce paramètre joue un rôle mineur dans la
perméabilisation de vésicules fortement chargées négativement ou composées lipides neutres,
c’est-à-dire lorsque les interactions peptide/lipide (P/L) sont minimales (Wieprecht et al.,
1997c).
II.2.5
Angle polaire (Ф)
La fixation des peptides antimicrobiens à la membrane implique la pénétration de la
face hydrophobe de l’hélice peptidique dans la région des chaînes acylées des phospholipides
tandis que les parties hydrophiles restent en contact avec les têtes polaires et l’environnement
aqueux. La liaison à la membrane et la perturbation qui en résulte sont théoriquement
dépendantes de la taille relative des domaines hydrophiles et hydrophobes, l’un par rapport à
l’autre. L’angle polaire (Ф) est donc une mesure de la proportion relative des faces polaires et
apolaires d’un peptide sous forme d’hélice α amphiphile qui permet d’influencer la
localisation du peptide à la surface de la membrane ainsi que la structure du pore
indépendamment de l’hydrophobicité et du moment hydrophobe (Figure 4) (Dathe &
Wieprecht, 1999).
Une étude sur le rôle de l’angle polaire dans l’activité de peptides antimicrobiens
utilisant des peptides synthétiques a montré que des peptides ayant un faible angle polaire
(Ф=100°) induisent une plus grande perméabilisation membranaire que des peptides ayant un
angle polaire plus fort (Ф =180°) (Uematsu & Matsuzaki, 2000). Ces résultats sont en accord
avec deux études précédentes utilisant des analogues de la magainine 2 et de KLAL (Dathe et
al., 1997; Wieprecht et al., 1997b).
L’angle polaire a également une influence sur la stabilité et la durée de vie des pores
membranaires induits par les peptides antimicrobiens. En effet, les peptides avec un faible
angle polaire (et donc une plus grande surface hydrophobe) possèdent un meilleur taux de
translocation et de formation de pores (Uematsu & Matsuzaki, 2000). Les mêmes
observations ont été faites par Dathe et Wieprecht en faisant varier l’angle polaire de 80° à
180° chez des analogues de la magainine 2 (Ф = 120°) (Dathe & Wieprecht, 1999).
Cependant, la stabilité des pores est plus faible pour les peptides avec un faible angle polaire.
Ces résultats sont en accord avec le fait que le peptide PGLa (Ф = 100°) est plus facilement
Caractérisation et mode d’action de la warnéricine RK, un peptide anti-Legionella
40
translocable que la magainine 2 (Ф = 180°) (Matsuzaki et al., 1998). Cela pourrait être dû à
des répulsions entre les faces polaires des hélices qui destabiliseraient la structrure des pores
(Dathe & Wieprecht, 1999).
II.3
Mécanismes d’actions des peptides antimicrobiens
Les mécanismes d’actions des peptides antimicrobiens sont très divers et seront
regroupés, dans cette étude, en deux catégories : ceux reposant sur la perturbation de la
membrane cytoplasmique et ceux reposant sur la perturbation du fonctionnement de la cellule
par action sur des cibles intracellulaires (Brogden, 2005; Jenssen et al., 2006; Yeaman &
Yount, 2003). Cependant, avant de déstabiliser la membrane ou de perturber le
fonctionnement de la bactérie, l’action des peptides antimicrobiens nécessite une première
étape d’interaction avec l’enveloppe bactérienne. Deux grands mécanismes sont distingués :
- les intéractions non spécifiques (électrostatiques, hydrophobes…)
- les intéractions spécifiques (reconnaissance d’une cible)
II.3.1
II.3.1.1
Interactions initiales peptide/enveloppe
Interactions non spécifiques
Les peptides antimicrobiens, majoritairement cationiques, sont premièrement attirés
par les charges négatives existant à la surface des bactéries. Cette attraction se fait par des
interactions électrostatiques. Une fois à proximité de la surface bactérienne, les peptides
doivent traverser différents constituants de l’enveloppe pour atteindre la membrane
cytoplasmique. A ce niveau, des interactions hydrophobes vont leur permettre d’interagir avec
la partie hydrophobe des phospholipides. Cependant, la structure de l’enveloppe bactérienne
diffère selon les genres, modifiant les propriétés de surface et donc l’activité des peptides
antimicrobiens (Brogden, 2005). Il faut donc s’intéresser un plus en détail à la composition de
l’enveloppe des bactéries à Gram positif et négatif.
Les bactéries à Gram positif possèdent une enveloppe composée d’une paroi
homogène et épaisse constituée principalement de peptidoglycane et d’une membrane
cytoplasmique (Figure 5).
Caractérisation et mode d’action de la warnéricine RK, un peptide anti-Legionella
41
Figure 5 : Enveloppe des bactéries à Gram positif (Prescott et al., 2003)
Cette enveloppe contient également une grande quantité d’acides teichoïques,
polymères formés d’enchaînement de groupements phosphates liant des molécules de glycérol
ou de ribitol, modifiés par substitutions avec des résidus D-alanines et des sucres aminés (Nacétylglucosamines). Les acides teichoïques sont connectés soit au peptidoglycane lui-même
soit aux lipides de la membrane plasmique ; dans ce cas, ils sont nommés acides
lipoteichoïques. Les acides teichoïques sont fortement chargés négativement à cause de
l’abondance de groupement phosphates dans leur structure (Nizet, 2006).
Des mutants de S. aureus, dont les acides teichoïques sont dépourvus de résidus D-alanine,
possèdent un peptidoglycane très négatif entrainant alors une sensibilité accrue à de nombreux
peptides antimicrobiens cationiques tels que la magainine 2, la nisine ou encore les
protégrines (Peschel et al., 1999).
Les bactéries à Gram négatif possèdent une enveloppe multicouche complexe
composée d’une fine couche de peptidoglycane entourée de deux membranes, la membrane
externe et la membrane interne (Figure 6).
Caractérisation et mode d’action de la warnéricine RK, un peptide anti-Legionella
42
Figure 6 : Enveloppe des bactéries à Gram négatif (Prescott et al., 2003).
Le feuillet externe de la membrane externe est constitué d’une structure complexe
appelée lipopolysaccharide (LPS). Le LPS est composé de deux parties : une partie lipidique
(lipide A) et une partie oligosaccharidique (polysaccharide central et chaîne latérale O). Le
lipide A est un dimère anionique de glucosamine lié à des chaînes d’acides gras et flanqué par
des groupements phosphates (Figure 7) (Nizet, 2006).
Caractérisation et mode d’action de la warnéricine RK, un peptide anti-Legionella
43
Figure 7 : Structure du LPS bactérien (Prescott et al., 2003). Abréviations : Abe,
abequose ; Gal, galactose ; Glc, glucose ; GlcN, glucosamine ; Hep, heptulose ; KDO, 2-céto3-désoxyoctonate; Man, mannose ; NAG, N-acétylglucosamine ; P, phosphate ; Rha, Lrhamnose.
Le mécanisme d’interaction proposé des peptides antimicrobiens avec l’enveloppe des
bactéries à Gram négatif est la voie de translocation auto-induite (Figure 8) (Hancock, 1997;
Hancock & Chapple, 1999).
Figure 8 : La voie de translocation auto-induite des peptides antimicrobiens à travers la
membrane externe des bactéries à Gram négatif (Hancock, 1997).
Caractérisation et mode d’action de la warnéricine RK, un peptide anti-Legionella
44
L’interaction du peptide cationique se fait avec des sites de fixations négatifs de
cations divalents à la surface du LPS qui stabilisent la membrane externe. Le peptide entre
alors en compétition avec les cations et, de part sa plus grande affinité pour le LPS, va les
déplacer et conduire à la destruction de ces sites pour sa propre translocation au travers de la
membrane externe (Hancock, 1997). Par exemple, en présence de faibles concentrations de
Mg2+, Salmonella tyhimurium devient résistante à la polymyxine B (Groisman et al., 1997).
Une fois que les peptides antimicrobiens ont accès à la membrane cytoplasmique, ils
peuvent intéragir avec les lipides membranaires via des interactions hydrophobes ou avec des
cibles particulières.
II.3.1.2
Interactions spécifiques
Certains peptides interagissent préférentiellement avec des molécules spécifiques de
l’enveloppe. L’exemple le mieux caractérisé actuellement est celui de la nisine. C’est un
peptide de 34 acides aminés appartenant aux lantibiotiques de type A (Van de Ven et al.,
1991). Elle se lie spécifiquement au lipide II, un précurseur de la biosynthèse du
peptidoglycane, et exerce ensuite une activité antimicrobienne de l’ordre du nanomolaire
(Héchard & Sahl, 2002). Son spectre d’activité est dirigé contre les bactéries riches en
peptidoglycane c’est-à-dire les bactéries à Gram positif (Breukink & de Kruijff, 1999).
D’autres peptides ont été identifiés comme se liant spécifiquement au lipide II. C’est le cas
notamment de la mersacidine, un lantibiotique produit par les bactéries du genre Bacillus
(Brotz et al., 1998). Au laboratoire, une bactériocine de classe IIa, la mésentéricine Y105, a
été isolée à partir du surnageant de culture de Leuconostoc mesenteroides Y105 (Héchard et
al., 1992). Il s’agit d’un peptide de 36 acides aminés qui possède une séquence primaire très
proche de celle de la leucocine A-UAL 187. La mésentéricine Y105 possède une activité
bactéricide contre L. monocytogenes en agissant sur une sous-unité d’une perméase de la
famille mannose, EII(Man) (t). La délétion de cette sous-unité abolit la sensibilité de L.
monocytogenes envers la bactériocine (Dalet et al., 2001).
II.3.2
Perturbation de la membrane cytoplasmique
La membrane cytoplasmique est le support de plusieurs fonctions essentielles chez les
bactéries. De telles fonctions incluent la perméabilité sélective et le maintien de gradients,
l’énergétique cellulaire conduit par le transport d’électron et la phosphorylation oxydative, la
synthèse et le maillage du peptidoglycane ou encore la motilité (Yeaman & Yount, 2003). Les
Caractérisation et mode d’action de la warnéricine RK, un peptide anti-Legionella
45
peptides antimicrobiens vont s’adsorber sur la membrane cytoplasmique et la perméabiliser,
perturbant ainsi différentes fonctions (Brogden, 2005; Peschel, 2002). Ainsi, le traitement
avec Pep5, la pédiocine PA ou la lactacine F résulte en un rapide efflux d’acides aminés,
d’ATP et de sels (Jack et al., 1995). En effet, plusieurs études indiquent que l’utilisation de
certains peptides antimicrobiens induit rapidement la mort des cellules, moins de 5 minutes
après l’addition du peptide. Cette réponse rapide est attribuée à un disfonctionnement
généralisé des fonctions membranaires (dépolarisation, perte des gradients, perte de l’intégrité
membranaire…) (Boman et al., 1993; Tossi et al., 1997). Cependant, d'autres peptides,
comme la magainine 2 (Zasloff, 1987), la cécropine P1 (Boman et al., 1993) et PR-39
(Boman et al., 1993) tuent les bactéries en 15 à 90 minutes, indiquant la présence d’étapes
nécessaires à leur action bactéricide.
Plusieurs modèles d’interactions entre les peptides antimicrobiens et la membrane
cytoplasmique ont été proposés afin d’expliquer ces différentes observations (Figure 9).
A
A
B
C
D
D
E
B
C
Figure 9 : Modèles de perméabilisation de la membrane par des peptides antimicrobiens
(Melo et al., 2009). Adsorption des peptides sur la membrane (A), modèle du tonneau (B),
modèle du pore torique (C), modèle du tapis (D), modèle du pore torique désordonné (E).
Quelque soit le modèle d’action, les auteurs s’accordent pour dire que la première
étape, l’adsorption des peptides sur la membrane (Figure 9A), est une étape commune à la
plupart des peptides. Il est à noter que chez les bactéries à Gram négatif, qui possèdent deux
membranes, les peptides antimicrobiens semblent interagir probablement de façon
Caractérisation et mode d’action de la warnéricine RK, un peptide anti-Legionella
46
indépendante avec les membranes externes et internes (Yeaman & Yount, 2003). C’est le cas
par exemple des défensines humaines qui perméabilisent de manière séquentielle la
membrane externe puis la membrane interne. La perméabilisation de la membrane interne est
corrélée à la mort cellulaire (Lehrer et al., 1989).
II.3.2.1
Modèle du tonneau (barrel-stave model)
Le modèle classique pour expliquer la formation de pores dans des bicouches
lipidiques planes est appelé modèle du tonneau ou modèle de l’amas hélicoïdal (Baumann &
Mueller, 1974; Bechinger, 1999). Dans ce modèle, les hélices α des peptides forment un amas
dans la membrane ayant un lumen central à l’image d’un tonneau composé de peptides en
hélice α (Figure 9B).
L’alaméthicine est un peptide de 20 acides aminés isolé du champignon Trichoderma
viride (Payne et al., 1970). Les pores transmembranaires formés par ce peptide sont la parfaite
illustration du modèle du tonneau. L’alaméthicine adopte une configuration en hélice α, se lie
à la membrane, s’agrège et s’insère dans les bicouches lipidiques. Les régions hydrophobes du
peptide s’alignent avec les chaînes hydrocarbonées des phospholipides tandis que les régions
hydrophiles forment l’intérieur du pore. La formation de pore est très reproductible et les
pores sont bien définis avec, par exemple, des diamètres internes et externes respectifs
d’environ 1,8 nm et 4 nm, calculés en utilisant des membranes composées de DLPC (1,2dilauroyl-sn-glycero-3-phosphocholine). Les pores contienent entre 8 et 9 monomères
d’alaméthicine (He et al., 1996). Comme écrit précédement, la composition en lipide module
le ratio P/L et fait ainsi varier la taille des pores de l’alaméthicine (He et al., 1995; He et al.,
1996). Ces résultats sont en accord avec le modèle du tonneau proposé par Baumann et
Mueller en 1974 (He et al., 1996).
II.3.2.2
Modèle du pore torique (toroïdal pore)
Dans le modèle du pore torique, également connu sous le nom de modèle wormhole,
les peptides antimicrobiens, sous forme d’hélices α, s’insèrent de manière perpendiculaire
dans la membrane et induisent une courbure membranaire positive. Les hélices s’agencent de
manière à ce que les résidus polaires s’associent avec les têtes polaires des phospholipides
(Hirsh et al., 1996). Ces structures transitoires et multimériques forment un complexe
dynamique peptide/lipide créant un pore dont le lumen est bordé à la fois par le peptide et par
les têtes polaires des phospholipides (Figure 9C) (Matsuzaki et al., 1996; Yeaman & Yount,
2003). Ce modèle diffère du modèle précédent par le fait que les peptides sont toujours
Caractérisation et mode d’action de la warnéricine RK, un peptide anti-Legionella
47
associés avec les têtes polaires des lipides même quand ils sont insérés dans la membrane
(Brogden, 2005). A la désintégration du pore, quelques peptides sont transloqués dans la
cellule ce qui suggère que le désassemblage du pore torique pourrait être un mécanisme
important par lequel les peptides pénètrent dans le cytoplasme pour accéder à des cibles
intracellulaires (Uematsu & Matsuzaki, 2000).
Ce modèle a été conçu par deux équipes de recherche distinctes, travaillant sur le
mode d’action de la magainine 2 (Ludtke et al., 1996; Matsuzaki et al., 1996). Les pores
formés par ce peptide sont plus gros et plus variables que ceux formés par l’alaméthicine
(Ludtke et al., 1996). En effet, ils ont un diamètre interne de 3 à 5 nm, un diamètre externe de
7 à 8,4 nm et chaque pore contient de 4 à 7 monomères de peptide et environ 90 molécules
lipidiques (Brogden, 2005). De plus, la magainine 2 induit un basculement des phospholipides
par diffusion latérale d’un feuillet de la membrane à l’autre, indiquant une interaction
dynamique entre peptide et lipide (Matsuzaki et al., 1996). D’autres peptides ont été décrits
comme agissant par le même mécanisme, c’est le cas des protégrines et de la mélittine par
exemple (Brogden, 2005).
Récemment, une modification de ce modèle a été proposée par Leontiadou et al. : le
modèle de pore torique désordonné (Figure 9E). Ils mettent en évidence que les pores formés
par MG-H2, un analogue de la magainine 2, s’insère dans la membrane faite de DPPC
(dipalmitoylphosphatidylcholine), sans orientation particulière, formant des pores qui sont
loin d’être cylindriques comme le suggère le modèle classique (Leontiadou et al., 2006).
Figure 10 : Modèle du pore torique désordonné (Sengupta et al., 2008)
La partie torique du pore est formée par des molécules de lipides avec des peptides
liants, principalement, au bord du pore (Figure 10). La mélittine nécessite un certain ratio P/L
ainsi que la formation d’agrégats pour perméabiliser les membranes de DPPC en formant des
pores spontanémement. Seulement un ou deux peptides bordent le pore, sans adopter de
configuration transmembranaire particulière (Sengupta et al., 2008).
Caractérisation et mode d’action de la warnéricine RK, un peptide anti-Legionella
48
II.3.2.3
Modèle du tapis (carpet model)
La dermaseptine S1 est un peptide de 34 acides aminés riche en lysines qui adopte une
structure en hélice α à l’image des magainines (Mor & Nicolas, 1994). Sur la base des
résultats expérimentaux obtenus avec ce peptide, un troisième modèle a été proposé : le
modèle du tapis (Figure 9D). En effet, les résultats suggèrent que les peptides, lorsqu’il sont
liés à des lipides chargés négativement, restent à la surface de la membrane de manière à
former un tapis (Pouny et al., 1992). Une grande densité de peptides s’accumule sur la surface
de la membrane puis déstabilise la membrane de façon similaire à celle d’un détergent,
entraînant la formation de micelles et de pores dans la membrane lorsqu’une certaine
concentration peptidique est franchie (fort ratio P/L) (Jenssen et al., 2006). La présence de
lipides chargés négativement aide à la formation d’un tapis dense en réduisant les répulsions
électrostatiques entre les peptides cationiques (Oren & Shai, 1998).
Caractérisation et mode d’action de la warnéricine RK, un peptide anti-Legionella
49
Figure 11: Modèle du tapis (Oren & Shai, 1998). Les peptides sont liés à la surface de la
membrane avec leurs faces hydrophobes (vert) au contact des têtes polaires et leurs faces
hydrophiles (rouge) orientées vers le solvant (A). Quand une concentration seuil en peptide
monomérique est atteinte, la membrane se désintègre en plusieurs morceaux. A cette étape un
pore transitoire est formé (B et C).
Le modèle du tapis se décompose en 3 grandes étapes. La première étape, commune à
d’autres peptides antimicrobiens, consiste en la liaison des monomères de peptides
préférentiellement aux têtes polaires des phospholipides (Figure 11A). Le peptide effectue
une rotation qui conduit à une réorientation des résidus hydrophobes vers la partie
hydrophobe de la membrane (Figure 11B) et finalement à la désintégration de la membrane
par disruption de sa courbure (Figure 11C). L’étape précédant la rupture de l’intégrité
membranaire peut conduire à la formation de canaux transitoires dans la membrane (Figure
11B) (Shai, 1999).
Caractérisation et mode d’action de la warnéricine RK, un peptide anti-Legionella
50
II.3.2.4
Modèle detergent-like
Ce modèle, plus généraliste que les modèles précédents, est basé sur la désintégration
graduelle de la membrane en fonction de la concentration en peptides. Le terme detergent fait
référence au fait que les peptides, comme les détergents, peuvent avoir des effets dépendants
de leur concentration sur la membrane, induisant ainsi une perturbation de la membrane à
faible concentration et la solubilisation de celle-ci, à forte concentration. De ce fait, il englobe
les précédents modèles qui ne représenteraient que des cas particuliers où les conditions
seraient favorables pour la formation de structures transitoires (pores ou tapis).
Le modèle detergent-like se subdivise ainsi en deux grandes parties : l’action de peptides à
faible concentration (faible ratio P/L) et à forte concentration (fort ratio P/L) (Figure 12)
(Bechinger & Lohner, 2006).
Faible ratio P/L
A
C
B
Fort ratio P/L
Figure 12 : Modèle detergent-like (Bechinger & Lohner, 2006). A faible ratio P/L, les
peptides perturbent la membrane
comme
des molécules de type détergent selon trois
Perméabilisation
de la membrane
mécanismes (A, B, C). A fort ratio P/L, la membrane est désintégrée comme décrit par les
modèles du tapis et du pore torique.
A faible ratio P/L, trois effets sont répertoriés (Bechinger & Lohner, 2006). Une
micelle de peptide peut s’insérer dans la membrane, interagir avec les lipides et former une
structure de type pore sans pour autant avoir une structure et une taille définie (Figure 12A).
Une micelle peut interagir avec la membrane de manière à adsorber des molécules lipidiques
Caractérisation et mode d’action de la warnéricine RK, un peptide anti-Legionella
51
et créer des ouvertures transitoires (Figure 12B). Les peptides s’adsorbent sur la membrane et
la déstabilisent (Figure 12C).
A fort ratio P/L, la membrane se désintègre comme décrit par les modèles tapis et
pores toriques (Bechinger & Lohner, 2006).
L’exemple d’un tel mécanisme est donné par la trichogine GA IV isolée du
champignon Trichoderma longibrachiatum, qui forme des agrégats en solution aqueuse et
dans la membrane, agrégats qui induisent une perméabilité membranaire via la formation de
pores (Stella et al., 2004). Ce mécanisme d’agrégation qui favoriserait la formation de pores
est également retrouvé chez la mélittine (Brown et al., 1980), la δ-hémolysine (Fitton, 1981;
Thiaudiere et al., 1991) ainsi que chez un analogue de la magainine 2 (Leontiadou et al.,
2006) L’addition de mélittine ou de δ-hémolysine à faible ratio P/L sur des membranes de
DPPC ou DMPC (dimyristoylphosphatidylcholine) n’a que peu d’effet mais quand le ratio
P/L augmente, des micelles sont retrouvées dans le milieu, confortant ainsi l’idée d’une
désintégration graduelle de la membrane (Dufourcq et al., 1986; Lohner et al., 1999; Peschel,
2002; Verdon et al., 2009).
Indépendamment du modèle de perméabilisation choisi, un seuil de concentration
semble requis pour perméabiliser la membrane. Ce phénomène a été montré dans plusieurs
études (Dufourcq et al., 1986; Leontiadou et al., 2006; Lohner et al., 1999; Pistolesi et al.,
2007). Il faut également noter que le ratio P/L nécessaire à la désintégration de la membrane
varie selon la nature du peptide et la composition lipidique de la cible (Lee et al., 2004).
Beaucoup de paramètres entrent en compte lors de la perméabilisation de la
membrane. Le gradient électrochimique (Δψ) bactérien, notamment, pourrait être un facteur
déterminant dans l’activité de certains peptides antimicrobiens (Yeaman & Yount, 2003).
Ainsi, un Δψ seuil est nécessaire pour l’activité de certains peptides comme la nisine
(Breukink & de Kruijff, 1999) ou la warnérine IEGM KL-1 dont l’activité est dépendante du Δψ
transmembranaire (Korobov et al., 2005).
II.3.3
Perturbation du fonctionnement de la cellule
La perturbation de la membrane cytoplasmique n’est pas toujours suffisante pour tuer
des microorganismes. Un tel effet à notamment été souligné par Koo et al. en 2001 qui a
montré que la perméabilisation seule de S. aureus par le tPMP-1, la gramicidine D et la
protamine ne conduit pas invariablement à la mort de la cellule ou à son absence de
cultivabilité (Koo et al., 2001). C’est la même chose lors de l’action de la gramicidine S sur
Caractérisation et mode d’action de la warnéricine RK, un peptide anti-Legionella
52
P. aeruginosa (Zhang et al., 2000). Ces résultats renforcent l’hypothèse que la
perméabilisation de la membrane et la mort cellulaire pourraient être des événements
distincts. Ainsi, les interactions de plusieurs peptides antimicrobiens avec une ou plusieurs
cibles intracellulaires ont été mises en évidence, interactions qui conduisent à la perturbation
de processus métaboliques vitaux et à la mort cellulaire (Tossi & Sandri, 2002).
II.3.3.1
Inhibition de la synthèse du peptidoglycane
La biosynthèse du peptidoglycane est intégralement reliée à l’intégrité membranaire et
à sa fonction (Figure 13).
Figure 13 : Cibles des peptides antimicrobiens (Brogden, 2005).
Les précurseurs sont activés et transportés au travers de la membrane cytoplasmique et
l’assemblage à lieu à l’extérieur de la cellule. La réaction de polymérisation est une étape
cruciale de la biosynthèse du peptidoglycane qui permet de transformer le dernier précurseur,
le lipide II (undecaprenyl-pyrophosphoryl-MurNAc-(pentapeptide)-GlcNAc) monomèrique,
en un peptidoglycane polymérique naissant (Bauer & Dicks, 2005).
Quelques peptides antimicrobiens ont été identifiés comme inhibant la biosynthèse du
peptidoglycane. C’est le cas notament de la plasmine séminale bovine (Chitnis & Prasad,
1990), de l’épidermine, la mersacidine ou encore de la nisine (Brotz et al., 1998) qui forment
Caractérisation et mode d’action de la warnéricine RK, un peptide anti-Legionella
53
un complexe avec le lipide II. Ainsi, le lantibiotique mersacidine cible spécifiquement un site
de liaison du lipide II (Brotz et al., 1998), différent de celui utilisé par certains antibiotiques
comme la vancomycine qui cible le motif D-ala D-ala de la partie C-terminale de la chaîne
latérale du pentapeptide (Goldman et al., 2000). De façon intéressante, le lipide II joue à la
fois le rôle de récepteur de la nisine puisqu’elle bloque son incorporation dans le
peptidoglycane mais également le rôle de composant intrinsèque du pore formé par ce peptide
(Breukink et al., 2003).
II.3.3.2
Inhibition de fonctions intracellulaires
Une fois dans le cytoplasme, les peptides antimicrobiens peuvent altérer la formation
du septum, inhiber la synthèse des acides nucléiques, inhiber la synthèse protéique ou encore
inhiber des fonctions enzymatiques (Brogden, 2005).
Des peptides tels que PR-39 ou l’indolicine induisent la filamentation des bactéries
cibles car elles sont incapables de se diviser (Figure 13). Le blocage de la réplication de
l’ADN ou l’inhibition de protéines membranaires impliquées dans la formation du septum
pourraient être à l’origine de la filamentation (Hsu et al., 2005; Shi et al., 1996; Sitaram &
Nagaraj, 1999; Subbalakshmi & Sitaram, 1998). De façon intéressante, la pleurocidine et la
dermaseptine S1 inhibent la synthèse d’acides nucléiques et de protéines à leur concentration
minimale inhibitrice (CMI) sans endommager la membrane d’E. coli (Patrzykat et al., 2002).
PR-39 arrête la synthèse protéique et induit la dégradation de quelques protéines requises pour
la réplication de l’ADN (Boman et al., 1993). L’indolicine inhibe complètement la synthèse
d’ADN tout en ayant peu ou pas d’effet direct sur la synthèse d’ARN et des protéines
(Subbalakshmi & Sitaram, 1998). Des peptides antimicrobiens d’insectes tels que la
pyrrhocoricine, la drosocine et l’apidaecine, se lient spécifiquement à la protéine de choc
thermique DnaK et non spécifiquement à GroEL, une chaperone bactérienne (Otvos et al.,
2000).
L’étude du mode d’action des peptides antimicrobiens suggère que la mort cellulaire
pourrait être le résultat de divers mécanismes d’actions dus à la présence de plusieurs cibles
potentielles, certaines étant cytoplasmiques. Ce phénomène a été nommé multihit process
(Zhang et al., 2000).
Caractérisation et mode d’action de la warnéricine RK, un peptide anti-Legionella
54
II.4
Mécanismes de résistances
En considérant le fait que chaque espèce bactérienne rencontre des microorganismes
compétiteurs ou des cellules hôtes qui produisent des peptides antimicrobiens, on s’attend à ce
que la plupart des bactéries aient développé des stratégies pour échapper à leur action. En
effet, des bactéries de diverses niches écologiques sont capables de résister à de fortes
concentrations de peptides antimicrobiens produits localement (Kraus & Peschel, 2006).
Les mécanismes de résistance les plus étudiés seront décrits dans ce chapitre avec un
exemple concret illustrant chaque mécanisme. Ils ont été divisés en quatre groupes en accord
avec différentes revues (Figure 14) (Brogden, 2005; Kraus & Peschel, 2006; Nizet, 2006;
Peschel & Sahl, 2006) :
- la dégradation protéolytique
- les mécanismes de piégeage
- le transport actif utilisant les pompes à efflux
- les modifications des propriétés de surface qui incluent les modifications de charge et
les modifications de récepteurs/cibles
Caractérisation et mode d’action de la warnéricine RK, un peptide anti-Legionella
55
Figure 14 : Mécanismes de résistance des bactéries aux peptides antimicrobiens (Peschel
& Sahl, 2006). Dégradation protéolytique des peptides antimicrobiens (a), piégeage des
peptides antimicrobiens (b), transport actif des peptides antimicrobiens hors de la cellule (c),
modifications des propriétés de surface avec illustration d’une modification des charges (d).
II.4.1
Dégradation protéolytique des peptides antimicrobiens
La production d’enzymes protéolytiques, décrite chez les bactéries à Gram positif et à
Gram négatif, est un mécanisme très utilisé pour la résistance aux antibiotiques. Les 
lactamases, par exemple, dégradent les antibiotiques possédant un cycle  lactame comme les
pénicillines (Tenover, 2006). Cette dégradation protéolytique constitue également la voie la
plus directe pour inactiver les peptides antimicrobiens (Figure 14a). Ces molécules peuvent
être sécrétées ou présentes à la surface de la bactérie (Kraus & Peschel, 2006).
La cathélicidine LL-37 est la cible de nombreuses protéases sécrétées par des
pathogènes humains. Ainsi, une cystéine protéase produite par S. pyogenes, une
métalloprotéase produite par P. mirabilis, une élastase produite par P. aeruginosa, une
gélatinase produite E. faecalis ou encore l’auréolysine (métalloprotéase) produite par S.
Caractérisation et mode d’action de la warnéricine RK, un peptide anti-Legionella
56
aureus sont autant de facteurs qui clivent et inactivent la cathélicidine humaine (Schmidtchen
et al., 2002; Sieprawska-Lupa et al., 2004).
La protéase membranaire PtgE de S. enterica clive spécifiquement des peptides
antimicrobiens hélicoïdaux tels que C18G et LL-37 (Guina et al., 2000).
II.4.2
Mécanismes de piégeage
Certaines bactéries sont capables d’inhiber l’action de peptides antimicrobiens en
limitant l’accès à la membrane cytoplamisque via l’utilisation de molécules de piégeage
(Figure 14b). Cette forme de résistance peut être exercée soit de manière directe à travers les
actions de protéines de surface ou sécrétées soit de manière indirecte par le relargage de
molécules liant les peptides antimicrobiens à partir de la surface cellulaire de l’hôte avec une
très forte affinité (Nizet, 2006).
La sécrétion de staphylokinase par S. aureus est un exemple de piégeage direct par
l’intermédiaire de molécules sécrétées. La staphylokinase, une exoprotéine activatrice du
plasminogène, possède également une très forte affinité pour les α-défensines humaines
(HNP-1 et HNP-2). Non seulement la staphylokinase est capable d’induire rapidement le
relargage d’α-défensines par les leucocytes de sang périphérique mais également de les
neutraliser. L’effet bactéricide des peptides antimicrobiens est presque totalement inhibé (Jin
et al., 2004). Le piégeage direct par des protéines de surface est illustré par la protéine M1 de
Streptococcus pyogenes. La protéine M est un facteur de virulence ancré au peptidoglycane de
la bactérie par la région C-terminale et qui présente une région N-terminale hypervariable.
Cette haute variabilité donne naissance à différents génotypes, 124 sont reconnus aujourd’hui
(Bisno et al., 2003). Le génotype le plus fréquent, M1, est associé à la résistance de la bactérie
à la cathélicidine LL-37 (Kraus & Peschel, 2006).
Le piégeage indirect passe par l’exploitation de molécules chargées négativement qui
décorent la surface des cellules épithéliales. Par exemple, E. faecalis et P. aeruginosa
sécrètent des protéases qui vont dégrader la décorine et autres protéoglycanes cellulaires,
induisant ainsi le relargage du dermatane sulfate. Ce glycosaminoglycane libre va à son tour
se lier aux α défensines humaines et les inactiver (Schmidtchen et al., 2001).
II.4.3
Transport actif des peptides antimicrobiens
Les systèmes d’efflux sont reconnus comme des mécanismes de résistance aux
antibiotiques conventionnels. Les catégories majeures incluent les pompes alimentées en
énergie par l’ATP et les pompes fonctionnant grâce à la force proton motrice (Levy, 2002).
Caractérisation et mode d’action de la warnéricine RK, un peptide anti-Legionella
57
Leur implication dans l’augmentation du nombre de bactéries résistances aux antibiotiques est
telle que de nombreux inhibiteurs de ces pompes sont étudiés (Pages & Amaral, 2009).
Certaines bactéries sont capables d’utiliser ces pompes à efflux pour exporter les peptides
antimicrobiens hors de la cellule et limiter leur action (Figure 14c). C’est le cas par exemple
du système MtrCDE de Neisseria gonorrhoeae qui expulse des agents antimicrobiens tels que
la protégrine-1 et la cathélicidine LL-37 (Shafer et al., 1998). De plus, les souches
bactériennes productrices de lantibiotiques contiennent des transporteurs ABC qui expulsent
le peptide hors de la cellule et leur confèrent une résistance contre le peptide qu’elle produit.
Cependant ce mécanisme semble être très spécifique du peptide produit par la souche et ne la
protège pas contre un large spectre de peptides antimicrobiens (McAuliffe et al., 2001;
Peschel & Gotz, 1996). S. aureus possède un plasmide de résistance, pSK1 qui code une
pompe à efflux, QacA. Lorsqu’elle est présente, cette pompe confère une résistance au
peptide tPMP-1 (Kupferwasser et al., 1999).
II.4.4
Modifications des propriétés de surface
L’un des mécanismes de résistance aux peptides antimicrobiens les plus important est
d’empêcher les peptides d’intéragir avec l’enveloppe bactérienne (Breukink & de Kruijff,
2006). En effet, la nature cationique des peptides antimicrobiens leur permet d’interagir avec
les molécules de l’enveloppe bactérienne qui possédent une charge nette négative telles que le
peptidoglycane, la plupart des phospholipides, le lipide A (bactéries à Gram négatif) ou les
acides teichoïques (bactéries à Gram positif). Ce mécanisme de résistance est donc basé sur la
diminution des interactions électrostatiques, ce qui entraine une réduction de l’affinité du
peptide pour l’enveloppe bactérienne (Figure 14d) (Peschel & Sahl, 2006). Cependant, la
nature différente de la paroi des bactéries à Gram positif et à Gram négatif apporte un certain
niveau de spécificité quant à la modification des propriétés de surface.
La paroi des bactéries à Gram positif est fortement chargée négativement à cause de
l’abondance de groupements phosphates dans la structure des acides teichoïques du
peptidoglycane. Certaines souches bactériennes telles que S. aureus, L. monocytogenes et
certains Streptococcus incorporent de grandes quantités de résidus D-alanine réduisant la
charge négative globale de l’enveloppe (Nizet, 2006). Chez S. aureus, cette D-alanylation est
réalisée par quatre gènes (dltABCD) organisés en opéron. La rupture de cet opéron abolie la
résistance aux défensines et augmente la sensibilité à une large variété d'autres peptides
antimicrobiens cationiques allant des peptides porcins en feuillet  (protégrines) aux peptides
Caractérisation et mode d’action de la warnéricine RK, un peptide anti-Legionella
58
en hélice α tels que la magainine 2 (Peschel et al., 1999). De même, le mécanisme le plus
important conférant une résistance à la nisine est de rendre le lipide II inacessible pour le
peptide. Pour ce faire, la bactérie utilise les charges positives apportées par les résidus Dalanines pour modifier la charge globale de l’enveloppe bactérienne et ainsi empêcher la
nisine d’agir (Breukink & de Kruijff, 2006).
D’autres bactéries ont développé des modifications de leur membrane plasmique.
Ainsi, certains S. aureus présentent au niveau de leur membrane cytoplasmique du
lysylphosphatidylglycérol, un phospholipide dérivé du phosphatidylglycérol (PG) modifié par
un résidu L-lysine, lui conférant une charge globale positive (Figure 15).
Figure 15 : Voie d’aminoacylation ARNt-dépendante du phosphatidylglycérol
membranaire chez S. aureus (Roy et al., 2009).
Cette modification est codée par le gène mprF qui possède des homologies de
séquences avec des gènes de bactéries à Gram positif et négatif de P. aeruginosa, Bacillus
anthracis, Mycobacterium tuberculosis et E. faecalis (Peschel et al., 2001).
Chez les bactéries à Gram négatif, la charge négative du LPS due à la richesse en
groupement phosphate du lipide A favorise l’adsorption des peptides (Nizet, 2006). Ainsi, des
modifications de la charge globale du LPS entraînent une augmentation de la résistance de
certaines bactéries aux peptides antimicrobiens. S. enterica et P. aeruginosa, par exemple,
incorporent des molécules d’aminoarabinoses chargées positivement, réduisant ainsi l’affinité
Caractérisation et mode d’action de la warnéricine RK, un peptide anti-Legionella
59
des peptides antimicrobiens et augmentant la résistance des bactéries (Ernst et al., 2001).
Beaucoup d’espèces bactériennes à Gram négatif possèdent les gènes pmr responsables du
transfert de l’aminoarabinose au lipide A suggérant que cette modification est une
caractéristique étendue chez les bactéries à Gram négatif (Miller et al., 2005). Une autre voie
de résistance est l’incorporation d’acides gras supplémentaires au lipide A (Peschel, 2002).
Chez S. typhimurium, cette modification est sous la dépendance du gène pagP qui code une
protéine de la membrane interne ou périplasmique. De plus, l’acylation du lipide A réduit la
perméabilité de la membrane externe et confère une résistance accrue au peptide synthétique
C18G (Guo et al., 1998). Un homologue de la protéine PagP a été décrit chez Legionella
pneumophila, la protéine Rcp. C’est une protéine impliquée dans la virulence de la bactérie et
dans l’infection intracellulaire d’hôtes eucaryotes. Elle est présente chez plusieurs
sérogroupes et espèces de Legionella ce qui tendrait à montrer sa vaste distribution au sein de
ce phylum. Elle est également impliquée dans la résistance accrue de Legionella aux peptides
antimicrobiens C18G et également la polymyxine B (PmB), contrairement à la protéine PagP
de Salmonella (Robey et al., 2001).
Pour les peptides antimicrobiens dont l’action est médiée par un récepteur spécifique,
une modification de ce récepteur entraîne une résistance accrue de la souche au peptide. Ce
mécanisme de résistance est très fréquent dans la résistance aux antibiotiques. C’est le cas, par
exemple, de la vancomycine qui intéragit avec le lipide II. La conversion de la D-alanine
terminal en D-Lactate conduit à une chute de l’affinité de l’antibiotique pour le lipide II,
rendant ainsi l’antibiotique inefficace (Arthur & Courvalin, 1993). La mésentéricine Y105 est
une bactériocine de sous-classe IIa qui intéragit avec EII(Man) (t), une perméase PTS de la
famille mannose chez L. monocytogenes. Le domaine IICMan-IIDMan membranaire de la
perméase sert de molécule d’ancrage ou de récepteur spécifique. La délétion du gène codant
la protéine IIDMan conduit à la résistance de la bactérie vis-à-vis de la mésentéricine Y105
(Dalet et al., 2001) tandis que son expression chez une bactérie normalement insensible
comme L. lactis conduit à un phénotype de sensibilité (Ramnath et al., 2004).
Caractérisation et mode d’action de la warnéricine RK, un peptide anti-Legionella
60
Chapitre III.
III.1
Legionella
Généralités
III.1.1
Historique
En juillet 1976, une épidémie de pneumonie frappa plusieurs participants de la 58ème
convention annuelle de la Légion Américaine à Philadelphie, en Pennsylvanie (McDade et al.,
1977). Sur un total de 182 cas déclarés, 147 patients furent hospitalisés et 29 d’entre eux
décédèrent (Fraser et al., 1977). Ce n’est qu’en janvier 1977 que l’agent responsable de
l’épidémie fût isolé par Joseph McDade et Charles Shepard (CDC, Atlanta) grâce à
l’utilisation d’un protocole de recherche des Rickettsia (agent responsable du typhus) faisant
intervenir un hôte animal (le cobaye) (McDade et al., 1977). Le genre Legionella fut établi en
1978 lors du premier symposium international sur la maladie des légionnaires et la bactérie
isolée fut nommée Legionella pneumophila à cause de sa prédilection pour l’infection des
poumons (Brenner et al., 1979). Il faut noter que les premières souches de Legionella furent
en réalité mises en évidence par Tatlock en 1943 ainsi que par Jackson et al. en 1947 mais
elles ont été considérées à l’époque comme des bactéries de type Rickettsia (Fields et al.,
2002).
III.1.2
Taxonomie
La famille des Legionellaceae forme un sous-groupe de la subdivision γ des
protéobactéries et consiste en un seul genre, le genre Legionella (Diederen, 2008; Fields et al.,
2002; Fry et al., 1991). L’utilisation de la séquence du gène codant l’ARN 16S a permis de
montrer que tous les membres de la famille des Legionellaceae sont très proches
phylogénétiquement (plus de 95% d’homologie de séquence) (Fry et al., 1991). Le nombre
d’espèces connues et de sérogroupes continue d’augmenter. Il y a actuellement plus de 53
espèces comprenant au moins 70 sérogroupes distincts (Diederen, 2008; Fields et al., 2002).
L’espèce pneumophila, qui comporte 15 sérogroupes, est la plus fréquemment retrouvée en
pathologie humaine.
Dans la famille des Legionellaceae sont également retrouvées des bactéries qui ne
peuvent pas être cultivées in vitro. Elles nécessitent la présence de protozoaires et sont, de ce
fait, difficiles à étudier. La plupart ont été isolées à partir d’échantillons associés à des cas
Caractérisation et mode d’action de la warnéricine RK, un peptide anti-Legionella
61
confirmés de légionellose. Elles se répartissent en 5 branchements phylogénétiques à
l’intérieur de la famille des Legionellaceae et ont été nommées LLAP (Legionella-like
amoebal pathogens). Elles sont génétiquement proches des Legionellaceae (de 91,2% à 97%
d’homologie par rapport au séquençage du gène de l’ARN 16S selon les LLAP) (Adeleke et
al., 1996).
III.1.3
Morphologie et caractères biochimiques
Les membres de la famille des Legionellaceae sont des bacilles à Gram négatif
(coloration peu marquée), aérobies, non sporulés, non capsulés. Ce sont des bactéries
hautement pléomorphes que ce soit in vitro ou in vivo lors du cycle de développement
intracellulaire (Faulkner & Garduno, 2002; Mauchline et al., 1992). En milieu de culture, leur
taille est généralement comprise entre 0,3 et 0,9 µm de large sur 2 à 20 µm de longueur
(Diederen, 2008). Elles sont mobiles grâce à la présence d’un flagelle exceptée L.
oakridgensis (Bornstein et al., 1991). Le flagelle est principalement situé en position
monopolaire, voir en position subpolaire pour L. pneumophila (Rodgers et al., 1980). Son
expression est dépendante de l’état physiologique de la bactérie et des conditions
environnementales (Byrne & Swanson, 1998).
Leur culture est réalisée sur un milieu gélosé spécifique désigné BCYE (Buffered
Charcoal Yeast Extract) contenant du tampon ACES (N-2-acetamido-2-aminoethansulfonic
acid), de l’extrait de levure et du charbon activé (Feeley et al., 1979; Pasculle et al., 1980). Le
charbon permet de neutraliser l’effet toxique du peroxyde d’hydrogène et des radicaux
superoxydes produits par oxydation après autoclavage de l’extrait de levure ainsi que de sousproduits d’oxydation de la cystéine (Hoffman et al., 1983). La croissance des bactéries du
genre Legionella exige la complémentation du milieu en L-cystéine ainsi qu’en
pyrophosphate de fer soluble. Le pH du milieu optimal pour la croissance bactérienne est de
6,9 (Feeley et al., 1979). Les Legionella sont des bactéries mésophiles ; elles croissent entre
25°C et 42°C, avec un optimum de température à 35°C (Fields et al., 2002).
Les Legionella utilisent les acides aminés comme source de carbone et d’énergie. Elles
sont cependant auxotrophes pour certains acides aminés tels que la cystéine, la sérine et la
thréonine (Pine et al., 1979; Tesh et al., 1983). Néanmoins, la sérine et, dans une moindre
mesure la thréonine, peuvent être utilisées comme unique source de carbone et d’énergie.
Elles n’hydrolysent pas les carbohydrates (ni par oxydation, ni par fermentation) (George et
al., 1980; Pine et al., 1979).
Caractérisation et mode d’action de la warnéricine RK, un peptide anti-Legionella
62
III.1.4
Analyse génomique
L’analyse et la comparaison du génome de divers isolats de Legionella sont utiles pour
la compréhension du mode de vie parasitaire de cette bactérie et de son adaptation à un hôte.
Il y a actuellement 4 souches de L. pneumophila dont le génome a été entièrement séquencé
(Jules & Buchrieser, 2007). Les souches Lens et Paris, toutes deux isolées lors d’épidémies de
légionellose en France, ont été séquencées par l’unité de Génomique des Microorganismes
Pathogènes de l’Institut Pasteur de Paris (Cazalet et al., 2004). La souche Philadephia 1,
dérivée de la souche identifiée à Philadelphie lors de la première épidémie de légionellose
rapportée en 1976, a été séquencée aux Etats-Unis (Chien et al., 2004). Enfin, la souche
Corby, une souche particulièrement virulente isolée à partir d’un patient atteint de
légionellose, a été séquencée récemment en Allemagne (Steinert et al., 2007). Toutes ces
souches appartiennent au sérogroupe 1 qui est responsable de plus de 90% des cas de
légionellose. La souche Paris est la seule souche endémique connue à ce jour. Tandis que les
autres souches provoquent des cas dans une région limitée, la souche Paris est associée à des
cas de légionellose partout en France et même en Europe (Aurell et al., 2003). Elle est ainsi
responsable de 12,7% des cas de légionellose en France et de 33% des cas dans la région
parisienne où elle fut notamment à l’origine de l’épidémie de l’hôpital Georges Pompidou. La
souche Lens, quant à elle, est la souche responsable de la plus grande épidémie de
légionellose survenue en France entre Novembre 2003 et Janvier 2004 avec 86 cas et 17 décès
(Cazalet & Buchrieser, 2005).
Le génome de L. pneumophila consiste en un seul chromosome circulaire ayant une
taille de 3,3 Mpb (mégapaires de bases) à 3,6 Mpb et un contenu en G-C de 38%. Tous les
chromosomes possèdent des régions qui peuvent s’exciser et être maintenues sous forme
plasmidique. D’autre part, les souches Lens et Paris possèdent chacune un plasmide
additionnel de taille différente (132 kbp pour Paris et 60 kbp pour Lens). Environ 3000 gènes
sont prédits pour toutes les souches dont 60% sont similaires à des gènes présents chez
d’autres organismes dont le génome a été totalement séquencé. Certains de ces gènes
possèdent des fonctions bien caractérisées ce qui permet de prédire une fonction chez L.
pneumophila (Steinert et al., 2007). Les génomes montrent une organisation très similaire
mais possèdent une très grande plasticité et diversité. Environ 2400 gènes sont conservés alors
que 10% des gènes sont souches spécifiques (Jules & Buchrieser, 2007). Environ 20% des
gènes prédits sont spécifiques aux bactéries du genre Legionella (Cazalet et al., 2004). Une
des découvertes majeures de l’analyse du génome de L. pneumophila est la présence d’un
Caractérisation et mode d’action de la warnéricine RK, un peptide anti-Legionella
63
grand nombre de gènes codant pour des protéines d’origine eucaryote, qui sont prédites pour
moduler les fonctions de la cellule hôte à l’avantage du parasite pathogène (Cazalet et al.,
2004). Il est intéressant de noter que le génome de L. pneumophila est sujet au transfert
horizontal de gènes et qu’environ 2,4% du génome semble avoir été acquis par ce mécanisme
(de Felipe et al., 2005). Ces nouvelles séquences d’ADN témoignent de la plasticité du
génome de Legionella (Steinert et al., 2007).
L’analyse et la comparaison du génome des 4 souches reflètent l’histoire et le style de
vie intracellulaire de L. pneumophila. L’excision et l’intégration de matériel génétique semble
représenter un des mécanismes exploité par la bactérie pour s’adapter à son environnement.
Plusieurs protéines, qui paraissent être d’origine eucaryote, ont été identifiées également chez
d’autres pathogènes intracellulaires (Coxiella, Mycobaterium…) mais L. pneumophila se
présente comme étant l’organisme procaryote avec la plus grande diversité de gènes d’origine
eucaryote (Cazalet et al., 2004).
III.2
Écologie
Les Legionella sont des bactéries d’origine hydrotellurique que l’on retrouve dans les
sols humides et dans les eaux douces (lacs, rivières) à partir desquels elles colonisent des sites
hydriques artificiels (Philippe et al., 2006). L. pneumophila fait partie de la communauté
microbienne naturelle des écosystèmes aquatiques (Fliermans et al., 1981). La température, le
contenu organique et inorganique de l’eau et la présence de protozoaires sont autant de
facteurs qui jouent un rôle important dans la croissance et la dissémination de la bactérie
(Fliermans et al., 1981; Stout et al., 1985). Généralement, sa présence dans l’environnement
est attribuée à une coexistence avec d’autres microorganismes comme les amibes et ce,
particulièrement au sein de biofilms multi-espèces.
III.2.1
Interaction avec un biofilm
La légionellose est associée à l’exposition humaine d’eau circulant dans des
environnements artificiels tels que les systèmes de distribution d’eau chaude, les tours
aéroréfrigérantes (TAR), les douches, les spas… Dans ces environnements, la croissance
microbienne est détectée quasiment exclusivement dans les biofilms qui tapissent l’intérieur
des tuyaux composants le réseau d’eau, dans les systèmes d’air conditionné et de
ventilation… (Figure 16) (Lau & Ashbolt, 2009).
Caractérisation et mode d’action de la warnéricine RK, un peptide anti-Legionella
64
Figure 16 : Développement et relarguage de Legionella dans un système de distribution
d’eau (Lau & Ashbolt, 2009). Legionella sp. et des protozoaires entrent dans les systèmes de
distribution d’eau (1) et sont absorbés dans le biofilm (2). Legionella se développe à
l’intérieur du biofilm (3a) ou après ingestion par des protozaoires (3b). Legionella est
relarguée dans le milieu extérieur enchassée dans la matrice du biofilm (4a) ou est présente à
l’intérieur de protozoaires (4b) ou à l’intérieur de vacuoles relarguées par les protozoaires
(4c).
Les biofilms sont des communautés complexes de microorganismes, qui se
développent sur des surfaces à l’intérieur d’une matrice polymérique extracellulaire. La
formation d’une telle structure est le résultat d’un processus d’accumulation, non uniforme
dans le temps et/ou dans l’espace, de matières organiques, de microorganismes, de minéraux
et d’autres composants sur un support. Il s’agit d’un processus dynamique (Hall-Stoodley &
Stoodley, 2002). L’ancrage des premières espèces colonisatrices est facilité par la production
d’exopolysaccharides et aboutit à l’établissement d’un environnement plus riche (débris
cellulaires, métabolites excrétés…), permettant la colonisation par des espèces copiotrophes
qui sont plus exigeantes en termes de nutriments (Szewzyk et al., 2000). Les bactéries du
genre Legionella sont retrouvées dans les biofilms de réseaux (Declerck et al., 2007a) ou dans
des biofilms libres (Declerck et al., 2007b) et ont dû développer des mécanismes pour se
nourrir en résidant dans ces structures. Par exemple, L. pneumophila possède un
comportement nécrotrophique c’est-à-dire qu’elle est capable de survivre et de se développer
sur une matrice de cellules microbiennes inactivées par la chaleur, présentes au sein du
biofilm ou en suspension dans l’eau (Temmerman et al., 2006). De plus, Lehtola et al ont
montré que L. pneumophila est capable de survivre et de rester cultivable jusqu’à 15 jours
dans des biofilms soumis à de fortes forces de cisaillement et dans des conditions
d’écoulement turbulent (Lehtola et al., 2007).
Les avantages conférés par les biofilms sont nombreux en comparaison d’un état de
cellule unique en suspension (Davey & O'Toole G, 2000) :
Caractérisation et mode d’action de la warnéricine RK, un peptide anti-Legionella
65
-
la matrice extrapolymérique qui structure le biofilm apporte un certain degré de
protection et d’homéostasie vis-à-vis des stress environnementaux,
-
un échange de nutriments et de métabolites entre le biofilm et la phase aqueuse ainsi
qu’au sein du biofilm lui-même grâce à des canaux aqueux qui constituent une sorte de
système circulatoire primitif,
-
l’acquisition de nouveaux caractères génétiques par transfert horizontal de gènes est
favorisée par la proximité des cellules au sein de la structure.
III.2.2
Interaction avec des protozoaires
Les protozoaires sont des microorganismes eucaryotes se nourrissant par phagocytose
de bactéries, d’algues et de levures présentes à la surface des biofilms. En 1980, Rowbotham
fut le premier à montrer la prolifération intracellulaire de L. pneumophila environnementales à
l’intérieur de protozoaires et plus particulièrement, à l’intérieur d’amibes appartenant aux
genres Acanthamoeba et Naegleria (Rowbotham, 1980). L’étude de Holden en 1984 montre
que L. pneumophila croît rapidement lors d’une co-culture avec A. castellanii dans un milieu
qui ne permet pas sa multiplication ni sa survie (Holden et al., 1984).
A l’heure actuelle, plus de 20 espèces d’amibes, 2 espèces de protozoaires ciliés et
Dictyostelium discoideum permettent le développement intracellulaire de Legionella (Lau &
Ashbolt, 2009). Les amibes sont fréquemment isolées au niveau des réseaux d’eau chaude
sanitaire et d’installation de climatisation (Nahapetian et al., 1991). Elles constituent
vraisemblablement la principale niche de multiplication de Legionella.
La multiplication intracellulaire de Legionella à l’intérieur de protozoaires comme les
amibes se fait en plusieures étapes (Figure 17).
Caractérisation et mode d’action de la warnéricine RK, un peptide anti-Legionella
66
Figure 17 : Cycle de vie et d’infection de L. pneumophila (Molmeret et al., 2004).
Phagocytose (1), formation de la vacuole réplicative (2), multiplication intracellulaire (3a),
reprogramation génétique (3b), dissémination environnementale (4), contamination humaine
(5), infection d’un nouvel hôte (6).
Tout d’abord, les bactéries libres sont ingérées par l’amibe (Figure 17-1), et se
retrouvent à l’intérieur de phagosomes qui recrutent rapidement des organites tels que des
mitochondries et du réticulum endoplasmique rugueux (Figure 17-2). Ceci conduit à la
formation d’une vacuole réplicative. La clef de la virulence de L. pneumophila réside dans sa
capacité à prévenir la maturation du phagosome et la fusion phagosome/lysosome. Elle peut
ainsi se multiplier dans la vacuole réplicative jusqu’à atteindre une population assez
nombreuse avant de sortir de la cellule (Figure 17-3a).
Ce mécanisme de survie est dû notamment à l’expression de gènes particuliers
présents dans deux locus distincts : dot (defective for organelle trafficking) et icm
(intracellular multiplication) codant pour un système de sécrétion de type IV. Ce système est
une machinerie de translocation qui permet à la bactérie d’injecter des molécules effectrices
dans la cellule hôte durant l’infection. Actuellement, plus de 80 substrats ont été identifiés
(Ensminger & Isberg, 2009). L’inactivation des gènes des locus dot/icm (Figure 17-3b)
entraîne une incapacité pour la bactérie d’inhiber la fusion phagosome/lysosome et de se
multiplier (Horwitz, 1987; Marra et al., 1992; Roy et al., 1998). Ensuite, lorsque
l’environnement devient carencé en acides aminés, il y a synthèse de l’alarmone guanosine
Caractérisation et mode d’action de la warnéricine RK, un peptide anti-Legionella
67
3’-5’-bispyrophosphate (ppGpp) par la synthase RelA et accumulation, ce qui augmente le
taux de facteur sigma de phase stationnaire RpoS. RpoS va alors coordonner l’entrée de L.
pneumophila en phase stationnaire, lui permettant ainsi d’exprimer ses caractères de virulence
et de promouvoir sa transmission vers un nouvel hôte (Bachman & Swanson, 2001). Les
Legionella intra-amibiennes sont retrouvées sous 2 formes :
-
un forme réplicative, qui n’est pas mobile et apparaît comme très peu infectieuse,
-
une forme transmissive, qui est mobile et très infectieuse
On parle alors de cycle biphasique (Bruggemann et al., 2006). Les deux formes de
Legionella lors de sa croissance intra-amibienne peuvent être simulées in vitro par les
bactéries en phase exponentielle et stationnaire de croissance. En effet, les bactéries en phase
exponentielle de croissance, qui sont non flagellées, correspondent à la forme réplicative
tandis que les bactéries en phase post-exponentielles de croissance, qui sont flagellées,
fortement mobiles et virulentes, correspondent à la forme transmissive (Byrne & Swanson,
1998).
L. pneumophila tue la cellule hôte soit par apoptose soit par nécrose en utilisant un
système de formation de pore grâce notamment à la toxine Rib. Legionella se retrouvent
ensuite dans l’environnement à l’intérieur de vésicules ou sous forme libre si les vésicules ne
sont plus intègres (Figure 17-4) (Bouyer et al., 2007; Molmeret et al., 2004). En effet, Berk et
al. ont montré qu’après ingestion de Legionella, les amibes expulsaient des vésicules de
quelques µm de diamètre contenant des centaines de bactéries, confirmant ainsi les premières
observations faites par Rowbotham en 1980. Une étude récente a montré que L. pneumophila
était capable de survivre 6 mois dans des vésicules expulsées par des amibes et d’être encore
cultivables (Bouyer et al., 2007). A l’intérieur des vésicules, les bactéries sont plus résistantes
à un traitement de type biocide que les bactéries libres (Berk et al., 1998; Bouyer et al., 2007).
De même, comparé aux cellules cultivées in vitro, L. pneumophila s’étant multipliée dans les
amibes est beaucoup plus résistante aux traitements par des désinfectants et des biocides, à
l’osmolarité, la fluctuation de température, au pH…(Abu Kwaik et al., 1998; Barker et al.,
1993). Les vésicules restent libres dans le milieu et pourraient être des vecteurs de
transmission de la légionellose via les aérosols (Berk et al., 1998) (Figure 17-5).
Des données de biologie cellulaire et de génétique ont permis de mettre en évidence
que les mécanismes de survie de Legionella à l’intérieur des amibes étaient similaires à ceux
Caractérisation et mode d’action de la warnéricine RK, un peptide anti-Legionella
68
développés chez les macrophages alvéolaires. La virulence de L. pneumophila vis-à-vis des
macrophages alvéolaires est une conséquence de l’évolution de la bactérie comme parasite
naturel des amibes (Swanson & Hammer, 2000). L. pneumophila pénètre dans les voies
respiratoires via des aérosols contaminés et se loge à l’intérieur des macrophages alvéolaires
où elle peut se multiplier de la même façon que dans les amibes (Swanson & SturgillKoszycki, 2000). Beaucoup de facteurs permettant la multiplication de L. pneumophila chez
les macrophages sont également requis pour la multiplication chez les amibes. Par exemple, la
protéine Mip (macrophage infectivity potentiator) augmente le taux d’infection de la bactérie
aussi bien chez les macrophages humains que chez les amibes des genres Hartmannella et
Tetrahymena (Cianciotto & Fields, 1992). Ainsi, les amibes peuvent être considérées comme
un terrain d’entraînement pour la virulence de Legionella.
III.3
La légionellose
III.3.1
Sources de contaminations
La voie de transmission communément admise de la légionellose est l’inhalation
d’aérosols contaminés pouvant atteindre les alvéoles pulmonaires (Yu, 1993). Il n’y a pas de
transmission interhumaine avérée. Les sources exposant l’Homme à des contaminations sont
retrouvées dans des installations artificielles permettant une multiplication de Legionella dans
l’eau et plus particulièrement celles générant des aérosols. Ceci comprend par exemple les
TAR, les réseaux d’eau chaude sanitaire, les condensateurs d’évaporation, des conditionneurs
d’air, les bains bouillonnant, les douches, les machines à glace, les appareils d’assistance
respiratoire et les systèmes d’eau des cabinets dentaires (Atlas, 1999).
Concernant les cas groupés de légionellose, ce sont les TAR qui ont été mises en cause
le plus fréquemment (Source InVS). Depuis la première description de la légionellose (Fraser
et al., 1977) jusqu’à l’épidémie de Lens (Nguyen et al., 2006), les TAR, par leur capacité à
disperser des aérosols contaminés (Ishimatsu et al., 2001), constituent les installations les plus
fréquemment liées aux épidémies de légionellose. Pendant l’épidémie de Lens, des cas ont été
recensés jusqu'à 12 kilomètres de la source de contamination, laissant apparaître la grande
dispersion atmosphérique des microgouttelettes d’eau (Nguyen et al., 2006).
Caractérisation et mode d’action de la warnéricine RK, un peptide anti-Legionella
69
III.3.2
Symptômes
Les maladies provoquées par les bactéries du genre Legionella sont regroupées sous le
terme générique de légionellose (Steinert et al., 2002). Il existe cependant deux formes de
pathologies bien distinctes qui diffèrent l’une de l’autre par leur gravité.
♦ La forme bénigne de la légionellose, également appelée fièvre de Pontiac, est un
syndrome pseudo-grippal (fièvre, frissons, céphalées, myalgies, mal de gorge, nausées, toux
sèche) qui se déclare après une brève période d’incubation (de 1 à 2 jours). La fièvre de
Pontiac n’est pas associée à une pneumonie et se résorbe spontanément après quelques jours
(Edelstein & Meyer, 1984; Fraser et al., 1979).
♦ La forme sévère, communément appelée maladie du légionnaire ou légionellose, est
une pneumonie dont la période d’incubation est en moyenne de 2 à 10 jours et dépend de
plusieurs facteurs tels que l’état du système immunitaire du patient ou de la prise plus ou
moins rapide d’antibiotiques. L’apparition des symptômes est en général graduelle et
commence par des malaises, un état de léthargie et de faiblesse. Généralement, les symptômes
des voies respiratoires supérieurs sont absent à ce stade. La plupart des patients présentent une
toux sèche dans les premiers jours qui suivent la déclaration de la maladie. Environ 95% des
patients ont de la fièvre qui augmente de façon brutale. Plusieurs symptômes accompagnent
fréquemment la poussée de fièvre et peuvent être regroupés sous trois grandes catégories
(Benhamou et al., 2005) :
-
Neurologiques (confusion, désorientation, hallucinations, amnésie, céphalées…)
-
Digestifs (douleurs abdominales, vomissements, diarrhée…)
-
Biologiques (cytolyse hépatique, syndrome glomérulaire et/ou insuffisance rénale…)
Les facteurs de risques de la légionellose sont liés au sexe (maladie plus fréquente
chez les hommes), à l’âge (supérieur à 50 ans en moyenne), au tabagisme, à l’éthylisme, aux
états d’immunodépression, ainsi qu’à l’existence d’infections respiratoires chroniques
(Benhamou et al., 2005) (Source InVS). Legionella est ainsi qualifiée de pathogène
opportuniste (Swanson & Hammer, 2000).
III.3.3
Épidémiologie
La légionellose est une maladie à déclaration obligatoire en France depuis 1987
(Benhamou et al., 2005). Grâce au renforcement du dispositif de surveillance de la
Caractérisation et mode d’action de la warnéricine RK, un peptide anti-Legionella
70
légionellose en 1997 et la sensibilisation des professionnels de santé, le nombre de cas de
légionellose en France, déclarés auprès des autorités sanitaires, a fortement augmenté. Depuis
2005, il semble se stabiliser autour de 1400 cas par an (Figure 18) et pour l’année 2007, la
mortalité était d’environ 9% avec un total de 130 morts (Source InVS).
Depuis Août 2003, 28 épidémies de légionellose ont été rapportées en France avec un
taux de mortalité moyen de 11,8% (Source InVS). L. pneumophila représente 99% des cas
diagnostiqués de légionellose en France en 2005 avec le sérogroupe 1 qui constitue 95% des
cas (Campese et al., 2007).
1800
1600
1400
Nombre de cas
1200
1000
800
600
400
200
0
Année
Figure 18 : Evolution du nombre de cas de la légionellose en France entre 1988 et 2008.
Graphique réalisé selon les données de l’InVS disponibles en Octobre 2009
Au niveau européen, le EWGLI (The European Working Group for Legionella
Infections) a établi un système de surveillance des infections à Legionella, le EWGLINET.
Pour les années 2005 et 2006, un total de 11980 cas de légionellose a été reporté avec un taux
de mortalité de 6,6% (Ricketts & Joseph, 2007; Ricketts et al., 2008). Ce programme est
coordonné en France par le Centre National de Référence des Légionelloses de Lyon.
Même si L. pneumophila sérogroupe 1 compte pour la majorité des isolats de
Legionella en Europe et aux Etats-Unis, elle n’est responsable que d’environ 50% des cas de
légionellose en Australie et en Nouvelle-Zélande (Yu et al., 2002). L. longbeachae est
Caractérisation et mode d’action de la warnéricine RK, un peptide anti-Legionella
71
notamment responsable de 30,4% des cas dans ces deux pays. D’autres espèces de Legionella
sont également liées à des cas de legionellose à travers le monde comme L. bozemanii, L.
micdadei, L. dumofii, L. feeleii, L. wadsworthii et L. anisa.
III.3.4
Traitements
Le traitement antibiotique de la légionellose fait principalement appel aux molécules
de
type
macrolides
(érythromycine,
clarithromycine…),
azalides
(azithromycine),
fluoroquinolones (ciprofloxacine ; lévofloxacine…), tétracyclines (doxycycline) et à la
rifampicine (Diederen, 2008). La localisation intracellulaire de Legionella au sein des
macrophages alvéolaires est un paramètre important pour l’action des antimicrobiens qui
doivent combiner une forte activité contre le pathogène tout en étant capable de pénétrer à
l’intérieur des cellules (Roig & Rello, 2003). La durée du traitement varie entre 14 et 21 jours
chez l'immunocompétent et sera poursuivie jusqu'à 30 jours chez l'immunodéprimé ou dans
les formes sévères. L’association d’antibiotiques est réservée au traitement des formes sévères
et/ou des sujets immunodéprimés atteints de légionellose. L’Afssaps (Agence française de
sécurité sanitaire des produits de santé) recommande une monothérapie à base de macrolide
ou de fluoroquinolones pour les formes de légionellose à gravité légère voire modérée et une
association de 2 antibiotiques parmi l’érythromycine, la spiramycine, les fluoroquinolones et
la rifampicine pour les formes graves et les patients immunodéprimés (Benhamou et al.,
2005).
Les macrolides sont un groupe d’antibiotiques dont l'activité est due à la présence
d'un cycle lactone sur lequel un ou plusieurs sucres peuvent être attachés. L’érythromycine
constitue depuis l’épidémie de 1976 à Philadelphie le traitement de référence de la
légionellose (Fraser et al., 1977). Cependant, des rapports d’échec de traitement avec
l’erythromycine, l’interférence de cet antibiotique avec le métabolisme d’autres drogues
particulièrement chez les patients immunodéprimés, l’apparition d’effets secondaires à fortes
doses à conduits les chercheurs à évaluer de nouveaux antibiotiques (Mercatello et al., 1985).
Les quinolones et fluoroquinolones forment un groupe d’antibactériens de synthèse
qui comprend les dérivés de l'acide nalidixique. L'ajout de l'atome de fluor dans les années
1970 a permis d'augmenter fortement la pénétration des molécules quinolones dans les
cellules (jusqu'à 200 fois plus) ; ce fut la naissance des fluoroquinolones, puissants
antibiotiques capables de lutter contre une grande variété de germes chez l'Homme et l'animal
(Hooper & Rubinstein, 2003). Une étude récente à montrée qu’elles étaient au moins aussi
Caractérisation et mode d’action de la warnéricine RK, un peptide anti-Legionella
72
efficace que l’érythromycine (Sabria et al., 2005) tout en conférant une meilleure réponse
clinique notamment en terme de délai d’hospitalisation (Pedro-Botet & Yu, 2006).
III.4
Enveloppe de Legionella
L’enveloppe bactérienne est l’une des parties les plus importantes de la cellule
procaryote, véritable barrière filtante qui joue aussi le rôle exosquelette, confèrant sa forme à
la cellule et lui permettant de résister à la forte pression osmotique interne. L’enveloppe est
notamment formée d'un polymère, le peptidoglycane, encore appelé mucopeptide ou muréine.
Il est à l’origine de la classification dichotomique entre bactéries à Gram positf et bactéries à
Gram négatif. Certaines couches de l’enveloppe sont le site de nombreux déterminants
antigéniques majeurs tels que le lipopolysaccharide, propre aux bactéries à Gram négatif.
L’enveloppe des bactéries à Gram positif est riche en acides teichoïques, absents chez les
bactéries à Gram négatif et en acides diaminopiméliques, moins abondants chez les bactéries
à Gram négatif, lesquelles ont une enveloppe plus riche en lipides (Prescott et al., 2003).
Les structures les plus remarquables de l’enveloppe bactérienne de Legionella, le LPS,
le peptidoglycane ainsi que les composants des membranes externes et internes
(phospholipides, acides gras et les quinones isoprénoïdes) seront décrits dans ce chapitre.
III.4.1
Lipopolysaccharide
Pour rappel, le LPS est composé de deux parties : une partie lipidique (lipide A) et une
partie oligosaccharidique (polysaccharide central et chaîne latérale O) (Nizet, 2006) (voir
Chapitre II.3.1).
♦ Le principal sucre identifié dans le lipide A du LPS de Legionella est le 2,3diamino-2,3-didéoxy-D-glucose (GlcN3N) (Albers et al., 2007). Ce sucre est substitué par un
mélange complexe d’acides gras retrouvé uniquement chez diverses espèces de Legionella
incluant L. pneumophila, L. erythra, L. oakridgensis, L. bozemanii, L. longbeachae, L. feeleii,
L. hackeliae, L. jordanis, L. israelensis, L. maceachernii et L. micdadei. Ainsi, le GlcN3N est
substitué par 16 à 23 espèces différentes d’acides gras hydroxylés en position 3, des acides
gras non hydroxylés et des acides gras rares à longue chaîne (Sonesson et al., 1989; Sonesson
et al., 1994a; Sonesson et al., 1994b). Ces acides gras rendent le lipide A de Legionella très
hydrophobe en comparaison de celui d’autres bactéries (Zahringer et al., 1995).
Caractérisation et mode d’action de la warnéricine RK, un peptide anti-Legionella
73
♦ La partie oligosaccharidique du LPS de L. pneumophila est composé d’un
nonasaccharide qui ne contient pas d’heptose ni de phosphate mais qui contient, par contre,
des sucres ayant perdu un groupement -OH en position 6. De plus, il est fortement O- et Nacétylé (Zahringer et al., 1995). La chaîne latérale O, également appelée antigène O, du LPS
de L. pneumophila est un homopolymère d’une unité monosaccharidique unique, l’acide 5acétamidino-7-acétamido-8-O-acétyl-3,
5,
7,
9-tetradésoxy-D-glycéro-D-galacto-non-2-
ulosonique plus communément appelé acide légionaminique. La rareté des groupes
hydroxyles libres de la chaine latérale O de L. pneumophila est responsable de son
hydrophobicité élevée (Knirel et al., 1994). Le LPS de L. pneumophila est très hydrophobe en
comparaison de celui d’autres bactéries à Gram négatif telles que E. coli ou Salmonella sp.
(Sonesson et al., 1994b).
Plus récemment, le LPS a été montré comme un facteur sujet à des modifications
régulées par le stade de développement de L. pneumophila (Fernandez-Moreira et al., 2006).
Les auteurs ont mis en évidence des changements dans la composition du LPS entre les
phases réplicatives et transmissives de L. pneumophila et que, ces changements étaient liés à
la capacité de la bactérie de prévenir la fusion phagosome/lysosome (Fernandez-Moreira et
al., 2006).
III.4.2
Peptidoglycane
Le peptidoglycane est un polymère de glycosaminopeptide où la N-acétylglucosamine (NAG) et l'acide N-acétyl-muramique (NAM) sont liés par des liaisons osidiques
β 1→4. Une sous-unité du peptidoglycane est composée d’un enchaînement de NAG et de
NAM avec des chaînes trétrapeptidiques, reliées au NAM, qui sont composées d’une
alternance d’acides aminés D et L. L’ensemble des sous-unités sont reliées entre-elles par des
ponts interpeptidiques (Prescott et al., 2003).
Très peu d’études ont analysées le peptidoglycane de Legionella. En 1983, Amano et
al. ont montré que le peptidoglycane de L. pneumophila possédait les mêmes composants que
ceux déjà décrits pour d’autres bactéries à Gram négatif (Schleifer & Kandler, 1972). Il est
composé d’acide muramique, de glucosamine, d’acide glutamique, d’alanine et d’acide mesodiaminopimélique. Il est hautement maillé, de l’ordre de 80% à 90% et est résistant à la
digestion par le lysozyme (Amano & Williams, 1983). Deux protéines liées directement au
peptidoglycane ont été caractérisées : une protéine de 31 kDa (Butler & Hoffman, 1990) et
une protéine de 19 kDa (Ludwig et al., 1991).
Caractérisation et mode d’action de la warnéricine RK, un peptide anti-Legionella
74
♦ La protéine de 31 kDa est liée de façon covalente à la porine MOMP (protéine
majoritaire de la membrane externe de L. pneumophila) et les auteurs suggèrent qu’elle aurait
un rôle de protéine d’ancrage membranaire (Butler & Hoffman, 1990). De façon intéressante,
la protéine MOMP est présente chez de nombreuses espèces du genre Legionella (Butler et
al., 1985). Ce type de structure apparait unique des bactéries du genre Legionella puisque
chez d’autres bactéries, cet ancrage de la membrane externe au peptidoglycane est réalisé par
des lipoprotéines (Butler & Hoffman, 1990).
♦ La protéine de 19 kDa, PplA, est beaucoup moins abondante que la protéine de 31
kDa et possède une homologie de séquence avec les lipoprotéines d’E. coli K12 et H.
influenzae (Ludwig et al., 1991).
III.4.3
III.4.3.1
Phospholipides membranaires
Structure
Les phospholipides sont constitués d’un squelette de glycérol possédant 2 molécules
d’acides gras sur les positions sn-1 et sn-2, ainsi qu’un groupement phosphate en position sn3. Ce groupement phosphate porte la tête (R) du phospholipide (Figure 19). Les
phospholipides sont des molécules de nature amphiphile puisque les chaînes d’acides gras
sont hydrophes et que la partie supérieure (tête plus phosphate) est hydrophile. Les
phospholipides existent sous des formes zwittérioniques ou anioniques. Le phosphate
possédant une charge négative, la charge globale du phospholipide est apportée par la charge
de la tête polaire En effet, la phosphatidylsérine (PS), le phosphatidylinositol (PI) et le
phosphatidylglycérol (PG) possèdent une tête polaire qui peut être chargée négativement
contrairement à la phosphatidyléthanolamine (PE) et la phosphatidylcholine (PC) qui ont une
tête polaire chargée positivement.
Caractérisation et mode d’action de la warnéricine RK, un peptide anti-Legionella
75
Figure 19 : Structure des principaux phospholipides bactériens (Fang & Barcelona,
1998). Molécule représentant la tête du phospholipide (R), R1, R2 et R’ représentent les
parties alkyles des chaînes d’acyles gras.
Le métabolisme des phospholipides a été intensivement étudié en utilisant E. coli
comme modèle pour les bactéries à Gram négatif et B. subtillis pour les bactéries à Gram
positif. Les deux microorganismes possèdent PE, PG et CL comme phospholipides
membranaires majoritaires (Cronan, 1968; den Kamp et al., 1969). En plus de ces
phospholipides, d’autres phospholipides membranaires peuvent être retrouvés chez les
bactéries comme la PC. Egalement appelée lécithine, la PC est un phospholipide
majoritairement retrouvé dans les cellules eucaryotes. Une récente estimation suggère que
probablement plus de 10% de toutes les bactéries contiennent du PC comme phospholipide
membranaire (Sohlenkamp et al., 2003). De plus, la plupart des bactéries qui contiennent du
Caractérisation et mode d’action de la warnéricine RK, un peptide anti-Legionella
76
PC appartiennent au sous-groupe des α et des γ protéobactéries comme Legionella (LopezLara & Geiger, 2001).
Peu d’études traitent de la composition en phospholipides membranaires des bactéries
du genre Legionella. En 1979, Finnerty et al. ont caractérisé les phospholipides de 10 isolats
cliniques de Legionella. Les résultats montrent que la bactérie responsable de l’épidémie de
Philadelphie possède plusieurs espèces de phospholipides membranaires : PC, PE et ses
dérivés
MMPE
et
DMPE
(monométhylphosphatidyléthanolamine
et
diméthylphosphatidyléthanolamine), CL ainsi que PG (Finnerty et al., 1979). Ces résultats
sont confirmés en 1984 par Hindalh et al. puis en 2008 par Conover et al. qui retrouvent ces 4
espèces majoritaires chez L. pneumophila (Conover et al., 2008; Hindahl & Iglewski, 1984).
L’espèce PC représente environ 30% des phospholipides de L. pneumophila (Conover et al.,
2008; Hindahl & Iglewski, 1984).
Très récemment, l’étude de la composition en lipides membranaires de L. lytica a été
réalisée par un groupe de recherche polonais. Cette bactérie possède PC et PE comme
phospholipides majoritaires (Palusinska-Szysz et al., 2008). De façon intéressante, ils n’ont
pas retrouvés de CL.
Il a été montré que PC était important pour la virulence de L. pneumophila. En effet, la
perte de PC dans la membrane entraîne une diminution de l’infection des macrophages ainsi
qu’une diminution de la cytotoxicité de la bactérie. Ces effets sont corrélés à une diminution
de l’expression de la flagelline, une diminution de l’adhésion aux macrophages et une
diminution de la translocation d’effecteurs via le système dot/icm (Conover et al., 2008).
III.4.3.2
Biosynthèse
La voie de biosynthèse des phospholipides a été très largement étudiée chez E. coli
puis chez d’autres microorganismes (Figure 20).
Caractérisation et mode d’action de la warnéricine RK, un peptide anti-Legionella
77
(PA)
(PS)
(PE)
(PG)
(CL)
Figure 20 : Voie de biosynthèse des phospholipides chez E. coli (Cronan, 2003). Les têtes
des phospholipides sont attachées à la partie acide phosphorique en tant que phosphodiesters.
Le nom des protéines, dérivé du nom des gènes, est donné pour chaque étape.
La première étape est la formation de sn-glycérol-3-phosphate (G3P) à partir de
dihydroxyacétone phosphate (DHAP). Le premier acide gras est ensuite fixé sur le G3P pour
former un monoacyl-G3P (acide lysophosphatidique). Cette réaction est catalysée par
l’enzyme PlsB. Le deuxième acide gras est fixé sur le squelette G3P pour former l’acide
phosphatidique (PA). Cette réaction est catalysée par l’enzyme PlsC. La dernière étape,
catalysée par l’enzyme CDP-diglyceride synthase, permet de convertir le PA en intermédiaire
activé, cytidine diphosphate-diglycéride (CDP-diglycéride) qui peut ensuite être utilisé dans la
synthèse de PE ou de PG et de CL (Cronan, 2003).
Jusqu’en 1997, les scientifiques pensaient que, pour la biosynthèse de PC chez les
bactéries, seule la voie de méthylation avait lieu. Cependant, une deuxième voie existe, la
Caractérisation et mode d’action de la warnéricine RK, un peptide anti-Legionella
78
voie de la phosphatidylcholine synthase (Pcs), distincte de la voie CDP-choline des
eucaryotes et qui semble être spécifique des bactéries.
De façon intéressante, des homologues du gène pcs de S. melitoti sont retrouvés chez
les bactéries pathogènes P. aeruginosa, Borrelia burgdorferi et L. pneumophila (39%, 29% et
27% d’identité entre acides aminés respectivement). Les cadres ouverts de lecture
homologues de pcs codent les activités Pcs et doivent constituer les enzymes de P.
aeruginosa, Borrelia burgdorferi et L. pneumophila (Martinez-Morales et al., 2003) Des
extraits cellulaires de L. pneumophila ont permis de mettre en évidence une acticité Pcs et
Pmt. L’activité Pmt est codée par des homologues de PmtA (Martinez-Morales et al., 2003).
Il apparait ainsi que plusieurs bactéries possèdent deux voies de biosynthèse de PC, les voies
Pmt et Pcs. Cependant d’important pathogènes tels que P. aeruginosa ou B. burgdorferi
apparaissent comme exceptionnels car ils ne possédent que la voie Pcs pour la formation de
PC (Lopez-Lara & Geiger, 2001; Martinez-Morales et al., 2003).
III.4.4
III.4.4.1
Acides Gras
Structure
Les acides gras, retrouvés dans les phospholipides, sont des acides carboxyliques
(COOH) à chaîne carbonée plus ou moins longue (de 14 à 20 atomes de carbone pour les plus
communs) qui peuvent présenter une ou plusieurs doubles liaisons intramoléculaires. Ils sont
qualifiés de saturés lorsqu’ils ne présentent aucune double liaison (noté CX:0) et d’insaturés
lorqu’ils présentent au moins une double liaison (noté CX:1). De même, beaucoup d’acides
gras contiennent des groupements méthyles branchés en position iso (sur l’avant dernier
carbone, noté iC) ou antéiso (sur l’antépénultième carbone, noté aC) (Figure 21).
Caractérisation et mode d’action de la warnéricine RK, un peptide anti-Legionella
79
Figure 21 : Structures des acides gras au sein des phospholipides membranaires et leur
rôle dans la fluidité membranaire (Zhang & Rock, 2008). Le chiffre situé à gauche indique
le nombre d’atomes de carbones et le chiffre situé à droite indique le nombre d’insaturations.
Les phosopholipides présentant des acides gras ramifiés sont caractéristiques des
bactéries à Gram positif. Ils sont présents en grande quantité (supérieur à 50% du total) chez
quelques genres bactériens tels que par exemple Bacillus, Listeria et Staphylococcus (Moss et
al., 1977).
En 1997, Moss et al. ont identifié la composition en acides gras de 4 isolats bactériens
de patients infectés lors de l’épidémie de légionellose un an plus tôt à Philadelphie et de deux
isolats reliés à des troubles respiratoires ayant eu lieu ailleurs aux Etats-Unis (Moss et al.,
1977). Peu après, ils ont déterminé la composition en acides gras de 36 nouveaux isolats
cliniques de légionellose (Moss & Dees, 1979). Les résultats des deux études montrent que
Legionella possède une composition en acides gras atypique pour une bactérie à Gram négatif
puisque qu’elle possède une grande quantité d’acides gras branchés (entre 79% et 90% du
total des acides gras). Une étude plus récente sur 23 espèces de Legionella a montrée que la
quantité d’acides gras branchés variait de 39% pour L. oakridgensis à 90% pour L. jordanis
Caractérisation et mode d’action de la warnéricine RK, un peptide anti-Legionella
80
avec un taux de 64% pour L. pneumophila (Lambert & Moss, 1989). C’est généralement une
caractéristique très répandue chez les bactéries à Gram positif alors que seuls 10 genres
bactériens ont été répertoriés chez les bactéries à Gram négatif comme possédant cette
particularité. Parmi ces genres, 4 présentent une grande homogénéité inter-espèces dans la
possession d’acides gras branchés : Legionella, Flavobacterium, Bacteroides et Desulfovibrio
(Kaneda, 1991).
Les bactéries ont développé des mécanismes pour contrôler la formation de nouveaux
acides gras ainsi que pour modifier la structure d’acides gras afin d'ajuster la viscosité
membranaire aux conditions environnementales (Zhang & Rock, 2008). En effet, les acides
gras vont directement agir sur la fluidité de la membrane selon leur structure. Les acides gras
saturés vont adopter une conformation linéaire compacte entraînant une rigidité importante de
la membrane. Au sein des acides gras insaturés naturels, la conformation de la double liaison
est de type cis (hydrogènes du même coté) ce qui conduit à une courbure rigide de la chaîne
aliphatique hydrophobe. Ceci a pour conséquence de diminuer les interactions hydrophobes
entre les chaînes d’acides gras et ainsi augmenter la fluidité membranaire.
La composition en acides gras branchés joue également sur la fluidité membranaire en
raison de l’effet destructeur du groupement méthyle sur le compactage des chaînes
aliphatiques hydrophes. Les acides gras antéiso induisent une membrane plus fluide que les
acides gras iso car leur groupement méthyle est plus loin de l’extrémité de la chaine (Zhang &
Rock, 2008). Les bactéries qui produisent ce type d’acides gras modifient la balance
iso/antéiso en réponse à des stress thermiques et chimiques. Ce type de modification a été très
étudié chez Listeria monocytogenes qui contient plus de 90% d’acides gras branchés et qui
augmente son taux de aC15:0 pour maintenir la fluidité de la membrane pour survivre à faible
température (Zhu et al., 2005).
La composition en acides gras est également modulée par différents facteurs tels que la
composition du milieu de culture, l’âge de la culture ou encore la température d’incubation
(Barker et al., 1993; Kaneda, 1971). Par exemple, les conditions de culture ont un effet
prononcé sur le contenu en acides gras de L. pneumophila (Tableau 3).
Caractérisation et mode d’action de la warnéricine RK, un peptide anti-Legionella
81
Tableau 3 : Composition en acides gras de L. pneumophila dans différentes conditions de
culture (Barker et al., 1993). L. pneumophila a été cultivée sur gélose BCYE comme témoin
et dans différentes conditions : croissance intra-amibienne, en milieu synthétique ABCD
déplété ou non en fer, en PO42- et en N2. Pour chaque acide gras, le nombre à gauche réfère au
nombre d'atomes de carbones et le nombre à droite au nombre d'insaturations. i, branché en
iso ; a, branché en antéiso ; Δ, cycle cyclopropane.
L’acide gras majoritaire de L. pneumophila est le iC16:0 (Lambert & Moss, 1989;
Moss et al., 1977; Moss & Dees, 1979) excepté lorsque la bactérie est cultivée en absence de
phosphate où le C16:1 devient majoritaire (Barker et al., 1993) (Tableau 3).
Très récemment la composition en lipides membranaires de L. lytica a été réalisée par
un groupe Polonais. Cette bactérie possède 54% d’acides gras branchés avec le C16:0 et le
aC15:0 comme acides gras majoritaires (Palusinska-Szysz et al., 2008).
III.4.4.2
Biosynthèse
La biosynthèse des acides gras est la première étape dans la formation des lipides
membranaires et représente un aspect vital de la physiologie bactérienne. Elle se divise en
deux voies distinctes appelées type I et II (Campbell & Cronan, 2001). Dans la voie de
biosynthèse de type I, les sites actifs catalysant les réactions sont retrouvés dans des domaines
distincts de grandes protéines multifonctionnelles. Les enzymes de biosynthèse des acides
gras sont appelées FAS I (Fatty Acid Synthase) peuvent présenter tous leur sites actifs sur une
seule protéine (comme chez les mammifères et les mycobactéries) ou répartis entre deux
protéines interagissant l’une avec l’autre (comme chez les champignons et Corynebacterium
ammoniagenes). Par contraste, dans la voie de biosynthèse de type II retrouvée chez les
Caractérisation et mode d’action de la warnéricine RK, un peptide anti-Legionella
82
plantes et la plupart des bactéries, toutes les réactions sont catalysées par un groupe fortement
conservé d’enzymes appelées FAS II (Figure 22). Cette voie de biosynthèse est encore
appelée système de biosynthèse dissocié des acides gras (Rock & Cronan, 1996).
Figure 22 : La voie de biosynthèse de type II des acides gras bactériens (Zhang & Rock,
2008). Etapes d’initiation de la biosynthèse des acides gras (a). Etapes d’élongation des acides
gras (b). Transfert des acides gras sur le glycérol-3-phosphate pour former de l’acide
phosphatidique (c).
Une caractéristique fondamentale du système de type II est la présence d’un
transporteur protéique d’acyles (ACP) qui transporte les intermédiaires acyles gras
hydrophobes d’enzyme en enzyme (Marrakchi et al., 2002). La première enzyme de cette voie
de biosynthèse est l’acétyl-CoA carboxylase, une enzyme hétérotétramérique codée par quatre
gènes accA, accB, accC et accD. Elle intervient dans la carboxylation de l’acétyl-CoA par les
4 sous-unités d’AccABCD. Le produit de cette réaction est le malonyl-CoA. Le groupe
malonate est alors transféré sur l’ACP par l’enzyme FabD (malonyl-CoA:ACP transacylase)
pour former du malonyl-ACP (Figure 22). L’élongation des acides gras est initiée par la
Caractérisation et mode d’action de la warnéricine RK, un peptide anti-Legionella
83
condensation de malonyl-CoA avec de l’acétyl-CoA par FabH (-ketoacyl-ACP synthase III)
pour former du -ketobutyryl-ACP et du dioxyde de carbone. Un cycle d’élongation à lieu,
ajoutant deux carbones par cycle, jusqu’à la formation d’un acide gras saturé. La première
étape de ce cycle d’élongation est la réduction NADPH-dépendante du -ketoacyl-ACP en hydroxyacyl-ACP par FabG (-ketoacyl-ACP reductase). Cette étape est suivie d’une
déshydratation de l’intermédiaire -hydroxylé pour donner du trans-2-enoyl-ACP cataylsée
soit par FabA (-hydroxydecanoyl-ACP dehydratase/isomerase) soit par FabZ (hydroxyacyl-ACP
déshydratase).
L’enzyme
FabA
est
également
responsable
de
l’isomérisation de la double liaison pour former un mélange de trans-2-decenoyl-ACP et de
cis-2-decenoyl-ACP et conduire à la formation d’acides gras insaturés (Rock & Cronan,
1996). La dernière étape du cycle d’élongation est la réduction NADPH-dépendante de la
double liaison de l’intermédiaire trans-2-enoyl-ACP par FabI, FabK ou FabL (enoyl-ACP
reducatse I, II ou III respectivement) pour former de l’acyl-ACP. Des cycles supplémentaires
d’élongation sont initiés par la condensation de malonyl-ACP avec de l’acyl-ACP par FabB
ou FabF (-ketoacyl-ACP synthase I ou II respectivement) (Figure 22) (Marrakchi et al.,
2002).
Le séquençage de nombreux génomes bactériens a permis de reconstruire le système
de type II par des homologies de séquence avec les gènes d’E. coli et de découvrir de
nouvelles enzymes impliquée dans la biosynthèse des acides gras (Tableau 4).
Tableau 4 : Enzymes identifiées du système FAS de type II (Marrakchi et al., 2002)
Caractérisation et mode d’action de la warnéricine RK, un peptide anti-Legionella
84
III.4.5
III.4.5.1
Quinones isoprénoïdes
Structure
Une autre caractéristique de la membrane de Legionella est la présence de quinones à
chaîne latérale composée d’unités d’isoprènes. Le contenu en quinones isoprenoïdes de
Legionella se résume à des ubiquinones avec une chaîne latérale qui varie de 9 à 14 unités
d’isoprènes (noté Q9 à Q14 respectivement) (Tableau 5). Les ubiquinones majoritaires varient
selon les espèces de Legionella et peuvent servir de critère de base pour différencier les
espèces de Legionella (Lambert & Moss, 1989).
Tableau 5 : Composition en ubiquinone de 23 espèces de Legionella (Lambert & Moss,
1989). Le chiffre situé à droite de Q (ubiquinone) indique le nombre d’unités isoprènes de la
chaîne latérale de l’ubiquinone.
Les quinones isoprénoïdes appartiennent à la classe lipidique des terpènes. Ces
molécules sont localisées dans la membrane plasmique bactérienne où elles jouent un rôle
important notamment dans le transport d’électrons et la phosphorylation oxydative. Deux
groupes structuraux majeurs de quinones isoprénoïdes bactériennes ont été identifiés : les
naphthoquinones et les benzoquinones (Collins & Jones, 1981).
Caractérisation et mode d’action de la warnéricine RK, un peptide anti-Legionella
85
Le premier groupe, les naphthoquinones, peut être subdivisé en deux sous-groupes,
les phylloquinones et les ménaquinones (Figure 23) (Collins & Jones, 1981) :
Figure 23 : Structures des principaux groupes de quinones isoprénoïdes (Collins &
Jones, 1981)
-
La phylloquinone ou vitamine K1, isolée pour la première fois en 1939 à partir de la
luzerne est associée à la partie verte des plantes et de façon plus rare aux bactéries
(Collins & Jones, 1981).
-
La famille des ménaquinones dont le premier composé, la vitamine K2, a été isolée
d’un plat de poisson avarié en 1939, comprend un grand nombre de molécules dont la
taille de la chaîne latérale C-3 varie de 1 à 14 unités d’isoprènes (Collins & Jones,
1981).
Le deuxième groupe de quinones isoprénoïdes bactériennes représente les
benzoquinones, qui comprennent deux grandes catégories de molécules : les plastoquinones et
les ubiquinones (Figure 24) (Collins & Jones, 1981) :
-
Les plastoquinones ont été isolées à l'origine à partir de la luzerne. Ces molécules sont
trouvées non seulement dans les tissus photosynthétiques de plantes supérieures mais
aussi dans les algues rouges, brunes et vertes ainsi que chez les cyanobactéries.
Caractérisation et mode d’action de la warnéricine RK, un peptide anti-Legionella
86
Cependant, elles semblent être absentes des bactéries photosynthétiques (Collins &
Jones, 1981).
-
La découverte de l’ubiquinone (coenzyme Q) est le résultat d'études indépendantes
menées en Angleterre et aux Etats-Unis. Les ubiquinones possèdent un noyau 2,3dimethoxy-5-methyl-1,4-benzoquinone avec une chaîne latérale en position 6
composée de plusieurs unités d’isoprènes (Figure 26). A l’image des ménaquinones,
les ubiquinones sont largement retrouvées dans la nature (Collins & Jones, 1981).
III.4.5.2
Quinones bactériennes
Chez les bactéries, la composition en quinones isoprénoïdes varie énormément entre
archaebactéries et eubactéries (Thomson, 1991). De même, au sein des eubactéries, plusieurs
facteurs influent sur la composition en quinones isoprénoïdes tels que la composition de la
paroi, la nécessité d’oxygène pour la croissance, les besoins nutritifs particuliers ou encore la
formation de spores (Collins & Jones, 1981). Les quinones isoprénoïdes retrouvées
appartiennent soit aux ubiquinones, soit aux ménaquinones soit à un mélange des deux avec
des longueurs de chaîne latérale variables. La taille de la chaîne latérale pour les ubiquinones
varie en moyenne entre 8 et 10 unités d’isoprènes (Collins & Jones, 1981). Les ubiquinones
possédant plus de 10 unités d’isoprènes dans la chaîne latérale n’ont été retrouvées qu’à l’état
de traces uniquement chez quelques bactéries à activité photosynthétique (Thomson, 1991)
ainsi que chez Legionella (Lambert & Moss, 1989). Quelques auteurs ont également mis en
évidence des traces de ménaquinones chez quelques espèces de Legionella comme L. feeleii
par exemple (Karr et al., 1982; Moss et al., 1983) même si la plupart des autres études n’en
ont pas détectées.
III.5
Molécules à activité anti-Legionella
Outre la warnéricine RK, d’autres molécules possèdent une activité anti-Legionella.
Elles seront regroupées selon leur nature chimique (agents de désinfections) ou biologique.
Les agents de désinfection les plus utilisés seront décrits dans une première partie et la
recherche de nouvelles molécules biologiques anti-Legionella sera présentée dans une
deuxième partie.
Les circuits et réseaux d’eau subissent épisodiquement des problèmes de
contamination (par des microorganismes ou de la matière organique) pouvant entrainer une
dégradation de la qualité microbiologique des eaux circulantes. C’est pourquoi, certains
Caractérisation et mode d’action de la warnéricine RK, un peptide anti-Legionella
87
milieux hydriques peuvent représenter des sites de prolifération et de dissémination par
exemple pour des germes pathogènes opportunistes tels que Legionella. Les installations de
TAR nécessitent donc des traitements de désinfection afin limiter le développement de ces
germes pathogènes dans leurs circuits.
III.5.1
Les
Agents de désinfection
traitements
de
désinfection
permettent
de
diminuer
le
nombre
de
microorganismes, par des procédés chimiques (biocides, biodispersants) ou des procédés
physiques (UV, ultrasons) (Kim et al., 2002). Les traitements chimiques sont plus courants
dans les TAR que les procédés physiques. Les produits biocides sont utilisés de deux façons :
-
en traitement préventif, qui a pour objectif d’éviter l’apparition d’une concentration en
Legionella supérieure à 103 UFC/L,
-
en traitement curatif, lorsque les seuils d’alerte en Legionella sont dépassés.
Parmi les procédés chimiques utilisés, deux types de traitements sont appliqués : les
traitements oxydants et les traitements non oxydants.
III.5.1.1
Agents oxydants
Les molécules oxydantes utilisées couramment sont des produits chlorés (chlore,
dioxyde de chlore ou monochloramine) ou des produits bromés (acide hypobromeux, bromure
de sodium, bromure d’ammonium).
Le chlore, sous la forme d’acide hypochloreux (HClO) majoritaire en dessous du pKa
(7,54 à 25°C), est le composé le plus utilisé pour la désinfection des eaux en raison de son fort
pouvoir oxydant (Loret et al., 2005). L’action du chlore est très rapide (moins de 5 minutes) et
cible différents composants de la cellule bactérienne (McKenna & Davies, 1988;
Schraufstatter et al., 1990). La lyse de la cellule ne constitue pas nécessairement le
mécanisme primaire d’inactivation bactérienne et seules de très fortes concentrations en
oxydants, de l’ordre de 100 mg/L pour le chlore, sont capables d’entraîner une effet lytique
(McKenna & Davies, 1988). De faibles concentrations en chlore suffisent à causer une
réduction de la croissance bactérienne et une diminution de l’activité métabolique de la cellule
(Small et al., 2007).
Les chloramines, dont la monochloramine, sont utilisées pour le traitement de l’eau
potable (aux Etats-Unis) et pour certaines TAR (Moore et al., 2006; Sanli-Yurudu et al.,
Caractérisation et mode d’action de la warnéricine RK, un peptide anti-Legionella
88
2007). Par comparaison avec le chlore, la monochloramine réagit avec un nombre plus réduit
de composés et va limiter son action aux acides nucléiques, au tryptophane et aux acides
aminés notamment ceux contenant du soufre (cystéine, méthionine) (LeChevallier et al.,
1988). La monochloramine semble avoir un pouvoir de désinfection plus faible que le chlore
sur les bactéries planctoniques (Loret et al., 2005; Tachikawa et al., 2005). En effet, il faut
utiliser une concentration en monochloramine 1000 fois supérieure à celle du chlore pour
obtenir un abattement équivalent (LeChevallier et al., 1988).
Lorsque le pH de l’eau de circuit est supérieur à 8, les produits bromés sont préférés
aux produits chlorés bien qu’il semble que le brome soit moins efficace que le chlore contre
Legionella (Kim et al., 2002).
III.5.1.2
Agents non oxydants
Parmi les biocides non oxydants, il existe une grande variété de désinfectants
organiques destinés à lutter contre Legionella (Kim et al., 2002). Parmi ceux-ci, les plus
utilisés sont les thiazolones, les amines halogénées et les aldéhydes.
Les thiazolones, qui sont retrouvées dans les produits de type Kathon® (Rohm and
Haas, Philadelphia) et le Proxel (ICI America, Inc), ont montré des résultats d’abattement
corrects aussi bien sur les Legionella planctoniques que sur les Legionella sessiles (Barker et
al., 1992; Wright et al., 1991). Parmi les amines halogénées, c’est le DBNPA (2,2-dibromo-3nitrilopropionamide) qui est le composé le plus utilisé. Le DBNPA est très efficace contre les
Legionella puisque des concentrations de 8 mg/L et 15 mg/L pendant 3 heures ont conduit à
des abattements respectifs de 3 et 4 log de Legionella planctoniques et sessiles (Kim et al.,
2002). Le glutaraldéhyde est l’aldéhyde le plus utilisé pour inactiver les Legionella. Des
essais réalisés sur des pilotes de réseau d’eau ont montré que le glutaraldéhyde à 100 mg/L est
efficace contre les Legionella planctoniques et sessiles (Green & Pirrie, 1993).
III.5.2
Molécules biologiques anti-Legionella
Dans le but de limiter l’impact écologique lié à l’utilisation massive de biocides mais
également de pallier aux phénomènes de résistances des bactéries, de nouvelles molécules
sont recherchées comme solution alternative dans la lutte contre les microoragnismes
pathogènes tels que Legionella. Ces molécules doivent être spécifiques de la cible et
biodégradables afin que les quantités ajoutées aux circuits soient en majorité utilisées pour
Caractérisation et mode d’action de la warnéricine RK, un peptide anti-Legionella
89
inactiver les Legionella et qu’elles présentent un faible impact sur l’Homme et
l’environnement.
Dans la littérature, peu de molécules anti-Legionella ont été décrites. La lactoferrine,
est une glycoprotéine liant le fer qui est présente dans différents fluides de l’organisme (lait,
salive, larmes…) (Bortner et al., 1986). Sous sa forme non saturée en fer, elle inhibe la
multiplication intracellulaire de L. pneumophila à l’intérieur de monocytes humains, en
limitant la quantité de fer disponible (Byrd & Horwitz, 1989; Byrd & Horwitz, 1991).
Une étude sur l’activité bactéricide de certaines huiles essentielles a montré que des
huiles de feuille de canellier appartenant à l’espèce Cinnamomum osmophloeum possédaient
une activité bactéricide contre L. pneumophila sg 1. Cet effet est dû au cinnamaldehyde,
composé majoritaire de ces huiles (Chang et al., 2008).
Le LBM415, un inhibiteur de peptides déformylases, possède une activité antiLegionella (CMI 4 µg/ml) in vitro et inhibe, de manière réversible, la croissance
intracellulaire de L. pneumophila dans des macrophages alvéolaires (Edelstein et al., 2005).
Cette activité bactéricide n’est pas spécifique des bactéries du genre Legionella puisque toutes
les souches testées de Staphylococcus sp, Streptococcus sp, Enterococcus sp, M. catarrhalis,
soit 680 souches, sont inhibées à 8 µg/ml ou moins de LBM415. Il en est de même pour les 50
souches de L. pneumophila testées (Fritsche et al., 2005).
Un total de 80 souches de bactéries aquatiques a été testé en activité contre L.
pneumophila. Environ 66% des souches produisent une substance active contre L.
pneumophila, notamment Pseudomonas fluorescens (Guerrieri et al., 2008).
Deux peptides antimicrobiens, PmB et C18G ont été utilisés pour évaluer la capacité
du gène rcp à permettre à L. pneumophila de résister aux peptides antimicrobiens. Les CMI de
PmB et C18G sur la souche sauvage sont de 12,5 µg/ml et 16 µg/ml respectivement (Robey et
al., 2001).
Caractérisation et mode d’action de la warnéricine RK, un peptide anti-Legionella
90
Partie 2. Matériel et Méthodes
Caractérisation et mode d’action de la warnéricine RK, un peptide anti-Legionella
91
Caractérisation et mode d’action de la warnéricine RK, un peptide anti-Legionella
92
Chapitre I.
I.1
Techniques de microbiologie
Souches bactériennes
Les souches bactériennes utilisées au cours de cette étude sont référencées dans le
Tableau 6.
Tableau 6 : Souches bactériennes utilisées au cours de l’étude
Souches
Références
Gram négatif
Enterobacter cloacae D03
Escherichia coli MG1655
Escherichia coli XL1 Blue
Hafnia alvei
Klebsiella pneumoniae 0502083
Legionella bozemanii ATCC 33217
Legionella dumoffii ATCC 33279
Legionella feeleii ATCC 35072
Legionella like bacteria (LLAP10)
Legionella longbeachae ATCC 33484
Legionella micdadei ATCC 33218
Legionella oakridgensis ATCC 33761
Legionella pneumophila Corby (sg1)
Legionella pneumophila Corby (sg1)
Legionella pneumophila Corby TF 3/1
Legionella pneumophila Lens (sg1)
Legionella pneumophila Paris (sg1)
Legionella pneumophila Philadelphia 130b
Legionella pneumophila Philadelphia NU260
Legionella pneumophila Philadelphia NU261
Legionella pneumophila ATCC 33155 (sg3)
Legionella pneumophila ATCC 33216 (sg5)
Legionella pneumophila ATCC 33215 (sg6)
Proteus mirabilis ATCC 35659
Pseudomonas aeruginosa DSMZ1129
Pseudomonas aeruginosa 910704
Salmonella typhimurium
LCME
LCME
Stratagene
LCME
LCME
LCME
LCME
LCME
LCME
LCME
LCME
LCME
LCME
Würzburg
Würzburg
LCME
LCME
Chicago
Chicago
Chicago
IFR62 Lyon Est
IFR62 Lyon Est
IFR62 Lyon Est
LCME
LCME
LCME
LCME
Caractérisation et mode d’action de la warnéricine RK, un peptide anti-Legionella
93
Gram positif
Bacillus megaterium F04
Bacillus subtilis
Enterococcus faecalis V583
Listeria monocytogenes EGDe
Micrococcus luteus
Pediococcus acidilactici 583
Staphylococcus aureus 971
Staphylococcus chromogenes
Staphylococcus cohnii 898
Staphylococcus epidermidis 567
Staphylococcus haemolyticus 694
Staphylococcus hominis 373
Staphylococcus lentus 982
Staphylococcus lugdunensis 967
Staphylococcus saprophyticus 715
Staphylococcus warneri 447
Staphylococcus warneri RK
I.2
LCME
LCME
LCME
LCME
LCME
LCME
LCME
LCME
LCME
LCME
LCME
LCME
LCME
LCME
LCME
LCME
Héchard et al., 2005
Milieux de culture
I.2.1
Culture de Legionella
Legionella a été cultivée à 37°C en milieu liquide BYE (Buffered Yeast Extract) ou sur
milieu gélosé BCYE (Buffered Charcoal Yeast Extract).
Le milieu BYE est composé, pour 1 litre, de 5 g d’ACES, de 10 g d’extrait de levure
puis est équilibré avec du KOH 10 N à pH 6,9. Après stérilisation par filtration à 0,22 μm, le
milieu est complémenté avec de la L-cystéine filtrée à 0,22 μm (0,4 g/l final) et du
pyrophosphate de fer filtré à 0,22 μm (0,25 g/l final).
Le BCYE est préparé, à partir de BYE non filtré, par ajout de charbon actif à 2 g/l et
d’agar à 15 g/l. Le milieu est autoclavé à 121°C pendant 15 minutes puis complémenté
comme précédemment avec de la L-cystéine et du pyrophosphate de fer.
Lors des cultures sous agitation (150 rpm), Legionella a été cultivée en erlenmeyer de
250 ml contenant 50 ml de BYE.
I.2.2
Culture de S. warneri RK
Staphylococcus warneri RK a été cultivé en milieu liquide BHI (Brain Heart Infusion)
(Difco) à 37°C. Lors de la préparation des milieux solides, de l’agar est ajouté avant
autoclavage à une concentration de 15 g/l.
Caractérisation et mode d’action de la warnéricine RK, un peptide anti-Legionella
94
Lors des cultures sous agitation (250 rpm), S. warneri RK a été cultivée en erlenmeyer
de 1 litre contenant 200 ml de BHI.
I.2.3
Culture des autres souches bactériennes
Les autres souches utilisées dans cette étude ont été cultivées en milieu liquide BHI ou
sur milieu BHI gélosé à 37°C.
I.2.4
Culture d’amibes
Les amibes Acanthamoeba sp. ont été cultivées en flasque de 25 cm3 contenant 5 ml
de milieu 1034.
Le milieu 1034 est composé, pour 1 litre, de 10 g de Bacto peptone, de 10 g d’extrait
de levure, d’1 g d’ARN, de 15 mg d’acide folique, d’1 mg d’hémine et de 20 ml de tampon
(10 g de Na2HPO4 et de 7,24 g de KH2HPO4 pour 400 ml). Le pH est ajusté à 6,5 et le milieu
est autoclavé à 121°C pendant 15 minutes puis complémenté en sérum de veau fœtal stérile
(concentration 10%). Les flasques sont incubées à 25°C pendant 3 à 4 jours, jusqu'à obtention
d’un tapis amibien. Le milieu est renouvelé lorsque ce tapis arrive à confluence.
I.2.5
Culture de cellules THP-1
Les cellules THP-1 ont été cultivées en milieu RPMI 1640, supplémenté en GlutamaxI (dimère d’alanine-glutamine), sérum de veau fœtal à 10%, pénicilline (100 U/ml) et en
steptomycine (100 µg/ml), pendant 3 à 4 jours à 37°C sous 5% de CO2. Pour les
expérimentations, 106 cellules/ml de THP-1 ont été différenciées en macrophages par culture
dans 1 ml de milieu en présence de PMA à 1 ng/ml (Phorbol 12-Myristate 13-Acetate)
pendant 24 heures à 37°C sous 5% de CO2.
I.3
Evaluation de l’activité antimicrobienne et hémolytique
I.3.1
Détermination de la concentration minimale inhibitrice
L’étude de l’activité inhibitrice d’une molécule en milieu liquide permet de déterminer
sa concentration minimale inhibitrice (CMI). Une suspension de la souche bactérienne étudiée
est préparée dans son milieu de culture liquide et ajustée à 106 UFC/ml soit DO600= 0,001.
Ensuite, le composé à étudier est dilué, en série au demi (ou dixième pour les détergents) et 5
µl de dilution sont ajoués à 95 µl de suspension bactérienne. La croissance bactérienne est
suivie par la mesure de l’absorbance à 595 nm avec un lecteur de microplaque (TECAN,
Sunrise). La CMI de la molécule est définie comme la plus faible concentration du composé
Caractérisation et mode d’action de la warnéricine RK, un peptide anti-Legionella
95
étudié pour laquelle le microorganisme testé ne montre aucune croissance (DO595) après un
temps défini.
I.3.2
Détermination de la perméabilisation membranaire
Une suspension de la souche bactérienne étudiée est préparée dans son milieu de
culture liquide et ajustée à 106 UFC/ml soit DO600= 0,001. Ensuite, le composé à étudier est
dilué en série au demi (ou au dixième pour les détergents) et 25 µl de dilution sont ajoutés à
975 µl de suspension bactérienne. Les échantillons sont incubés 45 minutes à 37°C puis
marqués à l’aide d’un ou plusieurs fluorochromes du kit BacLight™. Le SYTO9,
fluorescence verte (500 nm), est un intercalant de l’ADN qui pénètre dans toutes les cellules,
alors que l’iodure de propidium (IP), fluorescence rouge (635 nm), qui est également un agent
intercalant, ne pénètre que dans les cellules dont la membrane est endommagée. Ainsi, les
cellules IP+ sont considérées comme mortes tandis que les cellules IP- sont considérées
comme vivantes. Chacun des fluorochromes (SYTO9 et/ou IP) est ajouté à hauteur de 1,5 µl
pour 1 ml de solution. Les suspensions sont incubées dans l’obscurité à température ambiante
pendant 15 min puis puis elles sont analysées par cytométrie en flux à l’aide d’un cytomètre
FACSCanto™ II (BD Biosciences). Un total de 50000 événements est mesuré pour chaque
échantillon et l’acquisition se fait en utilisant le logiciel BD FACSDiVa 6.
I.3.3
Détermination du pouvoir hémolytique
L’activité hémolytique de la warnéricine RK et de la δ-hémolysine I a été déterminée
par mesure de l’absorbance de l’hémoglobine relarguée par les érythrocytes après action des
peptides. Du sang humain (500 µl), prélevé à un donneur sain, est centrifugé (2000 g, 3
minutes, 4°C) pour récolter les érythrocytes. Le surnageant est éliminé et les érythrocytes sont
resuspendus délicatement dans 800 µl de tampon PBS (Phosphate Buffered Saline) et agités
délicatement. La suspension est centrifugée de nouveau (2000 g, 3 minutes, 4°C) et le
surnageant est éliminé. L’étape précédente est répétée entre 3 et 5 fois, jusqu’à ce que le
surnageant soit clair. Les 200 µl de culot érythrocytaire sont alors resuspendus dans 2 ml de
tampon PBS pour constituer la solution mère à 10% (v/v). Les réactions sont préparées en
mélangeant, dans l’ordre, 930 µl de PBS, 50 µl de solution peptidique ou de Triton X-100 et
20 µl de solution d’érythrocytes à 10%. Les échantillons sont incubés à 37°C pendant 30
minutes puis centrifugés (2000 g, 3 minutes, 4°C) afin de collecter le surnageant.
L’absorbance du surnageant est mesurée à 576 nm par un spectrophotomètre Thermo
Caractérisation et mode d’action de la warnéricine RK, un peptide anti-Legionella
96
Spectronic Biomate 3 (Avantec). Le taux d’hémolyse induit par le témoin positif (0,1% de
Triton X-100) est considéré comme 100%.
Pour les experiences de protection osmotique, la solution mère d’érythrocytes
correspond à 4 x 1 ml de sang lavé et complété à 30 ml avec du PBS. Les réactions sont
réalisées en mettant, dans l’ordre, 500 µl de solution de polyéthylène glycol (PEG), 250 µl
d’érythrocytes et 250 µl de solution peptidique. Des solutions de PEG à différentes masses
moléculaires ont été utilisées : PEG 200 (diamètre de 0,75 nm), PEG 400 (diamètre de 1,07
nm), PEG 600 (diamètre de 1,32 nm), PEG 1000 (diamètre de 1,72 nm), PEG 2000 (diameter
de 2,47 nm), PEG 4000 (diameter de 3,54 nm), PEG 6000 (diameter de 4,37 nm), PEG 8000
(diamètre de 5,04 nm) et PEG 10000 (diamètre de 5,70 nm) à une concentration finale de 30
mM. Les échantillons sont incubés à 37°C pendant 30 minutes puis centrifugés (2000 g, 3
minutes, 4°C) afin de collecter le surnageant. L’absorbance du surnageant est mesurée à 543
nm. Le taux d’hémolyse induit par le témoin positif (0,1% de Triton X-100) est considéré
comme 100%.
Caractérisation et mode d’action de la warnéricine RK, un peptide anti-Legionella
97
Caractérisation et mode d’action de la warnéricine RK, un peptide anti-Legionella
98
Chapitre II.
II.1
Techniques séparatives et analytiques
Étude des protéines
La séparation et l’analyse des peptides produits par S. warneri RK ont été effectuées
par Chromatographie Liquide Haute Performance (HPLC) Perkin-Elmer, constituée d’une
pompe (Perkin-Elmer series 200 LC) et d’un détecteur UV Visible (Perkin-Elmer 785A)
permettant l’enregistrement de l’absorption à 220 nm des composés séparés par la colonne.
II.1.1
Préparation d’extrait brut du surnageant de S. warneri RK
Du milieu BHI est inoculé au 1/200ieme avec une préculture de 24 heures de S. warneri
RK et incubé à 37°C sous agitation (250 rpm) pendant 18 heures. La culture est centrifugée
(6000 g, 20 minutes, 4°C) et le surnageant de culture est chauffé à 70°C pendant 15 minutes,
afin d’inactiver les protéases et de tuer d’éventuelles cellules restantes. La solution obtenue
constitue l’extrait brut (EB).
II.1.2
Chromatographie d’affinité pour l’hydroxyapatite
Un litre d’EB est mélangé avec 20 g d’hydroxyapatite de Type I pendant 3 heures à
4°C puis incubé sur la nuit à 4°C. La solution est filtrée sur fritté avec une pompe à vide et le
résiduel est lavé avec 50 ml de tampon phosphate de potassium (0,01 M, pH 6,8). Après
filtration, le résiduel est lavé 3 fois 5 minutes avec 20 ml de tampon phosphate de potassium
(0,4 M, pH 6,8). Le surnageant est éliminé à chaque lavage. Les peptides adsorbés sont
décrochés par élution avec 100 ml de tampon phosphate de potassium (1 M, pH 7,4). Le
surnageant est centrifugé (5000 g, 3 minutes, 4°C) pour éliminer les traces d’hydroxyapatite.
Le surnageant est chargé sur une cartouche C18 d’extraction en phase solide (Sep-Pak
plus, Waters). La cartouche est lavée, au préalable, avec 5 ml d’éthanol à 70%, puis équilibrée
avec 5 ml d’acétonitrile (ACN) et 10 ml d’eau Milli-Q. L’élution est réalisée avec 10 ml de
solution d’ACN/ 0,05% d’acide trifluoroacétique (TFA) contenant respectivement 0, 20, 40 et
80% d’ACN. L’éluat contenant les peptides d’intérêt (80% d’ACN) est soumis à évaporation
(65°C) pour éliminer l’ACN puis lyophilisé sur la nuit.
Caractérisation et mode d’action de la warnéricine RK, un peptide anti-Legionella
99
II.1.3
Chromatographie en phase liquide
Chromatographie d’interaction hydrophobe
II.1.3.1
L’EB est chargé à un débit de 5 ml/min sur une colonne Poros Phenyl 20 (100 x 4,6
mm, 20 μM, Poros). La colonne est rinçée par une solution d’ACN/eau/TFA 10:90:0,1 (v/v)
pendant 5 minutes à un débit de 2 ml/minute. L’élution est conduite, toujours à 2 ml/minute,
selon un gradient linaire de 0 à 100% en 20 minutes d’une solution d’ACN/TFA 100:0,07
(v/v). Le gradient d’élution est suivi par une phase de plateau de 10 minutes à 100% de
solvant. La fraction d’intérêt (éluée entre 6 et 12 minutes) est soumise à évaporation (à 65°C)
pour éliminer l’ACN puis lyophilisée sur la nuit.
II.1.3.2
Chromatographie liquide haute performance en phase inverse
La fraction d’intérêt est resuspendue dans 1 ml d’ACN/eau 1:1 (v/v) puis analysée en
HPLC avec une colonne analytique C8 Kromasil (5 µm, 100 Ǻ, 4,6 x 250 mm, A.I.T.). Le
débit est de 0,8 ml/minute. L’élution se fait avec un gradient eau-TFA (0,05%)/ACN-TFA
(0,05%). Le gradient commence à 50% d’ACN pendant 5 minutes puis augmente jusqu’à
100% d’ACN de façon linéaire en 30 minutes. Il atteint un plateau à 100% d’ACN où il reste
pendant 10 minutes. La détection des peptides s’effectue à 220 nm.
II.1.4
Spectrométrie de masse ESI-MS
L’identification des peptides a été réalisée par spectrométrie de masse en électrospray
(ESI-MS). Les spectres de masse sont réalisés en analyse d’ions positifs (Perkin-Elmer Sciex
API 165) et leur traitement est effectué à l’aide du logiciel Biomultiview 1.2 (Perkin Elmer
Sciex Instruments).
II.1.5
Dosage des peptides
Le dosage des peptides a été réalisé par dosage à l’acide bicinchoninique (BCA)
(Sigma-aldrich) avec de l’albumine de sérum bovin à 1 mg/ml comme standard. Le principe
de ce dosage repose sur le pouvoir des protéines à réduire le Cu2+ en Cu+. Le BCA est un
réactif chromogène hautement spécifique de Cu+.
Les peptides purifiés par HPLC sont lyophilisés et repris dans de l’eau. Un total de 25
µl de solution peptidique, diluée ou non, est mis en présence de 200 µl de solution de réactif
contenant de l’acide bicinchoninique et du sulfate de cuivre à un ratio 50:1 (v/v). Les
échantillons sont incubés à 37°C pendant 30 minutes puis l’absorbance est mesurée à 595 nm
par un lecteur de microplaque OPSYS MR (ThermoLabsystems).
Caractérisation et mode d’action de la warnéricine RK, un peptide anti-Legionella
100
II.2
Étude des lipides
II.2.1
Extraction des lipides totaux
L’extraction des lipides est réalisée selon la méthode de Folch (Folch et al., 1957)
c’est-à-dire par une extraction méthanol/chloroforme 2:1 (v/v). Une suspension contenant de
109 à 1010 bactéries est centrifugée (10000 g, 20°C, 10 minutes). Le culot bactérien est repris
dans 1 ml d’eau stérile et transféré dans un tube eppendorf de 2 ml contenant 500 mg de billes
de verre (150-200 µm). La suspension est vortexée pendant 1 minute afin de bien lyser les
cellules. Après décantation (quelques secondes), le surnageant est transféré dans un tube à
centrifugation. L’opération est répétée deux fois. Après ajout de 6 ml de méthanol et agitation
au vortex pendant 15 secondes, le mélange est incubé à 65°C pendant 20 minutes. Les
échantillons sont ensuite refroidis à température ambiante, puis 3 ml de chloroforme sont
ajoutés. Les tubes sont vortexés 15 secondes et placés à température ambiante sur un agitateur
rotatif pour que l’extraction se fasse sur la nuit. Le lendemain, le mélange est transféré dans
un nouveau tube de centrifugation. Les solutions sont centrifugées (10000 g, 20°C, 12
minutes) afin d’éliminer les débris cellulaires. Le surnageant est transféré dans un nouveau
tube de centrifugation. Ensuite, 2 ml de chloroforme puis 4 ml d’eau MilliQ sont ajoutés.
L’ensemble est vortexé 15 secondes et centrifugé (3000 g, 20°C, 8 minutes). La phase
inférieure est délicatement récupérée à l’aide d’une pipette pasteur et transférée dans un tube
en verre. Le chloroforme est alors éliminé par évaporation à 50°C sous flux d’azote.
Les échantillons lipidiques sont resuspendus dans 1 ml de dichlorométhane (DCM) et
vortexés 30 secondes. La suspension est passée sur une colonne de silice (cusil 156 Clean-up
Extraction Columns, 6 mL, Carlo Erba) lavée au préalable avec 5 ml de méthanol puis
conditionnée par 5 ml de DCM. L’élution se fait en trois étapes :
- les lipides neutres sont élués par 5 ml de DCM,
- les glycolipides sont élués par 2 x 5 ml d’acétone,
- et enfin les phospholipides sont élués par 5 ml de méthanol.
Les phospholipides sont récupérés et la solution est évaporée à 65°C sous flux d’azote pour
éliminer le méthanol.
Pour l’analyse en chromatographie gazeuse couplée à un spéctromètre de masse (GCMS), les lipides sont estérifiés. Une solution de méthanol alcalin à 0,2 M est préparée en
Caractérisation et mode d’action de la warnéricine RK, un peptide anti-Legionella
101
ajoutant 0,561 g de KOH dans 50 ml de méthanol. Les échantillons lipidiques sont alors
dissous dans 5 ml de cette solution. L’estérification est réalisée pendant 1 heure sous agitation
(200 rpm) à température ambiante. La réaction est stoppée par neutralisation du KOH en
ajoutant 0,33 ml d’acide acétique à 1 M. Ensuite, 4 ml d’hexane sont ajoutés et les
échantillons sont vortexés pendant 1 minute, jusqu’à obtention d’une émulsion. Après
quelques minutes de décantation (~ 5 minutes), la phase hexane (phase supérieure) est
récupérée, puis évaporée sous azote.
II.2.2
Analyse des acides gras par GC-MS
Les méthyl-esters d’acides gras sont resuspendus dans un mélange final de 200 µl
d’hexane et de MTBE (methyl-tert-butyl ether) 1:1 (v/v). Les échantillons sont analysés par
chromatographie gazeuse (GC) (Hewlett-Packard modèle 5972G1800A) couplée à un
spectromètre de masse (MS). La colonne est une colonne capillaire DB5 (30 m x 0.2 mm x
0.11 µm), gaz vecteur : He (1 ml/minute). La température de la colonne démarre à 50°C
pendant 2 minutes puis augmente de 8°C /minute jusqu’à atteindre 200°C. Une nouvelle
augmentation de température de 10°C/minute permet d’atteindre 300°C. Les méthyl-esters
d’acides gras sont identifiés par comparaison de leur spectre et de leur temps de rétention avec
ceux de standards (Larodan Fine Chemicals).
II.2.3
Analyse des phospholipides par chromatographie sur couche
mince
L’analyse des phospholipides par chromatographie sur couche mince (CCM) a été
réalisée sur des plaques de silice 60 F254 (Merck). Les plaques sont lavées avec une solution
de chloroforme/méthanol 1:1 (v/v) et séchées sous hotte avant utilisation. Elles sont ensuite
plongées dans une solution d’acide borique à 2,3% en éthanol absolu et agitées doucement
pendant 5 minutes. Après séchage sous hotte, les plaques sont activées par incubation à 100°C
pendant 15 minutes. Les échantillons de phospholipides sont repris en solution de
chloroforme/méthanol 1:1 (v/v) et déposés sur plaque. La migration se fait à l’aide d’une
solution de chloroforme/éthanol/eau/triéthylamine 30:35:7:35 (v/v) pendant environ 2 heures.
Les plaques sont ensuite séchées sous hotte puis les phospholipides sont révélés par
vaporisation d’une solution de bleu de molybdène à 1,3% ou de primuline à 50 µg/ml.
Les spots sont grattés et les phospholipides sont élués de la silice par 2 élutions successives
avec une solution de chloroforme/méthanol/eau 5:5:1 (v/v).
Caractérisation et mode d’action de la warnéricine RK, un peptide anti-Legionella
102
II.2.4
Dosage des phospholipides
Le dosage colorimétrique des phospholipides est basé sur la formation d’un complexe
entre les différents phospholipides et le ferrothiocyanate d’ammonium. Dans un premier
temps, le réactif est préparé en disolvant 2,7 g de FeCl3 avec 3 g de NH4SCN (thiocyanate
d’ammonium) dans 100 ml d’eau Milli-Q. La gamme étalon est réalisée avec 4 standards (Lα-Phosphatidylcholine, L-α-Phosphatidyléthanolamine, L-α-Phosphatidyl-DL-glycérol et
cardiolipide) (Sigma-aldrich). Tous les échantillons sont évaporés sous flux d’azote puis
repris dans 2 ml de chloroforme. Ensuite, 1 ml de ferrothiocyanate d’ammonium est ajouté à
chaque tube puis toutes les solutions sont vortexées 1 minute avant d’être centrifugées (1000
g, 1 minute, 20°C). La phase inférieure contenant les phospholipides est récupérée et
l’absorbance est mesurée à 488 nm (Figure 24).
1
y = 0,0148x
R² = 0,9889
0,9
0,8
0,7
y = 0,0099x
R² = 0,9976
DO488
0,6
PE
0,5
PC
0,4
y = 0,0061x
R² = 0,9793
0,3
CL
PG
0,2
y = 0,0026x
R² = 0,9291
0,1
0
0
10
20
30
40
50
60
70
Quantité de phospholipide (µg)
Figure 24 : Courbes étalons des standards de phospholipides. PE ( ) PC ( ) CL ( ) PG
( ). PE : phosphatidyléthanolamine, PC : phosphatidylcholine, CL : cardiolipide, PG :
phosphatidylglycérol.
Cependant, selon leur nature, les phospholipides répondent plus ou moins bien au
dosage. En effet, la PE et la PC possèdent une forte relation de proportionnalité entre
absorbance à 488 nm et quantité de phospholipides. Par contre, le PG et surtout le CL
répondent moins bien au dosage. Ainsi, les quantités de phospholipides déterminées après
sépartion en CCM ne seront qu’une estimation de la quantité réelle de phospholipides.
Caractérisation et mode d’action de la warnéricine RK, un peptide anti-Legionella
103
Caractérisation et mode d’action de la warnéricine RK, un peptide anti-Legionella
104
Chapitre III.
III.1
Techniques de biologie moléculaire
Extraction plasmidique
Le plasmide pLAW330 (Figure 25), contenant le transposon Tn903dIIlacZ, a été
purifié à partir d’E. coli XL1 Blue en utilisant le kit Plasmid Midi de QIAGEN®.
Figure 25 : Carte du plasmide pLAW330 et du transposon Tn903dIIlacZ (Wiater et al.,
1994)
Le transposon Tn903dIIlacZ est un minitransposon (ne contient pas de transposase)
contenant un gène de résistance à la kanamycine (antibiotique de la famille des
aminoglycosides qui inhibe la traduction en se liant aux ribosomes) ainsi qu’une partie du
gène lacZ entre 2 séquences répétées inversées (IR Tn903). Cette partie va s’intégrer dans le
génome, au hasard, grâce à une transposase dont le gène tnpA est porté par le plasmide
pLAW330. Ce plasmide est un plasmide de type ColE1 qui portent deux gènes de résistance à
des antibiotiques : le chloramphénicol et l’ampicilline.
III.2
Bactéries compétentes
Une culture de L. pneumophila Lens est préparée en étalant 100 µL d’une suspension
bactérienne à DO600 = 2 sur une gélose BCYE. Après 24 heures d’incubation à 37°C, un tapis
bactérien est visible (les cellules se trouvent en phase exponentielle de croissance). Les
Caractérisation et mode d’action de la warnéricine RK, un peptide anti-Legionella
105
bactéries sont récupérées et mises en suspension dans 40 mL de glycérol 10 % froid (4°C). La
préparation est centrifugée (6000 g, 15 minutes, 4°C) et le culot est remis en suspension
délicatement dans 20 mL de glycérol 10% froid (4°C). La solution est de nouveau centrifugée
(6000 g, 15 minutes, 4°C) puis, le culot est repris délicatement dans 10 mL de glycérol 10%
froid (4°C). Ces étapes de lavage permettent d’éliminer les molécules et les sels afin d’éviter
toute interférence possible avec le choc électrique de l’électroporation.
Le culot bactérien est ensuite remis en suspension dans un volume adéquat de glycérol
10% froid (4°C) afin d’avoir une DO600 = 100. La suspension est aliquotée en fractions de 50
µl et les aliquots sont stockés à -80 °C.
III.3
Électroporation
Une fraction de 50 µl de L. pneumophila Lens compétentes est mélangée avec 2 µl
d’ADN plasmidique (pLAW330) à 0,5 µg/µl dans une cuve d’électroporation froide. La
préparation est incubée 2 minutes dans la glace pour une meilleure homogénéisation puis est
ensuite électroporée (MicroPulser™, BioRad) grâce à un choc électrique de 2,5 kV.
Immédiatement après, 950 µl de milieu BYE complémenté sont ajoutés dans la cuve. Les
bactéries sont étalées sur gélose BCYE contenant de la kanamycine à 10 µg/ml.
III.4
Extraction d’ARN
Toutes les solutions sont préparées avec de l’eau traitée au diéthylpyrocarbonate qui
est un inhibiteur des ARNases.
L’extraction a été réalisée par la méthode au Trizol (Invitrogen). Un culot bactérien
(4.109 cellules) est remis en suspension dans 1 ml de Trizol. Après quelques secondes
d’agitation et 10 minutes d’incubation à température ambiante, 100 µl de chloroforme sont
ajoutés. La préparation est incubée 3 minutes à température ambiante avant d’être centrifugée
(12000 g, 15 minutes, 4°C). La phase aqueuse est récupérée et 200 µl de chloroforme sont de
nouveau ajoutés. La solution est incubée 5 minutes à température ambiante puis centrifugée
(12000 g, 5 minutes, 4°C). Le surnageant est transféré dans un nouveau tube et 600 µl
d’isopropanol froid sont ajoutés. La préparation est incubée 15 minutes sur glace. Le tube est
centrifugé (12000 g, 15 minutes, 4°C). Le surnageant est éliminé et le culot est lavé avec 1 ml
d’éthanol 75% et centrifugé (12000 g, 5 minutes, 4°C). Le culot est séché 3 à 5 minutes sur
une plaque chauffante à 37°C, et repris dans 50 µl d’eau. Les échantillons sont chauffés 10
minutes à 55°C pour bien resuspendre l’ARN. La quantité d’ARN est déterminée en mesurant
la DO260 et la DO280.
Caractérisation et mode d’action de la warnéricine RK, un peptide anti-Legionella
106
L’intégrité des ARN est vérifiée par électrophorèse sur gel d’agarose à 1%, en
présence de 0,5 µl de bromure d’éthidium. Le gel est réalisé dans du tampon Tris-BorateEDTA (Acide Éthylène Diamine Tétra Acétique) (TBE) 1 X. Une solution stock de tampon
TBE 10 X est préparée, pour 400 ml, par ajout de 43,2 g de Tris, 22,2 g d’acide borique, 3,72
g d’EDTA ( puis est autoclavée à 121°C pendant 15 minutes. Les solutions d’ARN sont
dénaturées par chauffage (5 minutes à 65°C) et mélangées à un tampon de charge (glycérol
30%, Bleu de Bromophénol 0,05%, 50 mM d’EDTA), selon le ratio 4:1 (v/v). Enfin, les
échantillons (5 µl) sont déposés sur gel et la migration s’effectue pendant 30 minutes à 100 V.
Les bandes d’ARN sont visualisées sous UV.
III.5
Microarrays
La technique de microarrays a été réalisée par Tobias Sahr de l’Institut Pasteur de Paris. Les
détails, explicités dans la publication 4, ne seront pas repris dans ce chapitre.
Caractérisation et mode d’action de la warnéricine RK, un peptide anti-Legionella
107
Caractérisation et mode d’action de la warnéricine RK, un peptide anti-Legionella
108
Chapitre IV.
IV.1
Techniques de biophysique
Technique des black lipids
Cette technqiue permet de mesurer une différence de potentielle de part et d’autre
d’une membrane lipidique séparant deux compartiments de solution aqueuse (Figure 26).
Figure 26 : Principe de la technique des black lipids
Une cuve en teflon contenant deux compartiments connectés par un trou d’environ 0,3
mm2 est remplie par 5 ml d’une solution d’électrolyte. La membrane de black lipids est
conçue en peignant littéralement une solution de 1% (p/v) de
DPPC (diphytanoyl
phosphatidylcholine)/n-decane à travers le trou. Une paire d’électrodes Ag/AgCl est reliée en
série à une source de voltage et à un enregistreur. La warnéricine RK est ajoutée à partir d’une
solution stock à 1 mg/ml de part et d’autre de la membrane. Ainsi, la différence de potentiel
Caractérisation et mode d’action de la warnéricine RK, un peptide anti-Legionella
109
induite par l’insertion de la warnéricine RK dans la membrane de DPPC est mesurée et
enregistrée. La température des expériences est maintenue à 20°C.
IV.2
Dichroïsme circulaire et RMN
Les expériences de dichroïsme circulaire et de RMN ont été réalisées par Mirjam Falge et
Cornélius Faber de l’Université de Würzburg. Les détails, explicités dans la publication 3, ne
seront pas repris dans ce chapitre.
Caractérisation et mode d’action de la warnéricine RK, un peptide anti-Legionella
110
Partie 3. Résultats
Caractérisation et mode d’action de la warnéricine RK, un peptide anti-Legionella
111
Caractérisation et mode d’action de la warnéricine RK, un peptide anti-Legionella
112
Chapitre I.
Purification et activités biologiques de la warnéricine
RK
En 2005, une étude a montré la capacité d’une souche de Staphylococcus warneri,
nommée S. warneri RK, à inhiber la croissance des bactéries du genre Legionella (Héchard et
al., 2005). L’une des molécules responsable de cette activité est un peptide de 22 acides
aminés qui possède une masse de 2561 Da et dont la séquence primaire ne partage aucune
similitude avec celles de peptides déjà décrits dans la littérature. Ce peptide, nommé
warnéricine RK, est le premier peptide anti-Legionella identifié à ce jour et a fait l’objet d’un
dépôt de brevet sous la référence WO/2007/077316 (Héchard & Berjeaud, 2006). Dans ce
brevet, deux autres peptides produits par S. warneri RK sont mentionnés pour leur activité
anti-Legionella. Il s’agit de deux homologues de la δ-hémolysine, nommées δ-hémolysine I et
II, qui est une toxine produite par Staphylococcus avec une faible activité antimicrobienne.
La première partie de mon travail de thèse a consisté à étudier les activités biologiques
de la warnéricine RK et à les comparer à celles de la δ-hémolysine. Les résultats sont, en
partie, présentés dans la publication 2.
I.1
Publication 2 : Characterization of anti-Legionella activity of
warnericin RK and delta-lysin I from Staphylococcus
warneri
Une souche de Staphylococcus warneri a été isolée en 2005 sur un critère d’inhibition
de la croissance de Legionella. La purification à partir du surnageant de culture de S. warneri
RK, en utilisant une matrice d’hydroxyapatite (forme naturelle de phosphate de calcium, de
formule Ca5(PO4)3(OH)), a permis d’isoler sept peptides actifs contre Legionella. Parmi ces
molécules, six ont été séquencées et correspondent aux formes natives ou formylées de la
warnéricine RK et des δ-hémolysines I et II. La septième molécule, de masse moléculaire
2940 Da, n’a pas encore été identifiée. La δ-hémolysine est un peptide hémolytique, produit
par Staphylococcus, qui possède une faible activité antimicrobienne. L’espèce S. warneri est
le seul staphylocoque connu dont l’ARNIII prédit la présence de deux homologues différents,
de la δ-hémolysine, nommés δ-hémolysine I et II. C’est la première fois que ces deux peptides
sont purifiés. Leurs séquences primaires ne diffèrent l’une de l’autre que par 6 acides aminés
Caractérisation et mode d’action de la warnéricine RK, un peptide anti-Legionella
113
et elles ne possèdent aucune homologie de séquence avec la warnéricine RK. Dans la suite de
l’étude, seule la δ-hémolysine I a été utilisée.
Le spectre d’activité de la warnéricine RK et de la δ-hémolysine I indique que les deux
peptides sont actifs contre les mêmes microorganismes et aux mêmes concentrations. Ils
possèdent la même CMI contre Legionella sp. (3,12 µg/ml) et Bacillus megaterium (12,5
µg/ml). Les deux peptides sont hémolytiques et possèdent une activité bactéricide contre L.
pneumophila, qui est, par ailleurs, plus prononcée sur les cellules en phase exponentielle de
croissance que sur les cellules en phase stationnaire de croissance. D’autre part, d’après
l’analyse de la séquence primaire de la warnéricine RK, le peptide possède des propriétés
amphiphiles similaires à celles de la δ-hémolysine I et adopterait une structure secondaire en
hélice α, semblable à celle de la δ-hémolysine de S. aureus.
Devant les nombreuses similitudes partagées par la warnéricine RK et la δ-hémolysine
I, nous avons émis l’hypothèse que les deux peptides pourraient posséder un mode d’action
analogue, expliquant ainsi la spécificité de leur spectre d’activité.
Caractérisation et mode d’action de la warnéricine RK, un peptide anti-Legionella
114
PUBLICATION 2
Characterization of anti-Legionella activity of warnericin
RK and delta-lysin I from Staphylococcus warneri
PEPTIDES
2008
Caractérisation et mode d’action de la warnéricine RK, un peptide anti-Legionella
115
Caractérisation et mode d’action de la warnéricine RK, un peptide anti-Legionella
116
peptides 29 (2008) 978–984
available at www.sciencedirect.com
journal homepage: www.elsevier.com/locate/peptides
Characterization of anti-Legionella activity of warnericin RK
and delta-lysin I from Staphylococcus warneri
Julien Verdon, Jean-Marc Berjeaud, Christian Lacombe, Yann Héchard *
Université de Poitiers, Laboratoire de Chimie et Microbiologie de l’Eau, CNRS UMR 6008, 40 avenue du recteur Pineau,
86022 Poitiers, France
article info
abstract
Article history:
Legionella pneumophila, the causative agent of Legionnaires’ disease, is a waterborne bacteria.
Received 28 November 2007
It can multiply in man-made water systems and infect people who inhale contaminated
Received in revised form
droplets. We have previously reported a Staphylococcus warneri strain that display an anti-
24 January 2008
Legionella activity. In this work, we characterized three anti-Legionella peptides that are
Accepted 26 January 2008
produced by S. warneri. One peptide, warnericin RK, is original, while the two others are
Published on line 6 February 2008
delta-lysin I and delta-lysin II, whose genes were previously described. Due to high sequence
similarity of the two delta-lysins, further characterization was performed only on delta-
Keywords:
lysin I. Warnericin RK and delta-lysin I displayed the same antibacterial spectrum, which is
Warnericin RK
almost restricted to the Legionella genus. Also, both peptides have a hemolytic activity. These
Delta-lysin
results led to the hypothesis that warnericin RK and delta-lysin I share a similar mode of
Legionella pneumophila
action, and that Legionella should have a specific feature that may explain the high specificity
Staphyloccocus warneri
of these antibacterial peptides.
# 2008 Elsevier Inc. All rights reserved.
Antimicrobial peptide
1.
Introduction
Legionella pneumophila is a waterborne pathogenic bacterium
responsible for severe pneumonia called Legionnaires’ disease
[7,20]. In 2006, there were more than 6000 reported cases in
Europe leading to 400 deaths. L. pneumophila can be found at
high levels in man-made water systems such as air conditioning and cooling towers, spas, etc. These systems are
mainly responsible for outbreaks as they might produce
infected water droplets, which are inhaled. L. pneumophila
reaches the lungs and multiplies within macrophages [15]. In
the environment, L. pneumophila is ubiquitously found in fresh
water and could survive within biofilms and free-living
amoebae [3]. Several protozoa, such as free-living amoebae,
feed on biofilm leading to L. pneumophila phagocytosis.
However, L. pneumophila has the ability to resist phagocytosis
and multiply within amoebae [15]. The resistance mechanism
has been thoroughly described. L. pneumophila subvert the
phagocytosis pathway and establish a replicative vacuole
where they can multiply as a replicative form. Then, L.
pneumophila senses nutrient limitation in the vacuole and
switches to a transmission form that escapes from the
amoebae [16]. A similar mechanism is used by L. pneumophila
to resist phagocytosis by macrophages, leading to lung
infection. Not only are amoebae responsible for L. pneumophila
spreading in water, but they could also protect intracellular
bacteria from adverse conditions or biocide treatments
[1,2,16].
Various treatments are used (e.g. chlorine, monochloramine, heat) in water systems to control Legionella growth.
However, these treatments are not fully efficient, and after a
lag period following the treatment L. pneumophila may be able
to recolonize the system [23]. It has been shown that bacteria
found within biofilm are protected from treatment. Also, the
* Corresponding author. Tel.: +33 5 49 45 40 07; fax: +33 5 49 45 35 03.
E-mail address: [email protected] (Y. Héchard).
0196-9781/$ – see front matter # 2008 Elsevier Inc. All rights reserved.
doi:10.1016/j.peptides.2008.01.017
peptides 29 (2008) 978–984
transmission form is more resistant than replicative form to
various biocides, including antibiotics [8,9]. Therefore, it is of
primary importance to find new antibacterial agents to
restrain L. pneumophila growth.
We recently reported that a bacterial strain, Staphylococcus
warneri RK, produced an anti-Legionella peptide. This peptide is,
to our knowledge, the first anti-Legionella peptide described in
the literature [10]. The purification process has suggested that
the peptide is cationic and highly hydrophobic. However, the
peptide was not fully characterized.
In this study, we improved the purification process and
actually characterized three different anti-Legionella peptides,
which hemolytic activity was also tested.
2.
Materials and methods
2.1.
Bacterial strains, culture media and growth conditions
The antimicrobial peptide producing strain, S. warneri RK, was
previously isolated from the environment [10]. It was grown in
brain heart infusion (BHI, Difco) broth at 37 8C with shaking
(250 rpm).
L. pneumophila strains were grown on buffered charcoal
yeast extract (BCYE) plate or on BCYE supplemented with 0.1%
a-ketoglutarate (BCYEa) at 37 8C, 5% CO2. Liquid cultures were
performed in BYE medium at 37 8C, 5% CO2.
Target bacterial strains used in this study were listed in
Table 1. They were grown in BHI broth at 30 or 37 8C depending
on the strain.
2.2.
Purification of anti-Legionella peptides
In order to characterize the anti-Legionella peptide, a three-step
purification procedure was conducted as described below. One
liter of BHI broth (pH 7.5) was inoculated with 1 ml of an
overnight culture of S. warneri RK and incubated at 37 8C for 18–
20 h under shaking (250 rpm). Cells were removed by
centrifugation (6000 g, 15 min, 4 8C) and the supernatant
was heated at 70 8C for 15 min. The resulting sample was
named raw extract (RE). Firstly, the RE (1 l) was mixed for 3 h
with 20 g l 1 Type I hydroxyapatite (Sigma–Aldrich) and
incubated overnight at 4 8C. The supernatant was removed
and the pellet of hydroxyapatite was washed once with 0.01 M
potassium phosphate buffer (pH 6.8) and then three times with
0.4 M potassium phosphate buffer (pH 6.8) for 5 min. The
adsorbed peptides were released by washing the hydroxyapatite pellet five times with 100 ml of 1 M potassium
phosphate buffer (pH 7.4). The eluted fraction was centrifugated (5000 g, 3 min, 4 8C) to remove traces of hydroxyapatite. Secondly, the resulting 1 M potassium phosphate fraction
was applied onto a solid phase extraction C18 cartridge (SepPak plus, Waters), washed successively with 10 ml of 0, 20, 40
and 80% acetonitrile–0.05% trifluoroacetic acid. The 80%
fraction was concentrated under vacuum to remove acetonitrile then lyophilized overnight. Thirdly, the lyophilized
fraction was solubilized in 900 ml of acid water (pH 5) and
injected on a Kromasil C8 reverse-phase HPLC analytical
column (5 mm, 100 Å, 4.6 mm 250 mm, AIT). HPLC was
conducted on a PerkinElmer series 200 LC pump, fitted with
979
a PerkinElmer 785A detector. Elution was monitored for
absorbance at 220 nm. Separation was carried out using a
water/acetonitrile/trifluoroacetic acid 0.05% (v/v) solvent
system. After an initial 5 min wash with 50% acetonitrile,
elution was achieved in 40 min at a flow rate of 0.8 ml min 1
with a 30 min linear gradient from 50 to 100% acetonitrile,
followed by a 10 min wash with 100% acetonitrile. Each
collected fraction was lyophilized and stored at 20 8C for
further studies.
2.3.
Mass spectrometry and N-terminal amino acid
sequencing
For molecular weight determination, the HPLC fractions were
directly analyzed by mass spectrometry, on a PerkinElmer
Sciex API 165 mass spectrometer equipped with an ion-spray
source. The sample analysis was carried out by infusion at a
flow rate of 5 ml min 1. The instrument scale for the mass-tocharge (m/z) ratio was calibrated with the ions of the
ammonium adduct of polypropylene glycol. Scan data were
obtained with LC2-Tune and mass calculation was done with
Biomultiview 1.2 (Software package Sciex).
Amino acid sequencing of the reduced antimicrobial
peptides was performed by Le Centre Commun de Séquençage
(IPBC, Lyon) by automated Edman degradation with Procise
492A Protein Sequencer (Applied Biosystems).
2.4.
Peptide titration
Peptide concentration was determined by the bicinchoninic
acid procedure as described by the supplier (Sigma) with
bovine serum albumin as a standard. Briefly, 25 ml of each
sample were mixed with 200 ml of a solution containing
bicinchoninic acid and copper sulfate 50:1 (v/v). The preparation was incubated at 37 8C for 30 min and the A595 was
measured by a microtiter plate reader OPSYS MR (ThermoLabsystems).
2.5.
Microtiter plate antimicrobial assays
Microtiter plate assays have been used to measure the
minimal inhibitory concentration (MIC) of warnericin RK
and delta-lysin I. Serial two-fold dilutions of antimicrobial
peptides were achieved in sterile water and added (5 ml) to
bacterial suspension (95 ml, 106 CFU ml 1) at a starting concentration of 50 mg ml 1 and the minimal inhibitory concentration (MIC) was determined. The MIC represented the lowest
concentration of peptide required to inhibit the growth of
target bacteria during 30 h or 96 h, depending of the tested
bacteria.
The antimicrobial spectrum, against selected indicator
strains (Table 1), has been assessed by the same assay at
50 mg ml 1 of warnericin RK or delta-lysin I. The sensitivity
corresponded to a total growth inhibition.
The bactericidal effect of warnericin RK and delta-lysin I on
L. pneumophila cells, in exponential-phase and stationaryphase of growth, was determined as described below. L.
pneumophila cells were inoculated in BYE to approximately
106 CFU ml 1. Bacterial growth was determined by monitoring
the OD595 during the growth of microorganisms with a
980
peptides 29 (2008) 978–984
Table 1 – Antibacterial spectrum of warnericin RK and
delta-lysin I
Indicator strains
Gram-positive bacteria
Bacillus megaterium F04
Bacillus subtilis
Enterococcus faecalis V583
Listeria monocytogenes EGDe
Micrococcus luteus
Pediococcus acidilactici 583
Staphylococcus aureus 971
Staphylococcus chromogenes
Staphylococcus cohnii 898
Staphylococcus
epidermidis 567
Staphylococcus
haemolyticus 694
Staphylococcus hominis 373
Staphylococcus lentus 982
Staphylococcus
lugdunensis 967
Staphylococcus
saprophyticus 715
Staphylococcus warneri 447
Staphylococcus warneri RK
Gram-negative bacteria
Enterobacter cloacae D03
Escherichia coli MG1655
Hafnia alvei
Klebsiella pneumoniae 0502083
Legionella bozemanii
ATCC 33217
Legionella dumofii ATCC 33279
Legionella feeleii ATCC 35072
Legionella like bacteria
(LLAP10)
Legionella longbeachae
ATCC 33484
Legionella micdadei
ATCC 33218
Legionella oakridgensis
ATCC 33761
Legionella pneumophila
Corby (sg1)
Legionella pneumophila
Lens (sg1)
Legionella pneumophila
Paris (sg1)
Legionella pneumophila ATCC
33155 (sg3)
Legionella pneumophila ATCC
33216 (sg5)
Legionella pneumophila ATCC
33215 (sg6)
Proteus mirabilis ATCC 35659
Pseudomonas aeruginosa
DSMZ1128
Pseudomonas aeruginosa
910704
Salmonella typhimurium
Sensitivity
to deltalysin I
Sensitivity to
warnericin
RK
+
–
–
–
–
–
–
–
–
–
+
–
–
–
–
–
–
–
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+
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–
+
+
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+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
–
–
–
–
–
–
–
–
Peptides were tested, with the microtiter plate assay, at a final
concentration of 50 mg ml 1. Sensitivity corresponds to a total
growth inhibition. The test was repeated twice independently.
microtiter plate reader TECAN (Sunrise). Bacterial suspensions
(95 ml) were put into a sterile microtiter plate (Nunclon Delta
SurfaceTM). Serial two-fold dilutions of antimicrobial peptides
were performed in sterile water and added (5 ml) to bacterial
suspension at a starting concentration of 12.5 mg ml 1.
Microtiter plates were incubated at 37 8C, 5% CO2 for 1 h.
The number of CFU was determined by plating the ten-fold
serial dilution of bacterial suspensions on BCYE agar plates.
Before colony counting, the plates were incubated at 37 8C, 5%
CO2 for 72 h.
2.6.
Hemolytic activity assay
Hemolytic activity of warnericin RK and delta-lysin I was
measured by detection of released hemoglobin from human
erythrocytes. Human blood from a healthy volunteer was
collected in a tube containing heparin sulfate. Prior to the
assay, the fresh human blood was centrifugated (2000 g,
3 min, 4 8C) to collect erythrocytes. Erythrocytes were washed
in phosphate buffered saline (PBS) until the supernatant was
clear (5 times). Reactions were performed in 1 ml mixtures
containing 1% erythrocytes (v/v) and variable amount of
peptides or an equivalent volume of PBS buffer. Serial two-fold
dilutions of peptides were performed in PBS buffer and added
to 1% human erythrocytes at a starting concentration of
50 mg ml 1. The reaction mixtures were incubated at 37 8C for
30 min. Erythrocytes were removed by centrifugation
(2000 g, 3 min, 4 8C) and the A576 of the supernatant was
determined with a spectrophotometer Thermo Spectronic
Biomate 3 (Avantec). The level of hemolysis caused by
resuspending erythrocytes in water was considered 100%.
3.
Results
3.1.
S. warneri RK produces several anti-Legionella
peptides
S. warneri RK culture supernatant was submitted to an
hydroxyapatite affinity chromatography, a solid phase extraction and a reverse-phase HPLC, to purify the anti-Legionella
peptides. Each fraction, eluted after the final HPLC (Fig. 1), was
collected, analyzed by mass spectrometry and tested for antiLegionella activity. Seven samples out of ten displayed an anti-
Fig. 1 – Final C8 reverse-phase HPLC elution profile. The
arrows indicate peaks with anti-Legionella activity.
peptides 29 (2008) 978–984
Fig. 2 – Sequence alignment of warnericin RK and deltalysins from various Staphylococcus species, including
delta-lysin I and II produced by S. warneri RK. The
alignment has been performed with the Clone Manager
software using the multi-way protein alignment (scoring
matrix: BLOSUM 62).
Legionella activity (data not shown). Subsequently, only three
out of the seven peptides subjected to sequence analysis were
characterized (Fig. 2). The 15 min peak, which peptide
sequence is original, was named warnericin RK (2561 Da).
The sequences of the 19 and 21 min peaks were identical to
peptides deduced from gene sequences from S. warneri [22].
These genes were described to encode delta-lysin analogs
named delta-lysin I (2760 Da) and delta-lysin II (2871 Da). The
peaks displaying a molecular mass of 2788 and 2900 Da were
likely to be the formyl-delta-lysin I and formyl-delta-lysin II
respectively. Indeed, the formyl-delta-lysin form has
been previously described to be naturally produced in
Staphylococcus aureus culture supernatant [13]. A similar
assumption could be made for the 2589 Da peak, which mass
corresponds to the molecular mass of the formyl-warnericin
RK. The formylation of the N-terminal residue could
explain why the attempts to sequence these peptides were
unsuccessful.
The three identified peptides, warnericin RK, delta-lysin I
and delta-lysin II, share similar biochemical characteristics
as they are short, cationic and highly hydrophobic. In order
to figure out whether these peptides might have a similar
structure, we performed a sequence comparison of warnericin RK with several staphylococcal delta-lysins, including
delta-lysin I and II from S. warneri. The sequence alignment,
in Fig. 2, shows that no high similarity exists between
981
warnericin RK and delta-lysins compared to the high level of
similarity observed between the staphylococcal delta-lysin
sequences.
Despite the differences in primary sequence, the amphiphilic properties were similar (Fig. 3), suggesting a 3D structure
of warnericin RK similar to the helical structure of the S. aureus
delta-lysin [12,21]. Such assumption was supported by the
amphipatic character of the sequence, the 3D and 2D structure
prediction results (not shown) and the helical conformation
adopted by the hemolytic peptide n-22 derived from the S.
aureus delta-lysin by deletion of the first four N-terminal
residues [6]. As delta-lysin I and II are highly similar, we
decided to perform the next experiments with delta-lysin I
only.
3.2.
Warnericin RK and delta-lysin I display the same
antibacterial spectrum
In our previous study [10], we reported the antibacterial
activity of a concentrated peptide extract. In the present
work, the peptides were fully purified and tested at high
concentration (50 mg ml 1) against various Gram-positive
and Gram-negative bacterial strains (Table 1). Each peptide,
warnericin RK and delta-lysin I, was active against all the
Legionella strains tested, including non-pneumophila, pneumophila serogroup 1 and pneumophila non-serogroup 1 strains. In
addition, all the other strains besides Bacillus megaterium
were resistant to these peptides. These results confirm that
the two peptides had the same antibacterial spectrum and
that this spectrum was almost restricted to the Legionella
genus. To our knowledge, delta-lysin is commonly described
to have no antibacterial activity [5]. However, one paper has
described an activity, at high concentration, against B.
megaterium but not against other bacterial strains tested
[11]. It should be noted that Legionella was not tested in this
paper.
3.3.
Warnericin RK and delta-lysin I have similar MIC
towards L. pneumophila
The MIC of purified peptides towards L. pneumophila Lens was
determined using the microtiter plate assay. Serial two-fold
Fig. 3 – Helical wheel projection of S. warneri delta-lysin I and warnericin peptides. It is assumed that the whole peptide
sequences were in an ideal helical structure. The hydrophobicity of each helix position was calculated using the Eisenberg
consensus scale of hydrophobicity. Fc is the angle subtended by residues forming the cationic helix surface. Polar (&) and
non-polar (&) positions. (A) Delta-lysin I and (B) warnericin RK.
982
peptides 29 (2008) 978–984
Fig. 4 – Hemolytic activity of warnericin RK (white bars) and
delta-lysin I (black bars) towards human erythrocytes. The
results are expressed as a percent hemolysis compared to
a positive control and represent the mean +/SS.D. of
triplicates. The experiment was performed twice and gave
similar results.
dilutions of the peptides were tested and the highest dilution
that resulted in a full inhibitory activity gave the MIC. In our
assay, the warnericin RK MIC for L. pneumophila Lens was
3 mg ml 1. Delta-lysin I displayed the same MIC. These values
correspond to a MIC of about 1 mM, indicating that these
peptides were active in the micromolar range. The warnericin
RK and delta-lysin I MIC were also assessed for B. megaterium.
This MIC was 12 mg ml 1. In the paper of Kreger et al. [11] the
delta-lysin MIC for B. megaterium was 63 mg ml 1. This
discrepancy might be mainly explained by B. megaterium
strain variation and by the differences between delta-lysin I
and the delta-lysin of S. aureus.
3.4.
Fig. 5 – Bactericidal assay of warnericin RK on exponentialphase (white bars) and stationary-phase (black bars) L.
pneumophila Lens cells. Data represents the mean +/SS.D.
of quadruplicates. The test was repeated 3 times and gave
similar results.
Fig. 6 – Bactericidal assay of delta-lysin I on exponentialphase (white bars) and stationary-phase (black bars) L.
pneumophila Lens cells. Data represents the mean +/SS.D.
of quadruplicates. The test was repeated 3 times and gave
similar results.
Warnericin RK has a high hemolytic potency
As delta-lysins display hemolytic activity [11], warnericin RK
was tested for erythrocytes lysis. Serial two-fold dilution of
delta-lysin I and warnericin RK in PBS were added to a human
erythrocytes suspension. After a 30 min incubation period,
A576 was measured as an indicator of hemolysis. The results,
in Fig. 4, demonstrate that warnericin RK, as delta-lysin I, had
hemolytic activity and that this activity was dose-dependant.
Warnericin RK seemed to be even more potent than deltalysin I, as lysis was consistently higher when comparing
the same concentrations of peptides. A 50% hemolysis
was achieved with 3 and 12 mg ml 1 of warnericin RK and
delta-lysin I, respectively.
for their sensitivity to warnericin RK and delta-lysin I.
L. pneumophila Lens cells, from either exponential or stationary growth phase culture, were collected and used in a
microtiter plate assay. The results in Fig. 5 display a high
difference of bactericidal effect of warnericin RK between
exponential and stationary-phase cell samples. While exponential-phase cells were killed from 3.12 mg ml 1 of warnericin RK, bacteria in stationary-phase were poorly killed even
at 12.5 mg ml 1. The results with delta-lysin I (Fig. 6) are
similar but this peptide seemed less potent than warnericin
RK onto exponential-phase cells.
3.5.
Warnericin RK and delta-lysin I are highly effective
against exponential-phase L. pneumophila cells
4.
It has been previously reported that L. pneumophila could
switch between two forms, replicative and transmissive,
during intra-amoebal growth [16]. The transmissive form
displays specific traits like motility, higher cytotoxicity and
higher resistance to biocides, antibiotics and osmotic shock
[1,2]. The replicative form is mimicked by exponentialphase cells, whereas the transmissive form is mimicked by
stationary-phase cells. We thus compared both cell types
Our study described the characterization of the first antiLegionella peptide, named warnericin RK. This peptide was
produced by the S. warneri RK strain [10]. S. warneri has been
reported to produce other antibacterial peptides, i.e. nukacin
ISK-1 [19], warnerin [18] and warnericin RB4 [14]. None were
described to be active against Legionella, and the primary
sequence of nukacin ISK-1 and warnericin RB4 were different
from those of warnericin RK. In addition, warnerin, whose
Discussion
peptides 29 (2008) 978–984
sequence is not known, is highly active against S. aureus, while
warnericin RK is not. These results emphasize that warnericin
RK is actually an original peptide.
S. warneri RK also produced two others anti-Legionella
peptides, delta-lysin I and II, which genes were previously
reported [22], Delta-lysins, also known as delta-hemolysins or
delta-toxins, are a family of peptides produced by various
Staphylococcus strains. However, these hemolytic peptides
were not commonly described to have antibacterial activity
[4,5]. One study has described a poor activity (MIC of 20 mM)
against B. megaterium [11]. Also, a recent study has shown that
delta-lysin analogs, where the aspartic residues were substituted by lysine residues, were active against Escherichia coli,
at a MIC of 3 mM [4], while the native delta-lysin was not active.
These analogs also displayed a higher hemolytic activity,
suggesting that potency of hemolytic and antibacterial activity
were related.
We compared warnericin RK and delta-lysin I activity.
These peptides had the same antibacterial spectrum and
the same MIC on L. pneumophila, demonstrating for the first
time that native delta-lysins could have an antibacterial
activity at low MIC (around 1 mM). Besides, hemolytic assays
showed that not only warnericin RK was active against
erythrocytes but it was even more potent on erythrocytes
than delta-lysin I. Warnericin RK also had a higher
bactericidal effect and higher activity against sessile cells
than delta-lysin I on L. pneumophila. The bactericidal effect
was much more pronounced against exponential-phase cells
than stationary-phase cells. This result is not surprising
because stationary-phase cells of L. pneumophila have been
described to be more resistant to biocides and antibiotics [8,9], although the reason for this resistance is not
understood.
Regarding their similar properties, we could hypothesize
that warnericin RK and delta-lysin I might have a similar
mechanism of action. The fact that these two peptides were
active only against Legionella and erythrocytes suggest that
these cells should share specific features. Also, Legionella and B.
megaterium might have a specific trait, different from other
bacteria, which could account for their particular sensitivity to
warnericin RK and delta-lysins. We are currently studying the
mode of action of warnericin RK to understand this high
specificity.
Acknowledgements
The authors would like to thank Daniel Guyonnet (University
of Poitiers) for help in purification and Dominique Mazzocut
(University of Lyon) for the microsequencing analysis. Julien
Verdon is supported by a grant from the French Minister of
Research. This work received financial support from AFSSET
(n8 ARCL-2005-005).
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RNAIII from coagulase-negative staphylococci. J Bacteriol
1998;180:3181–6.
[23] Thomas V, Bouchez T, Nicolas V, Robert S, Loret JF, Levi Y.
Amoebae in domestic water systems: resistance to
disinfection treatments and implication in Legionella
persistence. J Appl Microbiol 2004;97:950–63.
I.2
Résultats complémentaires
I.2.1
Suivi de croissance de L. pneumophila
Dans la publication 2, une expérience a été réalisée sur L. pneumophila en phase
exponentielle et stationnaire de croissance. Afin d’identifier ces deux phases, un suivi de
croissance de L. pneumophila Lens à 37°C a été réalisé au préalable (Figure 27).
Croissance (log(DO600 ))
10
1
0,1
0,01
0
10
20
30
40
50
60
70
80
Temps (heures)
Figure 27 : Croissance de L. pneumophila Lens. La croissance de L. pneumophila Lens est
effectuée en milieu BYE à 37°C sous agitation (150 rpm). Le suivi de croissance est réalisé
par mesure de la DO à 600 nm pendant 72 heures. L’inoculum de départ est fixé à 10 7
UFC/ml.
La phase exponentielle de croissance est comprise entre 10 heures et 30 heures de
croissance (DO600 comprise entre 0,3 et 2) tandis que la phase stationnaire de croissance
démarre autour de 35 heures à 40 heures (DO600 supérieure à 3).
Dans l’étude, les cellules de L. pneumophila en phase exponentielle de croissance
correspondent à une DO600 comprise entre 0,3 et 0,6 et les cellules en phase stationnaire de
croissance correspondent à une DO600 supérieure à 3.
I.2.2
Suivi de production de la warnéricine RK
La plupart des toxines extracellulaires secrétées par S. aureus sont sous le contrôle du
système de virulence agr. C’est le cas notamment de la δ-hémolysine, qui est produite en fin
Caractérisation et mode d’action de la warnéricine RK, un peptide anti-Legionella
117
de phase exponentielle de croissance (Balaban & Novick, 1995; Janzon & Arvidson, 1990;
Lyon & Novick, 2004). Afin de déterminer quand la warnéricine RK est produite par S.
warneri RK, une cinétique de production a été mise en place. Dans un premier temps, la
croissance de S. warneri RK est suivie à 37°C afin de déterminer les phases exponentielle et
stationnaire de croissance (Figure 28).
1,E+02
Croissance (log(DO600 ))
1,E+01
1,E+00
1,E-01
1,E-02
0
5
10
15
20
25
30
Temps (heures)
Figure 28 : Croissance de S. warneri RK à 37°C. La croissance de S. warneri RK est
effectuée en milieu BHI sous agitation (250 rpm). Le suivi de croissance est réalisé par
mesure de la DO à 600 nm pendant 24 heures. L’inoculum de départ est fixé à 107 UFC/ml.
Les flèches indiquent les différents temps pour lesquels le surnageant de culture a été
récupéré.
La phase exponentielle de croissance s’étend de 3 à 8 heures de culture (DO600
comprise entre 0,04 et 4). Au delà de 8 heures de culture, les bactéries entrent en phase
stationnaire de croissance (DO600 supérieure à 5).
Dans un second temps, l’extrait brut, obtenu par centrifugation et chauffage du
surnageant de culture de S. warneri RK, subit une première étape de séparation par
chromatographie d’interaction hydrophobe (colonne Poros Phenyl 20). Ensuite, la fraction
active récoltée est injectée sur une colonne analytique (C8) en HPLC de phase inverse
Caractérisation et mode d’action de la warnéricine RK, un peptide anti-Legionella
118
(Figure 29). Cette technique, utilisée au départ pour la purification de la δ-hémolysine (Otto
& Gotz, 2000), a été adaptée pour la purification des peptides anti-Legionella produits par S.
warneri RK, durant la thèse de N. Girardin au laboratoire. Cette méthode, différente de celle
décrite dans la publication 2, présente l’avantage d’être plus rapide et d’augmenter le
rendement tout en réduisant le nombre d’étapes de purification. Ainsi, elle s’adapte
parfaitement à l’expérience de suivi de production de la warnéricine RK. Les peptides isolés
après HPLC sont analysés par spectrométrie de masse en électrospray (ESI-MS) et la quantité
de chacun est déterminée par dosage en utilisant la technique de l’acide bicinchoninique
(Tableau 7).
A
B
60
40
20
Absorbance à 220 nm(mUA)
80
100
9h30
80
60
5
40
2
3
6
7
20
0
0
Temps de rétention (min)
Temps de rétention (min)
C
D
100
5
60
6
2
3 4
40
7
20
5
15h
Absorbance à 220 nm(mUA)
80
80
60
2
3 4
6
40
1
7
20
0
Gradient d’élution (% d’acétonitrile)
12h
100
Gradient d’élution (% d’acétonitrile)
0
Temps de rétention (min)
Temps de rétention (min)
E
100
24h
80
60
2
3 4
1
6
40
7
20
Gradient d’élution (% d’acétonitrile)
5
Absorbance à 220 nm(mUA)
Absorbance à 220 nm(mUA)
Gradient d’élution (% d’acétonitrile)
8h
Gradient d’élution (% d’acétonitrile)
Absorbance à 220 nm(mUA)
100
0
Temps de rétention (min)
Figure 29 : Cinétique de production de la warnéricine RK suivie par chromatographie
HPLC/UV en phase inverse. La cinétique de production est réalisée sur 5 temps de culture
différents : 8 heures de culture (A), 9 heures 30 de culture (B), 12 heures de culture (C), 15
heures de culture (D), 24 heures de culture (E). Les numéros indiquent les fractions analysées
en ESI-MS. Les masses des peptides identifiés sont données dans le Tableau 6.
Caractérisation et mode d’action de la warnéricine RK, un peptide anti-Legionella
119
La warnéricine RK, sous sa forme formylée, est détectée dans le surnageant de culture
de S. warneri RK à partir de 9 heures et 30 minutes de culture (DO600 = 4,38) c’est-à-dire en
fin de phase exponentielle de croissance d’après la courbe (Figures 28 et 29B). La quantité de
warnéricine RK augmente jusqu’à atteindre un maximum (3 mg/l) au bout de 15 heures de
culture (DO600 = 9,91) (Figure 29B, C et D) puis diminue (1,5 mg/l) de nouveau lorsque la
phase stationnaire se prolonge (DO600 = 10,32 à 24 heures de culture) (Figure 29 E) (Tableau
7).
Tableau 7 : Concentration des peptides purifiés dans le surnageant de culture de S.
warneri RK. Chaque peptide a été lyophilisé puis repris dans de l’eau avant d’être dosé. Les
valeurs représentent une moyenne sur deux points de dosage.
Concentration (mg/l)
Numéro
Peptide
8h
9h30
12h
15h
24h
1
δ-hémolysine II (2871 Da)
NP
ND
ND
ND
ND
2
2614 Da
NP
0,1
0,3
1,9
1,7
3
f-warnéricine RK (2589 Da)
NP
0,2
0,5
3,0
1,5
4
2940 Da
NP
NP
0,3
3,8
6,4
5
f-δ-hémolysine II (2900 Da)
NP
1,5
2,1
1,2
7,0
6
f-δ-hémolysine I (2788 Da)
NP
1,4
1,0
NP
NP
7
2341 Da
NP
ND
ND
0,8
0,3
NP : non purifié
ND : non détecté lors du dosage
f : forme formylée du peptide
Hormis la warnéricine RK, 6 autres composés ont été isolés lors de cette
expérimentation : 4 peptides déjà identifiés dans la publication 2 (δ-hémolysine II, f-δhémolysine II, f-δ-hémolysine I et le peptide de masse 2940 Da) et 2 peptides de masse
moléculaire 2614 Da et 2341 Da. Ces masses ne correspondent à aucune masse de peptide
connu. Parmi eux, le peptide de masse moléculaire 2614 Da a précédemment été isolé au
laboratoire lors de la purification du surnageant de culture de S. warneri RK par
chromatographie échangeuse de cation et, a été décrit comme actif contre L. pneumophila
(Héchard et al., 2005). Le composé de masse 2341 Da n’a, quant à lui, montré aucune activité
anti-Legionella.
Caractérisation et mode d’action de la warnéricine RK, un peptide anti-Legionella
120
Le peptide de masse moléculaire 2940 Da possède une activité anti-Legionella
(Verdon et al., 2008). Il a été envoyé au séquençage à la plateforme de protéomique de
Rouen. Les analyses sont actuellement en cours.
Deux composés, retrouvés lors de la purification du surnageant de S. warneri RK par
chromatographie d’affinité avec l’hydroxyapatite sont absents de la fraction active récupérée
après chromatographie d’interaction hydrophobe : la δ-hémolysine I et la warnéricine RK
sous leurs formes natives. Seules les formes formylées ont été purifiées (Figure 29).
L’analyse des temps de rétention de la warnéricine RK et de la δ-hémolysine I par HPLC en
phase inverse dans la publication 2 montre que, sur colonne analytique C8, ils sont inférieurs
à celui de la δ-hémolysine II. Ainsi, il est possible que ces deux peptides soient peu ou pas
retenus par la colonne lors de la purification par chromatographie d’interaction hydrophobe.
La cinétique de production de la warnéricine RK a été réalisée trois fois et les
expériences confirment que le peptide est produit en fin de phase exponentielle de croissance
(autour de 8 heures de croissance). De plus, les profils chromatographiques obtenus lors des
cinétiques de production révèlent que les mêmes peptides sont présents à chaque fois.
Cependant, la quantité de chaque peptide produit est extrêmement variable d’une expérience à
l’autre. Il faut donc interpréter les résultats quantitatifs présentés ici avec précaution. La
production des peptides produits dans le surnageant de culture de S. warneri RK doit être
soumise à une régulation importante sous la dépendance d’un ou plusieurs paramètres que
nous ne maitrisons pas.
I.2.3
Activité inhibitrice de la warnéricine RK
La publication 2 présente un spectre d’activité de la warnéricine RK réalisé à 20 µM.
Ce spectre d’activité montre une spécificité du peptide pour les bactéries du genre Legionella.
Afin de déterminer si les bactéries, non sensibles à 20 µM, sont sensibles à de plus fortes
doses de warnéricine RK ou complètement insensibles à l’action du peptide, un test de CMI
est réalisé en partant d’une concentration finale de warnéricine RK de 195,2 µM (soit 500
µg/ml) sur une sélection de 8 souches bactériennes (Tableau 8).
Caractérisation et mode d’action de la warnéricine RK, un peptide anti-Legionella
121
Tableau 8 : Activité inhibitrice de la warnéricine RK. Les bactéries cibles sont cultivées en
milieu BHI ou BYE selon leur genre et ajustées à 106 UFC/ml. La gamme de concentration de
warnéricine RK choisie est comprise entre 0,2 µM et 195,2 µM. Les résultats obtenus
correspondent à la CMI après 24 heures ou 96 heures de croissance à 37°C selon le genre
bactérien. n=2
Souche
B. megaterium F04
E. coli MG1655
CMI (µM)
1,5
> 195,2
L. longbeachae ATCC 33484
1,5
L. pneumophila Lens CIP 108286
1,5
L. monocytogenes EGDe
> 195,2
S. aureus 971
> 195,2
S. typhimurium
> 195,2
S. warneri RK
> 195,2
Les résultats indiquent que, hormis les souches de Legionella et B. megaterium, toutes
les souches testées ont une CMI supérieure à 195,2 µM de warnéricine RK. Ces bactéries
apparaissent donc insensibles à l’action du peptide. Ces résultats confirment l’activité
spécifique de la warnéricine RK sur Legionella et B. megaterium.
Les travaux de thèse de N. Girardin au laboratoire ont montré que deux autres
Bacillus, Bacillus sp. 41 et Bacillus sp. 273, sont également sensibles à la warnéricine RK
(CMI de 10 µM pour les deux souches) (Thèse de N. Girardin). Ainsi, trois souches
appartenant au genre Bacillus sont sensibles à la warnéricine RK mais à des concentrations
deux fois (B. megaterium F04) et 8 fois (Bacillus sp. 41 & 273) plus élevées que Legionella.
Il existe donc, parmi le genre Bacillus, une hétérogénéité de sensibilité à la warnéricine RK
d’autant plus que certaines souches comme B. subtilis CIP5265 ne sont pas sensibles (CMI
supérieur à 20 µM) (Verdon et al., 2008).
I.2.4
Activité cytotoxique de la warnéricine RK
Les bactéries du genre Legionella sont des parasites intracellulaires qui se développent
à l’intérieur de protozoaires comme les amibes, mais également de manière opportuniste à
l’intérieur des macrophages alvéolaires (Swanson & Hammer, 2000). Afin de tester l’activité
de la warnéricine RK sur d’autres types cellulaires eucaryotes que les érythrocytes, un test de
Caractérisation et mode d’action de la warnéricine RK, un peptide anti-Legionella
122
cytotoxicité est mis en place pour estimer dans quelle mesure la warnéricine RK peut agir sur
ces deux types cellulaires.
Dans un premier temps, des cellules THP-1 (106 cellules/ml), différenciées en
macrophages par ajout de PMA (phorbol 12-myristate 13-acetate), sont récupérées et
incubées en présence de warnéricine RK à différentes concentrations pendant 45 minutes à
37°C. Les suspensions sont marquées avec de l’iodure de propidium (IP) pendant 15 minutes
avant d’être analysées par cytométrie en flux (Figure 30). L’IP est un fluorochrome qui ne
pénètre que dans les cellules dont la membrane est endommagée et se fixe sur l’ADN double
brin. Il émet une fluorescence rouge (617 nm). Les cellules notées IP+ sont considérées
comme perméabilisés tandis que les cellules IP- sont intègres.
Cellules Thp-1 IP + (% relatif)
100
80
60
IP50
40
20
0
0
0,6
1,2
2,5
5
10
Concentration en warnéricine RK (µM)
Figure 30 : Activité de la warnéricine RK sur des cellules THP-1 différenciées. Les
cellules THP-1 ont été cultivées pendant 3 à 4 jours en milieu RPMI 1640 à 37°C. La
différenciation en macrophages se fait par ajout de PMA à 1 ng/ml pendant 24 heures. La
gamme de concentration de warnéricine RK choisie est comprise entre 0,2 µM et 10 µM. n=2
La warnéricine RK induit une perméabilisation des cellules monocytaires THP-1
différenciées. Cette perméabilisation se fait de manière dose-dépendante et commence à 1,2
µM de warnéricine RK. Nous avons défini l’indice de perméabilisation à 50%, noté IP50,
comme la plus petite concentration de warnéricine RK qui induit 50% de perméabilisation
cellulaire. La valeur d’IP50 pour les macrophages est d’environ 5 µM de warnéricine RK. A
10 µM de warnéricine RK, il y a plus de 90% de cellules qui sont IP+.
Caractérisation et mode d’action de la warnéricine RK, un peptide anti-Legionella
123
Dans un second temps, une suspension de trophozoïtes (106 cellules/ml) d’une souche
d’amibe environnementale, Acanthamoeba sp., est incubée en présence de warnéricine RK à
différentes concentrations pendant 45 minutes à 37°C. Les échantillons sont marqués avec de
l’IP pendant 15 minutes avant d’être analysés par cytométrie en flux (Figure 31). Le
trophozoïte est la forme métaboliquement active de l’amibe, contrairement au kyste qui
représente une forme de persistance lorsque les conditions deviennent défavorables (Bouyer et
al., 2007).
Trophozoïtes IP + (% relatif)
100
80
60
IP50
40
20
0
0
0,6
1,2
2,5
5
10
Concentration en warnéricine RK (µM)
Figure 31 : Activité de la warnéricine RK sur des trophozoïtes d’Acanthamoeba sp.
Acanthamoeba sp. a été cultivée 3 à 4 jours en milieu 1034 sous atmosphère enrichie en CO2
à 5%. La gamme de concentration de warnéricine RK choisie est comprise entre 0,2 µM et 10
µM. n=2
La warnéricine RK n’induit quasiment pas de perméabilisation des trophozoïtes
d’Acanthamoeba sp. Même une dose de 10 µM de warnéricine RK ne suffit pas à atteindre
50% de perméabilisation.
Caractérisation et mode d’action de la warnéricine RK, un peptide anti-Legionella
124
Chapitre II.
Mode d’action de la warnéricine RK
Les résultats présentés dans le Chapitre I nous ont conduit à émettre l’hypothèse que
la warnéricine RK et la δ-hémolysine possèderaient un mécanisme d’action similaire. Or, la δhémolysine agit sur la membrane selon un mécanisme « detergent-like », c’est-à-dire une
désintégration graduelle de la membrane en fonction de la quantité de peptides. L’étude sur
des membranes artificielles a permis de mettre en évidence la formation de pores à faible ratio
P/L (Mellor et al., 1988). A haut ratio P/L (125/1), le peptide induit une solubilisation de la
membrane à l’image d’un détergent (Bechinger & Lohner, 2006; Lohner et al., 1999). De
plus, la δ-hémolysine adopte une structure en hélice α amphiphile au contact des membranes,
données en accord avec un mécanisme de perméabilisation de la membrane (Lee et al., 1987).
Dans le but de déterminer le mécanisme d’action de la warnéricine RK, nous avons
analysé son action à la fois sur des membranes naturelles et artificielles (black lipid
membranes). La technique utilisée pour les membranes artificielles a consistée en une mesure
de la différence de potentiel induite par le peptide, de part et d’autre de la membrane. Cette
étude a été réalisée en collaboration avec Elke Maier et Roland Benz (Université de
Würzburg, Allemagne). La capacité de perméabilisation de L. pneumophila a été ensuite
déterminée par cytométrie en flux. Enfin, la structure de la warnéricine RK a été étudiée par
résonnance magnétique nucléaire (RMN), en collaboration avec Mirjam Falge et Cornelius
Faber (Université de Würzburg, Allemagne). L’ensemble des résultats est présenté dans la
publication 3.
II.1
Publication 3 : Detergent-like activity and α helical structure of
warnericin RK, an anti-Legionella peptide
Les expériences menées sur les black lipid membranes indiquent que la warnéricine RK
perméabilise ces membranes indépendamment du voltage. Cette perméabilisation passe par la
formation de pores laissant majoritairement passer les cations (ions K+). Ces pores ne sont pas
de taille bien définie, comme indiqué par les résultats de protection osmotique sur des
érythrocytes humains.
En parallèle, l’action de la warnéricine RK sur des cellules de L. pneumophila a été
déterminée par cytométrie en flux. Elles sont perméabilisées par le peptide de manière
concentration-dépendante. De façon intéressante, Legionella est particulièrement sensible aux
Caractérisation et mode d’action de la warnéricine RK, un peptide anti-Legionella
125
détergents (jusqu’à 1000 fois plus sensible que les autres bactéries testées). L’ensemble des
résultats obtenus laisse penser que la warnéricine RK agit également via un mécanisme
d’action detergent like.
Finalement, la structure du peptide, analysée par dichroïsme circulaire et RMN, a révélé
que la warnéricine RK adopte une structure en hélice α amphiphile au contact des membranes,
de la même manière que la δ-hémolysine, confirmant ainsi les prédictions de structure faites
précédemment.
La forte sensibilité de Legionella à la warnéricine RK pourrait s’expliquer par le fait
que, d’une part, le peptide possède un mode d’action detergent-like et que, d’autre part, les
bactéries du genre Legionella sont particulièrement sensibles aux détergents.
Caractérisation et mode d’action de la warnéricine RK, un peptide anti-Legionella
126
PUBLICATION 3
Detergent-like activity and α-helical structure of
warnericin RK, an anti-Legionella peptide
BIOPHYSICAL JOURNAL
2009
Caractérisation et mode d’action de la warnéricine RK, un peptide anti-Legionella
127
Caractérisation et mode d’action de la warnéricine RK, un peptide anti-Legionella
128
Please cite this article in press as: Verdon et al., Detergent-Like Activity and a-Helical Structure of Warnericin RK, an Anti-Legionella Peptide, Biophysical Journal (2009), doi:10.1016/j.bpj.2009.06.053
Biophysical Journal Volume 97 October 2009 1–8
1
Detergent-Like Activity and a-Helical Structure of Warnericin RK,
an Anti-Legionella Peptide
Julien Verdon,† Mirjam Falge,‡ Elke Maier,§ Heike Bruhn,{ Michael Steinert,k Cornelius Faber,†† Roland Benz,‡‡
and Yann Héchard†*
†
Laboratoire de Chimie et Microbiologie de l’Eau, Unite Mixte de Recherche, Centre National de la Recherche Scientifique 6008, Université de
Poitiers, Poitiers, France; ‡Department of Experimental Physics 5, §Lehrstuhl für Biotechnologie, Theodor-Boveri-Institut (Biozentrum), and
{
Institute for Molecular Infection Biology, University of Würzburg, Würzburg, Germany; kInstitut für Mikrobiologie, Technische Universität
Braunschweig, Braunschweig, Germany; ††Institute for Clinical Radiology, University Hospital Münster, Münster, Germany; and ‡‡School of
Science and Technology, Jacobs University Bremen, Bremen, Germany
½AQ1
½AQ2
½AQ3
ABSTRACT Warnericin RK is the first antimicrobial peptide known to be active against Legionella pneumophila, a pathogen
bacterium that is responsible for severe pneumonia. Strikingly, this peptide displays a very narrow range of antimicrobial activity,
almost limited to the Legionella genus, and a hemolytic activity. A similar activity has been described for d-lysin, a well-known
hemolytic peptide of Staphylococci that has not been described as antimicrobial. In this study we aimed to understand the
mode of action of warnericin RK and to explain its particular target specificity. We found that warnericin RK permeabilizes artificial
membranes in a voltage-independent manner. Osmotic protection experiments on erythrocytes showed that warnericin RK does
not form well-defined pores, suggesting a detergent-like mode of action, as previously described for d-lysin at high concentrations. Warnericin RK also permeabilized Legionella cells, and these cells displayed a high sensitivity to detergents. Depending
on the detergent used, Legionella was from 10- to 1000-fold more sensitive than the other bacteria tested. Finally, the structure
of warnericin RK was investigated by means of circular dichroism and NMR spectroscopy. The peptide adopted an
amphiphilic a-helical structure, consistent with the proposed mode of action. We conclude that the specificity of warnericin
RK toward Legionella results from both the detergent-like mode of action of the peptide and the high sensitivity of these bacteria
to detergents.
INTRODUCTION
Antimicrobial peptides (AMPs) are ubiquitous molecules
that are part of the intrinsic defenses of most organisms
(1–5). In multicellular organisms, AMPs such as defensins
and cathelicidins provide a coordinated protective response
against infection, and they are a principal component of
innate immunity in vertebrates. AMPs likely help unicellular
organisms struggle against competitor species. AMPs are
classified on the basis of their primary structure, biochemical
features, or spectrum of activity. They act against bacteria by
permeabilizing the membrane or inhibiting metabolism (6).
Many studies have focused on peptide-membrane interactions, leading to two distinct mechanisms (7,8). First, in
the toroidal or barrel-stave pore models, the peptides form
well-defined transmembrane pores. Second, in the carpet or
detergent-like models, peptide monomers or micelles interact
with and translocate across the membrane, leading to transient permeabilization. At high concentration, the membrane
is disrupted, leading to cell lysis. In this model, even peptides
that are too short to form transmembrane pores might
permeabilize the membrane. We recently identified three
peptides, produced by the Staphylococcus warneri RK
strain, that are active against Legionella (9). To our knowledge, they are the first anti-Legionella peptides to be
described. Legionella pneumophila is the pathogenic bacteSubmitted March 31, 2009, and accepted for publication June 23, 2009.
*Correspondence: [email protected]
Editor: Mark Girvin.
Ó 2009 by the Biophysical Society
0006-3495/09/10/0001/8 $2.00
rium responsible for legionellosis. Legionella is found in
freshwater environments and eventually infects humans
who inhale contaminated droplets (10,11). Two of these
three anti-Legionella peptides belong to the d-lysin family,
and one—warnericin RK—had not been described before,
to our knowledge. d-Lysins are peptides that are produced ½AQ4
by various Staphylococcal strains and possess a hemolytic
activity (12). Warnericin RK does not share high sequence
similarity with other peptides. Of interest, the three peptides
display a very narrow spectrum of activity, almost limited
to the Legionella genus. However, d-lysins had not been
described to be active against bacteria (13,14). Furthermore,
warnericin RK has been shown to have a hemolytic activity
(9). Although warnericin RK and d-lysins do not share a high
similarity in their primary sequence, they do share biological
activities. As d-lysin activity has been extensively studied
(for review, see Verdon et al. (15)), it could be useful to understand warnericin RK’s mode of action. d-Lysin is a linear
amphiphilic a-helical peptide (22 aa) that interacts with
membranes and, depending on the concentration, leads to
permeabilization or cell lysis (16). It has been proposed
that d-lysin has a detergent-like mode of action (7). Some
membrane features, such as the presence of liquid-disordered
domains, phospholipid acyl chain structure, and elastic
properties, particularly influence the interaction with d-lysin
(17–19).
½AQ5
In an attempt to unravel the mode of action of warnericin
RK and understand its narrow spectrum of activity, we
doi: 10.1016/j.bpj.2009.06.053
BPJ 959
Please cite this article in press as: Verdon et al., Detergent-Like Activity and a-Helical Structure of Warnericin RK, an Anti-Legionella Peptide, Biophysical Journal (2009), doi:10.1016/j.bpj.2009.06.053
2
Verdon et al.
Hemolysis assay and osmotic protection
experiments
TABLE 1 Minimum inhibitory concentration of various
detergents against L. pneumophila and selected bacterial
strains
Triton
SDS Tween 20 Tween 80 CHAPS X-100
B. megaterium F04
0.007
Escherichia coli MG1655
0.1
Legionella longbeachae
0.001
ATCC 33484
L. pneumophila Lens
0.001
Listeria monocytogenes
0.007
EGDe
Staphylococcus aureus 971 0.01
Salmonella typhimurium
>1
Staphylococcus warneri RK 0.01
½AQ14
>1
>1
0.001
>1
>1
0.001
0.7
1
0.1
0.004
>1
0.001
0.001
>1
0.001
>1
0.1
>1
0.0007
>1
>1
>1
>1
>1
>1
>1
>1
1
>1
>1
>1
>1
All detergents were used up to 1% concentration. The results are the mean of
three independent experiments.
studied its activity on artificial membranes and on L. pneumophila cells. The antimicrobial activity of warnericin RK
and several detergents were compared for various bacteria.
Finally, the structure of warnericin RK was examined by
means of circular dichroism (CD) and NMR.
MATERIALS AND METHODS
Detergent antibacterial activity
Bacterial strains, growth conditions,
and antimicrobials
½AQ6
The hemolytic activity of warnericin RK and osmotic protection were
measured by detection of released hemoglobin from human erythrocytes
as described previously (22). Fresh human blood (4 1 mL) from a healthy
volunteer was centrifuged (12000 rpm, 1 min, 4 C) to collect erythrocytes. The cells were washed with saline buffer (0.9% NaCl, 5 mM Tris,
pH 7) until the supernatant became clear, pooled, and adjusted to a final
volume of 30 mL with saline buffer. Reactions were performed in 1 mL
mixtures containing 250 mL of the erythrocytes solution, 500 mL of saline
buffer, and 250 mL of a variable amount of peptides or an equivalent volume
of saline buffer. Serial twofold dilutions of peptides were performed in saline
buffer and added to the mixtures. The reaction mixtures were incubated at
37 C for 30 min. Erythrocytes were removed by centrifugation (12000 rpm, 1 min, 4 C) and the OD543 of the supernatant was measured by spectrophotometry. To determine 100% cell lysis, the erythrocytes were resuspended in 0.1% Triton X-100.
For osmotic protection, we used the following polyethyleneglycols
(PEGs): PEG 200 (diameter 0.75 nm), PEG 400 (diameter 1.07 nm), PEG
600 (diameter 1.32 nm), PEG 1000 (diameter 1.72 nm), PEG 2000 (diameter
2.47 nm), PEG 4000 (diameter 3.54 nm), PEG 6000 (diameter 4.37 nm), PEG
8000 (diameter 5.04 nm), and PEG 10000 (diameter 5.70 nm) at a final concentration of 30 mM. Human erythrocytes were incubated with warnericin RK at
37 C for 30 min. Lysis of the human erythrocytes was quantified by hemoglobin release as determined at OD543. The results were expressed as a
percentage of the total hemoglobin release as compared to 0.1% Triton X-100.
The bacterial strains used in this study are listed in Table 1. Legionella
strains were routinely cultured in buffered yeast extract (BYE) broth supplemented with L-cysteine (0.4 g/L) and ferric pyrophosphate (0.25 g/L) or on
buffered charcoal yeast extract (BCYE) agar plates for 4 days. Solid medium
was obtained by adding charcoal (2 g/L) and agar (15 g/L) to nonsterilized
BYE. Nonlegionellae bacteria were grown on brain heart infusion (BHI)
agar plates. Cultures were incubated in BHI broth at 37 C for 24–96 h under
agitation (150 rpm). Synthetic warnericin RK, with the amino acid sequence
MQFITDLIKKAVDFFKGLFGNK, was purchased from GenScript Corporation (Piscataway, NJ).
Planar bilayer assays
The methods used for the lipid bilayer experiments have previously been
described in detail (20). In the experimental setup, two compartments of
a Teflon cell filled with 5 mL electrolyte solution were connected by a small
circular hole with an area of ~0.3 mm2. The black lipid bilayer membrane was
made by painting a 1% (w/v) diphytanoyl phosphatidylcholine (DPPC)/
n-decane solution (Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL) across the hole. Warnericin RK was added from a concentrated stock solution (1 mg/mL) to the
aqueous phase on both sides, bathing the black membrane. Ag/AgCl electrodes (with salt bridges) were connected in series to a voltage source and
an in-house-made current-to-voltage converter for the electrical measurements. The amplified signal was recorded with a strip chart recorder. All salts
were obtained from Merck (Germany) or Sigma-Aldrich (Germany) at analytical grade. The aqueous salt solutions were unbuffered and, if not noted otherwise, had a pH of ~6. The temperature during all experiments was maintained
at 20 C. The zero-current membrane potential measurements were performed
as been described previously (21) by establishing a salt gradient starting from
0.1 M KCl across black membranes containing 10–1000 channels. Zerocurrent potentials were measured using a high-impedance electrometer
(Keithley 617). Analysis of the zero current membrane potential was performed using the Goldman-Hodgkin-Katz equation.
Biophysical Journal 97(7) 1–8
BPJ 959
The minimal inhibitory concentration (MIC) of the detergents was determined by a microdilution susceptibility test as described below. Bacteria
cells were inoculated in BYE or BHI broth to ~106 CFU/mL. Bacterial
suspensions were put into a sterile microtiter plate (Nunclon Delta Surface).
Serial 10-fold dilutions of detergents were performed in sterile water and
added to bacterial suspensions at a starting concentration of 1%. Microtiter
plates were incubated at 37 C for 24 or 96 h depending on the tested strain.
The MIC was determined by monitoring the OD595 with a microtiter plate
reader Sunrise (TECAN, Lyon, France).
Membrane permeabilization assays
L. pneumophila cells in the exponential growth phase (OD600 ~0.5–0.8)
were adjusted at 106 CFU/mL and treated with several concentrations of
warnericin RK. Samples were incubated 45 min at 37 C. Then the cells
were stained with a Live/Dead BacLight kit (Invitrogen) as recommended
by the supplier. The two fluorescent dyes (SYTO 9 and propidium iodide
(PI)) were added either alone or in combination to stain the cells. Staining
was allowed for 15 min at room temperature in the dark. Flow cytometric
measurements were performed on a FACSCanto II flow cytometer (BD
Biosciences) with a 488 nm argon excitation laser. A total of 50,000 events
were analyzed in each sample, using BD FACSDiVa 6 software (BD Biosciences) for data acquisition and analysis. Optical filters were set up such that
PI fluorescence was measured at 670 LP nm and SYTO 9 fluorescence was
measured at 530/30 BP nm. A SYTO 9þ/PI-gate was drawn to determine the
percentage of viable cells in the control, and the antimicrobial activity of
warnericin RK was measured as the percentage of remaining nonpermeabilized bacteria with respect to the untreated control. All experiments were
repeated at least three times, and the patterns were reproducible.
Preparation of small unilamellar vesicles
Deuterated 1.2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine d54 (DMPC) was
purchased from Avanti Polar Lipids. DMPC dissolved in chloroform solution was first evaporated under nitrogen. The residual lipid film was
Please cite this article in press as: Verdon et al., Detergent-Like Activity and a-Helical Structure of Warnericin RK, an Anti-Legionella Peptide, Biophysical Journal (2009), doi:10.1016/j.bpj.2009.06.053
3
resuspended in 10 mM sodium phosphate buffer to a final concentration of
10 mg/mL. Small unilamellar vesicles (SUVs) were prepared from this
suspension by bath sonication for 15–30 min.
CD spectra
CD measurements were performed using a Jasco J-715 spectrometer. For the
experiments, lyophilized warnericin RK was dissolved in the measurement
buffer. CD spectra were recorded from solutions containing 39 mM warnericin RK in pure 10 mM sodium phosphate buffer at pH 5.2 and in the same
buffer with 8% deuterated trifluoroethanol (TFE-d3) added as cosolvent, as
well as from solutions containing 50 mM warnericin RK and deuterated
DMPC in molar ratios of warnericin RK/DMPC of 1:1, 1:2.5, 1:5, and
1:10 in 10 mM sodium phosphate buffer at pH 5.5.
To determine the secondary structure content of warnericin RK by decomposition of the measured CD spectra, CDSSTR analysis software was used
via the DichroWeb server (DichroWeb—On Line Circular Dichroism Analysis, http://www.cryst.bbk.ac.uk/cdweb/html/home.html).
Conductance (nS)
Activity and Structure of Warnericin RK
4
3
2
1
1
2
3
4
5
6
Time (min)
FIGURE 1 Single-channel analysis of warnericin RK in black lipid mem- ½AQ15
branes, showing the increase of the membrane current (expressed as nS) after
addition of warnericin RK at 0.4 mM. The aqueous phase contained 1 M
KCl. The membrane was formed from DPPC/n-decane. The voltage applied
was 20 mV; T ¼ 20 C.
NMR spectra
½AQ7
Three different samples were used for NMR spectroscopy of warnericin RK
in pure buffer solution, in buffer with 8% TFE, and in a DMPC SUVs solution. For all samples, 10 mM sodium phosphate solution at pH 5.5 with 10%
D2O was used as buffer.
Correlation spectroscopy (COSY), total correlation spectroscopy
(TOCSY), and nuclear Overhauser effect spectroscopy (NOESY) NMR
spectra from a 1.3 mM solution of warnericin RK in the pure aqueous buffer
were acquired on a Bruker Avance 800 MHz spectrometer with a cryo-probehead (Bruker Biospin, Rheinstetten, Germany).
COSY, TOCSY, and NOESY NMR spectra of the sample containing
1.4 mM warnericin RK and 13.6 mM DMPC SUVs were measured on a
Bruker Avance 750 MHz wide-bore spectrometer equipped with a TXI probehead.
To obtain the spectra of warnericin RK (1.7 mM) in a buffer containing
8% TFE-d3 as cosolvent, COSY, TOCSY, and two NOESY spectra with
different mixing times (150 ms and 300 ms) were acquired on a Bruker
Avance 600 MHz with a TXI probehead. The concentration of 8% TFE
was chosen from an NMR titration, representing the concentration at which
line-broadening was substantially reduced but changes in the chemical shift
of individual resonances were still minimal.
1
H resonances of the NMR spectra of warnericin RK in 8% TFE solution
were assigned using NMRView and according to a standard sequential
assignment procedure (23).
Structure calculations were performed with ARIA (version 1.2) (24).
Structures were calculated from random starting conformations using standard restrained molecular-dynamics and simulated-annealing protocols. A
single ARIA run consisted of eight iterations. In each iteration, 100 structures were calculated, and in the final iteration the 20 structures with the
lowest energy were selected for further analysis.
RESULTS
Interaction of warnericin RK with lipid bilayer
membranes
To provide the basis for understanding the interaction of warnericin RK with Legionella cells, we analyzed its ability to
influence the conductance of planar bilayer membranes.
Black lipid membranes were formed from 100% zwitterionic
lipid (DPPC) dissolved in n-decane, and warnericin RK was
added in low concentration to one or both sides of black lipid
bilayer membranes. The results suggest that warnericin RK
was able to increase the conductance of the model mem-
branes by several orders of magnitude. Of interest, in contrast to measurements with other cationic peptides (1,24),
an increase in conductance was observed at very low transmembrane voltages, which means that voltages of 10 or
20 mV were sufficient to detect conductance increase of
the membranes (data not shown).
Studies on the single-channel level
To determine whether warnericin RK is a pore-forming
compound, we repeated the membrane experiments at low
peptide concentration and high current resolution to observe
single-channel events. A low concentration of warnericin
RK (0.4 mM) was added to a black lipid membrane in 1 M
KCl while stirring to allow equilibration; ~1 min later, the
membrane conductance started to increase (Fig. 1). The
conductance increase occurred partially in small steps, but
also sometimes continuously, indicating that, rather than
forming pores, warnericin RK destabilizes the membrane.
Fig. 2 shows a distribution of single events measured in
experiments similar to that shown in Fig. 1. The histogram
indicates that warnericin RK induced conductance over
a considerable conductance range from 100 to ~900 pS,
with a maximum at 300 pS. Measurements were also performed at a KCl concentration of 0.1 M. Under these conditions, it was more or less impossible to detect single-channel
events. However, the conductance increase was smoother
than at 1 M KCl, suggesting that the conductance was
much smaller at 0.1 M KCl.
Voltage dependence of warnericin RK’s
conductance
High voltages tend to induce the peptide-mediated conductance of defensin-like molecules, particularly when the cis
side (the side of the addition of the peptides) has a positive
voltage, because the electric field tends to force the cationic
peptides into the membrane (4,25,26). Surprisingly, the
electric field strength had almost no influence on warnericin
Biophysical Journal 97(7) 1–8
BPJ 959
Please cite this article in press as: Verdon et al., Detergent-Like Activity and a-Helical Structure of Warnericin RK, an Anti-Legionella Peptide, Biophysical Journal (2009), doi:10.1016/j.bpj.2009.06.053
4
Verdon et al.
Probability of channel conductance P(G)
0,35
across the membrane. For KCl the more diluted side of the
membrane (0.1 M) always became positive, which indicated
preferential movement of potassium ions through the
membrane. This result indicated that warnericin RK made
the membranes permeable for cations, in contrast to its positive net charge (data not shown). Analysis of the membrane
potential using the Goldman-Hodgkin-Katz equation (21,27)
allowed us to calculate the ratio of cation permeability
divided by anion permeability), which was on average ½AQ9
(four experiments) ~2.5 for KCl.
0,3
0,25
0,2
0,15
0,1
0,05
0
Warnercin RK permeabilizes Legionella cells
Single channel conductance G [pS]
FIGURE 2 Histogram of the probability for the occurrence of a given
conductivity unit observed with membranes formed of DPPC/n-decane in
the presence of warnericin RK. P(G) indicates the probability with which
a given conductance increment G was observed in the single-channel experiments. It was calculated by dividing the number of transitions with a given
conductance increment by the total number of conductance fluctuations. The
average single-channel conductance of the right-hand maximum was
~500 pS for 70 conductance fluctuations. The aqueous phase contained
1 M KCl and 0.4 mM warnericin RK, and the applied voltage was 20 mV;
T ¼ 20 C.
Osmotic protection experiments
Ionic selectivity of warnericin RK-induced
conductance
Zero-current membrane potential measurements were performed to obtain further information on the structure of the
channel formed by warnericin RK. To that end, membranes
were formed in 0.1 M KCl, and warnericin RK was added to
the aqueous phase to a concentration of 0.2 mM. Subsequently, the membrane conductance started to increase. After
~20 min, the conductance nearly reached a steady state. At
that time, the KCl concentration on one side of the membranes was increased fivefold, starting at 0.1 M, by adding
concentrated KCl solution. The zero-current potentials
were measured 5 min after every increase of the salt gradient
We previously showed that warnericin RK lyses erythrocytes
(9). To estimate the pore size induced by warnericin RK,
we performed osmotic protection experiments. Fig. 5 A
shows the dose response curve of the hemolytic activity of
warnericin RK on human erythrocytes. Hemolytic activity
on human erythrocytes started at a low concentration of
~0.8 mM, and total hemolysis was obtained at a concentration
of 200 mM. This concentration was used in the osmotic
protection experiments. Such experiments are based on the
fact that incubation of the human erythrocytes with the
peptide may cause channels of a given size. This allows
the rapid exchange of solutes across the membrane, and since
1
Conductance (nS)
½AQ8
RK-induced membrane conductance, as Fig. 3 clearly indicates. Up to ~60 mV, a linear current-voltage relationship
was observed when warnericin RK was added to either one
or both sides of neutral DPPC/n-decane membranes. At higher
transmembrane voltage, the membranes became unstable and
broke; therefore, it is not clear whether higher voltages influenced warnericin RK-induced membrane conductance.
Since warnericin RK permeabilized the model membranes,
we tested whether warnericin RK could also permeabilize
Legionella cells. The Baclight kit was used to assess the
permeability of L. pneumophila. This kit employs two nucleic
acid fluorochromes: the green-fluorescent SYTO 9 and the
red-fluorescent PI. SYTO 9 labels every bacteria, whereas
PI penetrates only bacteria with damaged membranes.
L. pneumophila were treated for 45 min with various warnericin RK concentrations, stained with the Baclight kit, and
analyzed by flow cytometry. The results show that PI penetrated treated cells, suggesting permeabilization (Fig. 4).
Furthermore, the number of permeabilized (i.e., PI-positive)
cells increased with warnericin RK concentrations. The
concentrations necessary to induce permeabilization of both
Legionella and artificial membranes are in the micromolar
range. Thus, warnericin RK is rather efficient as compared
to other AMPs whose MICs range from 0.3 to 50 mM (28).
0.5
0
5
10
15
20
25
Time (min)
0.5
1
Biophysical Journal 97(7) 1–8
BPJ 959
FIGURE 3 Current-voltage dependence of warnericin
RK in multichannel experiments. Warnericin RK was
added in a concentration of 0.4 mM to the 1 M KCl solution
bathing a black DPPC/n-decane membrane. Then, 20 min
after the addition of the peptide, most of the conductance
increase was over and voltages of positive and negative
sign were applied to the membrane (T ¼ 20 C). Note
that a linear current voltage curve was obtained in the
experiments, indicating that the warnericin RK-induced
conductance was not voltage-dependent.
Please cite this article in press as: Verdon et al., Detergent-Like Activity and a-Helical Structure of Warnericin RK, an Anti-Legionella Peptide, Biophysical Journal (2009), doi:10.1016/j.bpj.2009.06.053
Activity and Structure of Warnericin RK
5
100
A
100
60
80
Hemolysis (%)
PI positive bacteria (%)
80
120
40
60
40
20
20
0
0
0.6
1.2
2.5
5
0
10
0
Warnericin RK concentration (μM)
the colloid osmotic pressure is no longer balanced, the cells
will swell and lyse. Nonpermeating molecules are able to
balance the osmotic pressure and thereby protect the cells
from lysis. In contrast, molecules that permeate the channels
do not balance the osmotic stress, which leads to cell lysis.
Human erythrocytes were suspended either in saline solution
or in saline solution supplemented with 30 mM PEGs of
different molecular masses. The cells were incubated with
200 mM warnericin RK for 30 min and then centrifuged
for 1 min. Finally, OD543 was measured in the supernatant.
PEGs 200–4000 (3.54 nm) were not able to protect human
erythrocytes from lysis (Fig. 5 B). Only partial protection
was obtained at higher molecular masses of PEG, ranging
from 4000 to 10,000 Da (corresponding to diameters of
3.54–5.70 nm). This result suggests that warnericin RK did
not form pores with defined sizes.
Detergent sensitivity
Given the previous results and the similarity between warnericin RK and d-lysin, we hypothesized that warnericin RK
might have a detergent-like mode of action. If this were
true, Legionella should be particularly sensitive to detergents
compared to other bacteria, which would explain why warnericin RK is specifically active against the Legionella genus. To
test this hypothesis, we assessed L. pneumophila’s sensitivity
to various detergents (SDS (ionic), Tween 20 (nonionic),
Tween 80 (nonionic), CHAPS (zwitterionic), and Triton
X-100 (nonionic)). Their MIC was measured for several
Gram-negative and Gram-positive bacteria. The results
show that the two strains of Legionella were highly sensitive
to detergents as compared to the other bacteria (Table 1). Depending on the detergent used, Legionella were 10-fold
(CHAPS) to >1000-fold (Tween and Triton X-100) more
100
150
200
250
Warnericin RK concentration (μM)
B
120
100
Hemolysis (%)
FIGURE 4 Membrane permeabilization of L. pneumophila by warnericin
RK. A flow cytometry assay of L. pneumophila membrane permeabilization
by warnericin RK is shown. Exponential cells (106 CFU/mL) were incubated at various warnericin RK concentrations for 45 min at 37 C. Cells
were stained with the Baclight kit (SYTO 9 and PI) and analyzed by flow
cytometry. PI penetrates in membrane-damaged cells. A total of 50,000
events were recorded for each sample. Results represent the mean of three
independent experiments.
50
80
60
40
20
0
0
2000
4000
6000
8000
10000
12000
PEG (MW)
FIGURE 5 Osmotic-protection analyses with warnericin RK shown as
a function of the molecular mass of the PEGs. (A) Hemolysis as a function
of warnericin RK concentration was first established to determine which
concentration corresponded to 100% hemolysis. (B) This concentration
(i.e., 200 mM) was used in the osmotic-protection assays. Hemolytic activity
was measured as OD543 relative to total lysis of the erythrocytes in 0.1%
Triton X-100, which was set to 100%. Human erythrocytes were incubated
with the peptide at 37 C in saline solution (control) or in saline solution supplemented with 30 mM of PEGs of different molecular masses (PEG 200,
400, 600, 1000, 2000, 4000, 6000, 8000, and 10,000) for 30 min. Data
are the means 5 standard deviations of two independent experiments.
sensitive than other bacteria. Bacillus megaterium displays
an intermediate phenotype because this strain is more sensitive to SDS and Triton X-100 than most bacteria. Of interest,
it has been shown that warnericin RK has a slight activity
against this B. megaterium strain (9). Taken together, these
results indicate that there is a strong correlation between warnericin RK and detergent sensitivity, suggesting that warnericin RK could have a detergent-like mode of action.
Structure of warnericin RK
Since warnericin RK and d-lysin share similar activity, we
investigated the structure of warnericin RK by CD and
NMR spectroscopy to compare it with the known structure
of d-lysin (29,30). CD spectroscopy suggested that the peptide did not have a defined secondary structure in aqueous
solution (Fig. 6 A). In a membrane-like environment,
Biophysical Journal 97(7) 1–8
BPJ 959
Please cite this article in press as: Verdon et al., Detergent-Like Activity and a-Helical Structure of Warnericin RK, an Anti-Legionella Peptide, Biophysical Journal (2009), doi:10.1016/j.bpj.2009.06.053
6
Verdon et al.
strongly affected the NMR relaxation times. In the presence
of a 10-fold excess of DMPC, the resonance lines of the
peptide were extremely broadened (Fig. S1). In all of the 2D
spectra, only weak diagonal peaks and no cross peaks were
observed. These observations suggest that molecular tumbling
of the peptide was severely restricted by binding to the large
DMPC vesicles. In contrast, warnericin RK in 8% TFE
showed sharp resonance lines, allowing for the acquisition
of well-resolved 2D NMR spectra. From the NOESY spectra,
238 cross peaks were identified and used for the structure
calculation, which revealed a well-defined a-helix extending
from residue 4 to residue 16 (Fig. 7 A and Table 2). The helix
showed a pronounced amphiphilic character (Fig. 7 B), suggesting that the peptide is embedded in the membrane with
its hydrophobic side. Other structural details, such as the exact
length of the helix or the curvature, were not further investigated, since these depend on the actual environment and
may vary slightly in different model systems. The common
and important structural feature is amphiphilicity, which
renders the peptide capable of destabilizing membranes.
DISCUSSION
FIGURE 6 CD spectroscopy of warnericin RK. (A) CD spectra of pure
warnericin RK (solid line), with 8% TFE (dashed-dotted line) and in the
presence of DMPC (1:2.5, dashed line; 1:10, dotted line). (B) Content of
secondary structure as derived from the CD spectra. Black bars: helical;
dark gray bars: extended conformation; light gray bars: turn; empty bars:
random coil.
mimicked by addition of DMPC vesicles, a defined a-helical
secondary structure was formed. At an equimolar concentration of DMPC, a >50% helical content was found, which
increased only slightly for higher DMPC concentrations up
to a 10-fold excess. A similar CD spectrum indicating
a nearly identical secondary structure was observed for the
peptide in the presence of 8% TFE (Fig. 6 B). Thus we
concluded that, similarly to DMPC, 8% TFE mimics the
membrane environment and is suitable for investigating the
peptide structure.
The results obtained from CD spectra were well confirmed
by NMR spectroscopy. Warnericin RK in aqueous solution
displayed broadened resonance lines in 1D NMR spectra
(see Fig. S1 in the Supporting Material). Only a few cross
peaks were observed in the 2D spectra, suggesting that the
peptide was subjected to fast structural dynamics, which
Biophysical Journal 97(7) 1–8
BPJ 959
Warnericin RK is an AMP that is produced by S. warneri
RK, acts specifically on the Legionella genus, and possesses
hemolytic activity (9). The S. warneri RK strain also
produces two d-lysins that display anti-Legionella and hemolytic activities. To understand the specificity against Legionella, we decided to study the structure and function of
warnericin RK. Planar lipid bilayer studies with warnericin
RK indicated that the peptide interacts with model lipid
membranes, suggesting that this peptide is membrane active.
At low concentration (0.4 mM), warnericin RK increased
conductance of a black lipid membrane, whereas at high
concentration (>2 mM) the peptide induced membrane
disruption. Similar observations were reported previously
for d-lysin, which induces permeabilization in the concentration range of 0.1–2 mM (31). The conductance ranges from
100 to 900 pS with warnericin RK and from 70 to 450 pS
with d-lysin (31). In contrast to measurements with other ½AQ10
AMPs, such as the lantibiotics or the defensins with high
cationic charge densities, which need high transmembrane
voltages for membrane activity (4,25,26), warnericin RK is
active with lipid bilayer membranes at a relatively low
voltage. d-Lysin also shows a voltage-independent activity
when the voltage is maintained below 60 mV, suggesting
that both warnericin RK and d-lysin permeabilize the membrane even in the absence of an applied potential. Membrane
activity at low transmembrane potentials is most likely also
the reason for lysis of erythrocytes by warnericin RK. Nevertheless, the conductance events observed for warnericin RK
varied widely in magnitude and duration of existence, similarly to other AMPs. Warnericin RK displayed a cation
selectivity (permeability ratio: 2.5) that has also been observed for d-lysin (31,32). Altogether, the results from the
Please cite this article in press as: Verdon et al., Detergent-Like Activity and a-Helical Structure of Warnericin RK, an Anti-Legionella Peptide, Biophysical Journal (2009), doi:10.1016/j.bpj.2009.06.053
Activity and Structure of Warnericin RK
7
Web 3C
FIGURE 7 Structural model of warnericin RK in a
membrane-like environment. (A) Superposition of the 10
lowest-energy structures calculated from the NMR data
acquired in the presence of 8% TFE. (B) Helix wheel representation shows the amphiphilic character of warnericin
RK residues 4–16 (left) and d-lysin residues 2–21 (right).
Hydrophobicity according to the color bar (charged residues are colored blue). Symbols: circles, hydrophilic;
diamonds, hydrophobic; triangles, negatively charged;
½AQ16
pentagons, positively charged.
½AQ11
conductance experiments with warnericin RK were similar
to the previous observations made with d-lysin.
In addition to the interaction with model membranes, we
studied the effect of warnericin RK on L. pneumophila using
a fluorochrome (PI) that penetrates membrane-damaged bacteria. The results clearly demonstrate that warnericin RK
rapidly permeabilized these bacteria in a concentration-dependent manner. Moreover, warnericin RK permeabilized black
lipid membrane and bacteria in a similar concentration range,
whereas hemolysis required a higher concentration. It has
been suggested that, with d-lysin, a low concentration induces
channel formation and a high concentration induces hemoTABLE 2 NOE statistics and average root mean-square
deviation (RMSD) in angstroms from the average structure
for the 20 lowest-energy structures
Distance restraints from 238 NOEs
Intraresidual
Sequential
Medium range
127
70
41
NOE violations
> 0.5 Å
> 0.3 Å
> 0.1 Å
0
0.2 5 0.5
1.3 5 1.3
RMSD values in angstroms
All backbone atoms
All heavy atoms
Backbone atoms residues 4–16
Heavy atoms residues 4–16
3.9 5 0.9
4.0 5 0.9
0.6 5 0.3
1.3 5 0.3
lysis (32). At high concentration, d-lysin seems to induce
a detergent-like solubilization of the membrane (7). This
hypothesis is consistent with our results regarding osmotic
protection with warnericin RK. Indeed, a high peptide concentration was used and the erythrocytes were not fully protected
by PEG, even with the highest molecular mass (PEG 10,000).
These results indicate that, at this concentration, warnericin
RK forms large channels of various sizes, in a manner similar
to the action of detergents. This means that warnericin RK
likely has a detergent-like mode of action. The peptides selfassociate and transiently destabilize the membrane. At higher
concentrations, this destabilization can lead to cell lysis.
Furthermore, we found that Legionella is more sensitive to
detergent (by 10- to 1000-fold) compared to other genera,
which is fully consistent with a putative detergent-like
mode of action for warnericin RK. Consequently, we conclude that Legionella is highly sensitive to warnericin RK,
because these bacteria are highly sensitive to detergents in
general. A feature of membrane composition may explain
this high sensitivity of Legionella as compared to other
bacteria. It has been reported that L. pneumophila membrane
is rich in branched-chain fatty acids (33). Furthermore,
d-lysin activity is dependent of the phospholipid acyl chain
structure or elastic properties of the membrane (19). Thus,
a possible explanation is that a high rate of branched-chain
fatty acids modifies the elastic properties of the membrane
and thereby increases the sensitivity to warnercin RK.
The destabilizing mode of action of warnericin RK is
further corroborated by our structural data. The central part
Biophysical Journal 97(7) 1–8
BPJ 959
Please cite this article in press as: Verdon et al., Detergent-Like Activity and a-Helical Structure of Warnericin RK, an Anti-Legionella Peptide, Biophysical Journal (2009), doi:10.1016/j.bpj.2009.06.053
8
Verdon et al.
of the peptide forms a nearly perfect amphiphilic helix, as also
observed for d-lysin (29) (Fig. 7 B). In contrast to d-lysin,
however, warnericin RK is four residues shorter and does
not form an extended helix over its full length. Therefore,
the structural data suggest that the peptide interacts with the
membrane in a detergent-like manner, rather than forming
well-defined, pore-forming multimers. However, spectroscopic methods require micro- and millimolar concentrations,
and therefore do not exclude channel formation in the submicromolar range as observed in the conductivity measurements.
In conclusion, we have provided ample evidence that warnericin RK acts as a specific anti-Legionella AMP by permeabilizing the bacterial membrane. The high specificity
and activity against Legionella results on the one hand
from the detergent-like mode of action of the peptide, and
on the other hand from the particular detergent-sensitivity
of this pathogen. Warnericin RK is therefore a promising
candidate for a novel specific drug against Legionella.
½AQ12
SUPPORTING MATERIAL
A figure is available at http://www.biophysj.org/biophysj/supplemental/
S0006-3495(09)01281-8.
We thank Prof. Franck Morel (University of Poitiers) for technical assistance
with the flow cytometry, Prof. Paul Rösch (University of Bayreuth) for
access to his NMR spectrometers, and Jean-Marc Berjeaud and Christian Lacombe (University of Poitiers) for fruitful scientific discussions.
½AQ13
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This work was supported by grants from the AFSSET (ARCL-2005-005 to
Y.H.), the Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB630 projects B1 to M.S.,
and C2 to C.F.), and the Fonds der Chemischen Industrie (to R.B.). J.V. was
supported by a grant from the French Minister of Research.
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II.2
Résultats complémentaires
II.2.1
Relation entre perméabilisation et viabilité
Les résultats obtenus dans la publication 3 ou avec les cellules eucaryotes (Chapitre I
des résultats) montrent que la cytométrie en flux, couplée aux fluorochromes du kit
Baclight™, est une technique qui permet l’évaluation de l’activité de perméabilisation de la
warnéricine RK. Une étude fait référence à l’utilisation de ce kit en cytométrie en flux afin
d’évaluer l’activité bactéricide de divers agents (Berney et al., 2007). Les auteurs ont
notamment utilisé ce marquage pour obtenir des profils caractéristiques de divers genres
bactériens après traitement aux UV. Cependant, aucune comparaison entre perméabilisation et
viabilité n’est faite. Une autre étude s’est intéressée à la détermination de l’intégrité
membranaire, avec le kit Baclight™, de cellules de L. pneumophila traitées ou non au chlore
(Chang et al., 2009). Là encore, les auteurs ne se sont pas intéressés à la viabilité des cellules
après traitement.
Dans notre étude, nous avons voulu savoir si les cellules perméabilisées (IP+) par la
warnéricine RK étaient encore cultivables sur gélose ou non. De plus, comme montré dans la
publication 2, les cellules en phase exponentielle de croissance sont plus sensibles à l’action
de la warnéricine RK que les cellules en phase stationnaire. L’expérimentation a donc été
réalisée sur des cellules de L. pneumophila en phase exponentielle et stationnaire de
croissance afin de vérifier si la phase de croissance pouvait influer sur le marquage ou sur la
viabilité cellulaire. Les cellules de L. pneumophila Lens sont récupérées en phase
exponentielle (DO600 comprise entre 0,3 et 0,6) et en phase stationnaire de croissance (DO600
supérieure à 3) et sont ajustées à 106 UFC/ml avant le traitement. Les échantillons sont
incubés avec différentes concentrations de warnéricine RK pendant 45 minutes. Une partie de
la population est marquée par les cytochromes SYTO9 et IP pendant 15 minutes. Les cellules
marquées sont ensuite analysées par cytométrie en flux tandis que les cellules non marquées
sont étalées sur gélose pour dénombrement. Les résultats sont présentés dans la Figure 32.
Caractérisation et mode d’action de la warnéricine RK, un peptide anti-Legionella
129
A
120
Cellules S9+/ IP- (%)
100
y = 0,0002x + 0,8788
R² = 0,9961
80
60
40
20
0
0,0E+00
1,0E+05
2,0E+05
3,0E+05
4,0E+05
5,0E+05
UFC/ml
B
Cellules S9+/IP- (%)
120
y = 8E-05x - 3,8743
R² = 0,9766
100
80
60
40
20
0
0,0E+00
3,0E+05
6,0E+05
9,0E+05
1,2E+06
1,5E+06
UFC/ml
Figure 32 : Corrélation entre le pourcentage de cellules IP- et le nombre d’UFC/ml. L.
pneumophila Lens traitée en phase exponentielle de croissance (A). L. pneumophila traitée en
phase stationnaire de croissance (B). La gamme de concentration de warnéricine RK choisie
est comprise entre 0,6 µM et 10 µM. L’expérience est représentative de deux expériences
réalisées.
Les résultats obtenus montrent qu’il existe une forte corrélation entre le nombre de
cellules IP- (non perméabilisées) et le nombre d’UFC/ml déterminé après comptage sur
gélose. Cette corrélation est valable aussi bien après traitement des bactéries en phase
exponentielle de croissance qu’en phase stationnaire de croissance (Figure 32A et B). Ainsi,
le pourcentage de cellules IP- est une bonne approximation du nombre de bactéries viables.
Caractérisation et mode d’action de la warnéricine RK, un peptide anti-Legionella
130
Les bactéries IP+ sont des bactéries mortes qui ont été perméabilisées par la
warnéricine RK. Cependant, on ne peut pas savoir si la mort cellulaire est un effet direct de la
perméabilisation où si elle est la résultante de plusieures mécanismes d’action dont la
perméabilisation. En effet, l’observation en cytométrie en flux ou en dénombrement sur
gélose est réalisée après 1 heure de temps de contact entre les bactéries et la warnéricine RK.
Il faudrait refaire la même expérience sur des temps très courts pour voir si la
perméabilisation de la membrane est toujours corrélée à la mort cellulaire.
II.2.2
Activité inhibitrice de la mélittine
La mélittine est un peptide antimicrobien (26 aa) de 2846 Da produit par l’abeille de
miel européenne, Apis mellifera (Habermann, 1972). Il agirait, à l’image de la δ-hémolysine,
selon un mécanisme d’action detergent like (Bechinger & Lohner, 2006) puisqu’à haut ratio
P/L, des particules discoïdales sont retrouvées dans le milieu (Dufourcq et al., 1986; Lafleur
et al., 1987; Monette & Lafleur, 1995). Cependant, δ-hémolysine et mélittine possèdent des
activités biologiques différentes. En effet, la mélittine possède une activité antimicrobienne à
large spectre, agissant à la fois sur les bactéries à Gram positif et négatif, ainsi qu’une activité
hémolytique (Raghuraman & Chattopadhyay, 2007) tandis que la toxine de Staphylococcus
possède une activité hémolytique et une faible activité antimicrobienne exceptée contre les
bactéries du genre Legionella (voir publication 2).
Nous avons voulu savoir si Legionella était particulièrement sensible à l’action de la
mélittine et si oui, dans quelle gamme de concentration. Pour ce faire, un test de CMI a été
mis en place en utilisant huit espèces bactériennes comprenant des bactéries à Gram positif et
à Gram négatif différentes. Les résultats sont présentés dans le Tableau 9.
Caractérisation et mode d’action de la warnéricine RK, un peptide anti-Legionella
131
Tableau 9 : Activité inhibitrice de la mélittine. Les bactéries cibles ont été cultivées en
milieu BHI ou BYE selon leur genre et ajustées à 106 UFC/ml. La gamme de concentration de
mélittine choisie est comprise entre 0,1 µM et 17,6 µM. Les résultats obtenus correspondent à
la CMI après 24 heures ou 96 heures de croissance à 37°C selon le genre bactérien. n=3
Souche
CMI (µM)
B. megaterium F04
1,1
E. coli MG1655
11,7
L. longbeachae ATCC 33484
0,9
L. pneumophila Lens CIP 108286
0,5
L. monocytogenes EGDe
1,5
S. aureus 971
4,4
S. typhimurium
> 17,6
S. warneri RK
7,3
La mélittine est active contre toutes les bactéries testées, excepté Salmonella
typhimurium (CMI > 17,6 µM). Les bactéries du genre Legionella présentent une sensibilité
élevée ainsi que B. megaterium (CMI ≤ 1 µM). Listeria monocytogenes est également très
sensible à la mélittine (CMI = 1,5 µM).
De façon intéressante, la mélittine agit contre les bactéries du genre Legionella dans la
même gamme de concentration que la warnéricine RK et la δ-hémolysine I. Elle possède
cependant un spectre d’activité plus large que ces deux dernières, confirmant ainsi les
données publiées dans la littérature (Boman et al., 1989; Dhople & Nagaraj, 1993). La
warnéricine RK et la δ-hémolysine I ne possèderaient pas le même mécanisme d’action que la
mélittine puisque leur spectre d’activité est restreint aux Legionella et quelques Bacillus.
II.2.3
Action de la warnéricine RK et de la δ-hémolysine I sur des cellules
adhérées
La warnéricine RK est très active contre les Legionella présentes en suspension
(planctoniques) mais dans l’environnement, les Legionella sont majoritairement retrouvées
adhérées à une surface (sessiles) par exemple, au sein des biofilms (Lau & Ashbolt, 2009).
Afin de déterminer l’activité de la warnéricine RK sur des Legionella sessiles, un test
d’activité du peptide contre des cellules adhérées à un support a été mis en place. Une culture
de L. pneumophila Lens GFP(Green fluorescent protein) est réalisée pendant 3 semaines en
Caractérisation et mode d’action de la warnéricine RK, un peptide anti-Legionella
132
microplaque en présence de lamelles de verre. Les lamelles sont ensuite traitées 18 heures
avec 7,8 µM (20 µg/ml) de warnéricine RK observées en microscopie confocale (Figure 33).
A
B
C
D
Figure 33 : Action de la warnéricine RK et de la δ-hémolysine I sur des cellules de L.
pneumophila GFP adhérées. Aucun traitement (A), traitement pendant 18 heures par 7,2 µM
(20 µg/ml) de δ-hémolysine I (B), traitement pendant 18 heures par 7,8 µM de warnéricine
RK (C), traitement pendant 18 heures par 0.1% de SDS (D). La barre représente 10 µm.
Les résultats montrent que le traitement à la warnéricine RK, aussi bien que celui à la
δ-hémolysine I et au SDS, conduit à une chute du nombre de bactéries fluorescentes. La
warnéricine RK possède un effet plus prononcé que la δ-hémolysine I. La chute du nombre de
bactéries adhérées à la lamelle de verre peut être du, soit au détachement des cellules du
support de verre, soit à la lyse des bactéries cibles.
Ainsi, la warnéricine RK possèderait un effet, à concentration équivalente, plus
prononcé sur les cellules de L. pneumophila sessiles que la δ-hémolysine I, effet qui se
Caractérisation et mode d’action de la warnéricine RK, un peptide anti-Legionella
133
rapproche de celui observé avec 0,1% de SDS. La souche de L. pneumophila GFP a été
construite, au laboratoire, par E. Mogoa. Ces résultats vont dans le même sens que ceux qui
montraient une action plus prononcée de la warnéricine RK par rapport à la δ-hémolysine I
sur des cellules de L. pneumophila en phase exponentielle et stationnaire de croissance.
Caractérisation et mode d’action de la warnéricine RK, un peptide anti-Legionella
134
Chapitre III.
Analyse de l’enveloppe de L. pneumophila
Les résultats présentés dans le Chapitre II ont permis de montrer que la warnéricine
RK possède un mécanisme d’action detergent-like et que Legionella est particulièrement
sensible aux détergents. Les détergents sont des molécules amphiphiles qui solubilisent les
membranes en s’insérant dans la bicouche lipidique et en rendant soluble lipides et protéines.
De plus, la warnéricine RK agit sur les érythrocytes, Bacillus et Legionella avec un même
ordre de concentration. Le point commun entre ces trois cibles est la membrane. La structure
des chaînes d’acides gras influet sur l’activité de la δ-hémolysine (Pokorny et al., 2008). Nous
avons alors émis l’hypothèse que les Legionella sont particulièrement sensibles à la
warnéricine RK parce qu’elles possèdent une membrane particulière.
Dans le but de comprendre cette forte sensibilité de Legionella aux détergents, nous
avons donc étudié l’enveloppe de Legionella et plus particulièrement les lipides
membranaires.
Dans un premier temps, les acides gras ont été analysés en comparant L. pneumophila
en phase exponentielle et en phase stationnaire de croissance puisque la bactérie présente une
différence de sensibilité selon son état physiologique. Dans un second temps, un mutant,
résistant à l’action de la warnéricine RK, a été recherché et sa résistance a été étudiée par
analyse des acides gras et analyse de l’expression des gènes. Une partie des résultats est
présentée dans la publication 4.
III.1
Publication 4 : Fatty acid composition relationships with resistance
to warnericin RK, an anti-Legionella peptide
Avertissement : La publication 4 présentée correspond à une version en préparation.
Cependant, l’analyse des résultats de l’expression des gènes n’a pu être finalisée et la
discussion des résultats sera renforcée.
Résumé : La warnéricine RK est un peptide cationique qui se structure en hélice α
amphiphile au contact des membranes. Il agirait selon un mécanisme d’action detergent-like à
l’image de la δ-hémolysine, dont l’activité est grandement influencée par la structure des
acides gras membranaires. La warnéricine RK perméabilise la membrane bactérienne de
Legionella ce qui en résulte la mort de la cellule. La membrane est le point commun entre les
Caractérisation et mode d’action de la warnéricine RK, un peptide anti-Legionella
135
différentes cibles de la warnéricine RK à savoir, les érythrocytes, Bacillus et Legionella. Nous
avons alors analysé les acides gras de L. pneumophila et étudié la sensibilité de la bactérie à la
warnéricine RK. Puisque L. pneumophila Lens est plus résistante à la warnéricine RK en
phase stationnaire de croissance qu’en phase exponentielle de croissance, nous avons effectué
les analyses dans les deux conditions à chaque fois. L’analyse des acides gras par GC-MS
montre que le taux d’acides gras branchés augmente d’un facteur trois et que le taux d’acides
gras à chaîne courte augmente d’un facteur 2 en phase stationnaire. Ces paramètres sont
impliqués notamment dans la fluidité membranaire ce qui pourrait influer sur la sensibilité de
Legionella à la warnéricine RK. Une modulation de la composition en acides gras a été
recherchée en cultivant les bactéries à différentes températures. L. pneumophila apparait aussi
sensible à la warnéricine RK en phase exponentielle (IP50 de 0,6 µM) ou stationnaire (IP50
entre 2,5 et 5 µM) de croissance et ce, quelque soit la température entre 20°C et 37°C.
Cependant, les températures de croissance choisies semblent n’avoir que peu d’influence sur
la composition en acides gras de Legionella.
Dans un second temps, des mutants de L. pneumophila résistants à l’action de la
warnéricine RK ont été recherchés. Des résistants ayant la capacité de se développer en
présence de 20 µM de warnéricine RK (32 fois la CMI de la souche sauvage) ont été obtenus
par pression de sélection. Cependant, ces résistants réversent en absence de warnéricine RK et
deviennent aussi sensibles que la bactérie sauvage. Il semble que ces résistants soient adaptés
à l’action de la warnéricine RK plutôt que mutés dans un gène.
L’analyse des acides gras chez la souche sauvage et la souche adaptée montrent que
dans le même état physiologique, le taux d’acides gras branchés et à chaine courte augmentent
d’un facteur 2 environ chez la souche adaptée. Ces résultats sont similaires à ceux obtenus
lors du passage de la phase exponentielle à la phase stationnaire de croissance. Une analyse de
l’expression des gènes des deux souches bactériennes a permis, notamment, de mettre en
évidence, chez la souche adaptée, des gènes potentiellement impliqués dans la biosynthèse
des acides gras.
La composition en acides gras branchés de L. pneumophila pourrait donc être un
facteur influançant sa sensibilité à la warnéricine RK.
Caractérisation et mode d’action de la warnéricine RK, un peptide anti-Legionella
136
PUBLICATION 4
Fatty acid composition relationships with resistance to
warnericin RK, an anti-Legionella peptide
En préparation
Caractérisation et mode d’action de la warnéricine RK, un peptide anti-Legionella
137
Caractérisation et mode d’action de la warnéricine RK, un peptide anti-Legionella
138
Fatty acid composition relationships with resistance to warnericin RK, an antiLegionella peptide
Julien Verdon†, Jérome Labanowski†, Tobias Sahr‡, Thierry Ferreira§, Christian
Lacombe†, Carmen Buchrieser‡, Jean-Marc Berjeaud† and Yann Héchard†*
†Laboratoire
de Chimie et Microbiologie de l'Eau, UMR CNRS 6008, Université de Poitiers,
40 avenue du recteur Pineau, 86022 Poitiers, France
‡
Unité de Génomique des Microorganismes Pathogènes CNRS URA 2171, Institut Pasteur,
Paris, France
§
FRE CNRS 3091 Physiologie moléculaire du Transport des Sucres, Université de Poitiers,
France
Keywords : antimicrobial peptide, bacteria, membrane, lipids, branched chain fatty acids
* Corresponding author: Tél +33 5 49 45 40 07; Fax +33 5 49 45 35 03; E-mail
[email protected]
INTRODUCTION
Antimicrobial peptides (AMPs) are procuced by many organisms; they are part of innate
immunity in vertebrates [1] and are also produced by microorganisms to struggle against
others. AMPs are often cationic and hydrophobic [2, 3] that act by either disrupting
membrane integrity, leading to permeabilization and disruption or translocate across the
membrane and act on internal targets [4, 5].
Warnericin RK is a unique antimicrobial peptide produced by a Staphylococcus warneri strain
that possess a spectrum of activity restricted to the Legionella genus and some Bacillus strains
[6]. Warnericin RK was co-purified with δ-hemolysins, which are well known hemolytic
amphiphilic α-helical peptides. We have previously shown that warnericin RK and δhemolysin shared the same spectrum of antimicrobial activity and an hemolytic activity [6].
δ-hemolysin mode of action has been extensively studied (for a review see [7]), This
amphiphilic α-helical peptide leads to permeabilization or cell lysis depending on the peptide
to lipid ratio [8]. However, some membrane features particularly influence the interaction
with δ-hemolysin, such as the presence of liquid-disordered domains, phospholipid acyl chain
structure or elastic properties [9-11]. It has been proposed that δ-hemolysin acts by a
detergent-like mechanism [12]. In this model, AMPs accumulate onto the bilayer surface until
a threshold concentration is reached, leading to membrane disruption [13-15]. Warnericin RK
was recently shown to permeabilize membranes in a detergent-like manner, similarly to δhemolysin [16], reinforcing the idea that both peptides have the same mode of action.
Thus, we assume that Legionella should have a specific feature in the membrane, explaining
its high sensitivity to those peptides. In the literature, it has been reported that the membrane
of L. pneumophila displays two remarkable features: a high amount of phosphatidylcholine
(PC) [17-19] and a high amount of branched-chain fatty acids (BCFA) [20-23]. PC, also
called lecithin, is a phospholipid mainly found in eukaryotic cells. Most of the prokaryotes
lack it, however PC is found in high quantities in some bacteria [24, 25]. BCFA are common
components of Gram positive bacteria but often lack in Gram negative bacteria. Indeed, only
ten bacterial genera of Gram negative bacteria were listed as possessing this peculiarity
including Legionella, Flavobacterium, Bacteroides and Desulfovibrio [26]. A study on 23
Legionella species showed that the quantity of BCFA ranged from 39% for L. oakridgensis to
90% for L. jordanis with an average rate of 64 % for L. pneumophila [22]. As elasticity and
fatty acid composition is important for δ-hemolysin activity, we would like to address the role
of fatty acid in the sensitivity to warnericin RK.
In this study, we analyzed the relationship between fatty acids composition and sensitivity of
the wild type strain and an adapted resistant strain, grown in various conditions.
MATERIALS AND METHODS
Bacterial strain, growth media, and chemicals. Legionella strains were routinely cultured
in buffered yeast extract (BYE) broth on buffered charcoal yeast extract (BCYE) agar plates
for 4 days. Non-legionellae bacteria were grown on brain heart infusion (BHI) agar plates.
Growth was performed at 37°C for 24 to 96 h depending on the organism. Broth media was
shaken (150 rpm) during growth. Synthetic warnericin RK was purchased from GenScript
Corporation (Piscataway, USA). Chemicals were purchased from Sigma-Aldrich (St. Louis,
MO).
Selection pressure experiment. A fresh culture of L. pneumophila, at a final concentration of
106 cells/ml, was incubated with non-inhibitory concentrations of warnericin RK. Bacteria
were transferred every 4 days by inoculating 10 µl of stationary phase culture to 1 ml BYE.
The concentration of warnericin RK was doubled at each transfer.
RNA isolation and cDNA synthesis. Exponentially (OD600= 0.3–0.5) and stationary (OD600
> 2) bacteria cells were centrifuged (10000 x g, 10 min, 4°C). The pellets were flash frozen on
dry ice–ethanol and stored at -80°C.
For extraction, cells were resuspended by pipetting in 500 ml of resuspension buffer (12.5
mM Tris pH 7.6, 5 mM EDTA). Then, 500 µl of acid phenol (pH 4.5-5) and 0.4 g of glass
beads (0.2-0.3 mm diameter; Sigma-Aldrich) were added. The cells were sheared
mechanically using a Fastprep apparatus (Bio101). After centrifugation (12000 x g, 5 min) at
ambient temperature, the supernatant was transferred to a fresh tube, and 1 ml of Trizol
reagent (Gibco BRL) was added. Samples were incubated for 10 min at room temperature.
Total RNA was extracted twice with chloroform and precipitated in 0.7 volumes of
isopropanol. After a washing step with 75% ethanol, the RNA pellet was dissolved in sterile
RNase-free water and quantified by absorbance at A260. Purity and integrity of RNA were
controlled on 1% agarose gels, and RNA was stored at -80°C until use.
Total RNA (2 x 20 µg) was used for cDNA synthesis with Superscript indirect cDNA kit
(Invitrogen) and labelled with Cy5 or Cy3 (Amersham Biosciences) according to the
supplier’s instructions.
Array hybridization and data analysis. Hybridizations were performed using 250 pmol
Cy3- and Cy5-labelled cDNA following the manufacturer’s recommendations (Corning) and
using slides described by Brüggemann et al. [27]. The cDNA of each cell sample was
compared to the other using two distinct hybridizations on slides, including a dye-swap. In
addition, a biological replicate was carried out giving a total of 4 slides for the overall
experiment. Slides were scanned on a GenePix 4000A scanner (Axon Instruments). Laser
power and/or photomultiplier tubes (PMT) were adjusted to balance the two channels. The
resulting files were analysed using Genepix Pro 4.0 software. Spots were excluded from
analysis in cases of high local background fluorescence, slide abnormalities, or weak
intensity. Empty and flagged spots were excluded, and only genes with no missing values
were analysed. Data normalization and differential analysis were conducted using the R
software (http://www.r-project.org). No background subtraction was performed, but a careful
graphical examination of all the slides was conducted to ensure a homogeneous, low-level
background in both channels. Aloess normalization [28] was performed on a slide-by- slide
basis
(BioConductor
package
marray;
http://www.
bioconductor.org/packages/
devel/bioc/html/marray.html). Differential analysis was carried out separately for each
comparison between two time points, using the VM method (VarMixt package;[29]), together
with the Benjamini and Yekutieli [30] P-value adjustment method. If not stated otherwise,
only differently expressed genes with twofold changes were taken into consideration. Empty
and flagged spots were excluded from the data set, and only genes with no missing values for
the comparison of interest were analyzed.
Lipid analysis. Lipids extracts were prepared from approximately 4 x 109 bacteria cells. Cells
were centrifuged at ambient temperature (10000 x g, 5 min). The pellet was suspended in 1 ml
of distilled water. Cells were broken by vortexing with 500 mg of glass beads (diameter 150200 µm; Sigma) for 1 min. The supernatant was transferred in tube and the pellet was
suspended again in distillet water. The operation was repeated twice. Total cellular lipids were
extracted using chloroform:methanol (2:1, v/v) as described by Folch et al. [31]. The final
organic phase was evaporated to dryness under a stream of nitrogen and conserved at -20°C.
The phospholipid fatty acids (PLFA) were isolated on extraction columns, packed with
unbonded silica (cusil 156 Clean-up Extraction Columns, 6 mL, Carlo Erba) according to the
method detailed by Keinanen et al.(Keinanen et al., 2002). For that the lipid extract was
applied in dichloromethane (1 mL) on the top of the column, and neutral lipids were eluted
with 5 ml of dichloromethane, glycolipids were eluted with 10 ml of acetone, and
phospholipids were eluted with 5 ml of methanol. The phospholipid fraction was evaporated
to dryness.
PLFA were then converted into Fatty Acid Methyl Esters (FAMEs) by saponification and
methylation, carried out by shaking the samples for 1 hour with 5 mL of 0.2 M alkaline
methanol. The reaction was stopped by addition of 0.33 mL of 1 M acetic acid. FAMEs were
then partitioned into an organic phase by adding 4 mL of hexane. This phase was then
evaporated under a stream of N2. FAMEs were dissolved in 0.5 mL of 1:1 (v/v)
hexane/methyl tert-butyl ether. Analysis was performed by gas chromatography on a HewlettPackard model 5972 GC chromatograph coupled with a mass detector operated in electron
impact mode at 70eV. The chromatograph used a DB5-MS non-polar column (25 m x 0.25
mm, 0.25 μm film thickness) with the injector and detector maintained at 250 and 320°C,
respectively. The column temperature was programmed to start at 50°C for 2 min and then
ramp up at a rate of 8°C min−1 to 200°C, followed by a ramp of 10°C min−1 to 300°C. The
FAMEs peaks were identified by comparing their mass spectra and retention times with those
of standards purchased from Larodan (Larodan Fine Chemicals AB, Malmö, Sweden).
Antibacterial assays. To assess the effect of warnericin RK, 1 ml of bacterial suspension (106
bacteria/ml) was treated with warnericin RK in concentrations ranging from 1.56 to 25 µg/ml
at 37°C. After 45 min, bacteria were stained for 15 min at room temperature with the
membrane integrity sensitive dyes SYTO 9 and PI (LIVE/DEAD BacLight kit, Invitrogen).
Flow cytometric measurements were performed on a FACSCanto™ II flow cytometer (BD
Biosciences, USA) with a 488 nm argon excitation laser. A total of 50000 events were
analyzed in each sample, using BD FACSDiVa 6 software (BD) for data acquisition and
analysis. Optical filters were set up such that PI fluorescence was measured at 670 LP nm and
SYTO 9 fluorescence was measured at 530/30 BP nm. A SYTO 9+/PI- gate was drawn to
determine the percentage of non-permabilized cells in the control. The antimicrobial activity
of warnericin RK was measured as the percentage of permeabilized bacteria with respect to
the untreated control. All experiments were repeated at least three times, and the patterns were
reproducible.
RESULTS AND DISCUSSION
Growth conditions modulate fatty acid composition and sensitivity
To test the hypothesis that sensitivity might be related to fatty acids compostion, we assessed
the sensitivity of L. pneumophila and the fatty acids composition in various conditions. We
have previously reported that stationary phase cells were more resistant to warnericin RK than
exponential ones [6]. Thus, fatty acids of L. pneumophila in both exponential and stationary
phase of growth were analysed together with those of L. pneumophila grown on agar plates as
a control. Indeed, fatty acids analysis has been reported in the latter condition [23]. Lipids
were extracted from the different samples and analyzed by GC-MS. L. pneumophila was
composed to up to 16 different species including unbranched, branched (iso and anteiso),
saturated and unsaturated fatty acids (Figure 1). The composition of bacteria grown on agar
plates were in agreement with those obtained by others groups [20-23]. Bacteria grown to
exponential phase had high amounts of saturated, linear fatty acids (i.e. palmitic acid (C16:0)
and stearic acid (C18:0). In stationary phase, there was a switch from palmitic C16:0 to
isopalmitic acid iC16:0. Also, other branched-chain fatty acids (BCFA) increased such as 12methyl-tetradecanoic acid (aC15:0) and 12-methyl-tridecanoic acid (iC14:0). Besides, there
was a decrease of chain length in stationary phase compared to exponentional phase. The
membrane of stationary growth phase bacteria contained nearly 3 fold more branched and
short chain fatty acids than the membrane of exponential growth phase bacteria (Table 1).
These results indicate that there was an increase of BCFA and SCFA together with an
increase in resistance to warnericin RK.
Growth temperature poorly affected fatty acid composition and sensitivity
As temperature has been shown to influence lipid composition of bacterial membranes [3234], L. pneumophila was grown at various temperatures to assess its sensitivity by
permeabilization assay.
In the exponential phase, L. pneumophila cells display the same sensitivity (PI50 = 0.6 µM) to
warnericin RK whatever the temperature (Figure 2A). In the stationary phase, bacteria were
less sensitive (PI50 = 5 µM) as reported previously (Figure 2B). However, there was poor
modification of the sensitivity with temperature. At 20°C, bacteria were significantly more
resistant with 2.5 and 5 µM. Results showed that a decrease in temperature induces a decrease
in the percentage of C16:0 (Figure 3A and 3B). The BCFA constituted 23.9% to 30.1% of
total fatty acids in exponential cells, unsaturated fatty acids varied between 10.0% and 16.3%
while SCFA between 4.1% and 7.8% (Table 1). In stationary cells, the BCFA constituted
63.7% to 66.1% of total fatty acids in exponential cells, unsaturated fatty acids varied between
8.1% and 12.5% while SCFA between 11.3% and 17.9% (Table 1). Globally, the temperature
of growth had hardly any effect on the fatty acid composition and on sensitivity of L.
pneumophila. A previous study on L. pneumophila fatty acid composition revealed that
branched chain fatty acids decreased in L. pneumophila as the temperature was reduced
towards 24°C while unsaturated fatty acids increased, so as to maintain membrane fluidity at
low growth temperature [35]. However, data were not comparable as the growth medium and
culture conditions could modulate fatty acids composition [23].
Selection of a resistant adapted strain
To further analyze the relationships between sensitivity and fatty acids composition, we were
searching for resistant strains. In a first approach, L. pneumophila mutants were obtained by
transposon mutagenesis. A derivative of Tn903 transposon named Tn903dIIlacZ [36] was
introduced in L. pneumophila Lens by electroporation (efficacy of transformation of 105
CFU/ml) and transformants were selected using 10 µg/ml kanamycin. A total of ~108
transformants were tested but no transformant, displaying increased resistance to warnericin
RK, were isolated (data not shown). In a second approach, L. pneumophila Lens were grown
sequentially in presence of increasing concentrations of warnericin RK. After seven transfers,
we obtained cells able to grow in presence of 40 µM warnericin RK corresponding to 32 fold
the MIC (1.2 µM). To investigate if the selected resistants were genetically modified, clones
able to grow at 20 µM of warnericin RK were transferred into fresh BYE medium without
warnericin RK. After 4 days at 37°C, their MIC was assessed. Surprisingly, these cells were
as sensitive as the WT strain. As the resistance phenotype was not stable, it indicated that
resistant bacteria were not mutated but rather adapted to grow in presence of high
concentration of warnericin RK. In a same way, a nisin resistant L. lactis strain was obtained
by consecutively growing the wild-type strain in the presence of increasing nisin
concentrations in the medium [37]. The resistant strain was 75 times more resistant to nisin
than the WT strain but authors observed a reversal of the resistant strain to WT sensitivity
after overnight growth without nisin. Thus, the L. lactis strain was only adapted to nisin.
The resistant adapted strain had higher amounts of BCFA and SCFA than WT strain
The fatty acid composition of both adapted and wild type strains were compared. In the
membrane of exponential growth phase bacteria, BCFA (aC15:0 and iC16:0) were more
abundant in the adapted strain while C16:0 and C16:1 decreased (Figure 4 and Table 2). A
similar pattern was obtained by comparing both strains in the stationary phase. Also, the
SCFA were two fold more abundant in the adapted strain in both growth phases (Table 2).
The amount of BCFA and SCFA increased in the resistant adapted strain, as it was the case in
stationary phase.
Gene expression analysis
We would like to assess which genes were differentially expressed in the resistant adapted
strain and above all if some of these genes might be related to fatty acid metabolism. In this
aim, both strains were grown to late exponential phase, total RNA has been extracted and
used for cDNA synthesis. The cDNA was labelled and used to hybridyze a DNA
oligonucleotide microarray containing 3,823 gene-specific oligonucleotides [27]. These
probes were designed to match every predicted open reading frame in the three sequenced L.
pneumophila genomes of strains Lens, Paris and Philadelphia [38, 39]. Statistical analyses
selected 470 genes which expression was significantly different between adapted and WT
strains. Among these genes, we focus on those likely involved in fatty acid metabolism, as a
result only 2 genes were selected. Two genes, encoding proteins similar to a fatty acid
desaturase and to a long-chain fatty acid-CoA ligase, were repressed (Table 3). These
enzymes were involved in desaturation and elongation of fatty acid respectively. The
repression of the desaturase was reflected by the decrease of unsaturated fatty acids of the
adapted strain. Also, the repression of the ligase was consistent with the increase in SCFA in
the adapted strain.
In conclusion, the fatty acid compostion was modified (BCFA and SCFA increased) in
bacteria, which were more resistant (i.e. stationary phase and adapted strain). However, it is
not clear whether there is a direct link between these modifications and resistance. Further
experiments should be done to complete the analysis of the membrane composition by
characterizing phospholipids and other molecules that could participate to sensitivity.
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BCYE agar plate
BYE exponential
BYE stationary
50,0
Relative abundance (%)
40,0
30,0
20,0
10,0
0,0
Figure 1. Fatty acid composition of total phospholipids from L. pneumophila. L.
pneumophila was grown in BYE under shaking (150 rpm) in exponential phase (OD600 ~0.40.8) or in stationary phase (OD600 > 3) or on BCYE agar plates. Fatty acid methyl esters were
analyzed by GC/MS. For each fatty acid, numbers to the left refer to the number of carbon
atoms; number to the right refer to the number of double bonds; a, methyl branch at the
anteiso carbon atom; i, methyl branch at the iso carbon atom; Δ, cyclopropane ring structure.
Results represent the mean of three independent experiments ± standard deviation.
37°C
A.
25°C
20°C
B.
25°C
20°C
0.6
1.2
2.5
120
PI positive bacteria (%)
PI positive bacteria (%)
120
37°C
100
80
60
40
20
0
100
80
60
40
20
0
0
0.6
1.2
2.5
5
Warnericin RK concentration (µM)
10
0
5
10
Warnericin RK concentration (µM)
Figure 2. Membrane permeabilization of L. pneumophila by warnericin RK. L.
pneumophila (106 CFU/mL) was grown in BYE under shaking (150 rpm) in exponential
phase (OD600 ~0.4-0.8) or in stationary phase (OD600 > 3) at various temperatures. Bacteria
were incubated with warnericin RK during 45 min at 37°C. Bacteria were stained by the
Baclight kit (SYTO 9 and PI) and analyzed by flow cytometry. PI penetrates in membranedamaged cells. IP50 corresponds to the minimal concentration of warnericin RK that induced
at least 50% of permeabilization. A total of 50000 events were recorded for each samples. (A)
Exponential bacteria. (B) Stationary bacteria. Results represent the mean of two independents
experiments.
A.
37°C exponential
25°C exponential
20°C exponential
50,0
Relative abundance (%)
40,0
30,0
20,0
10,0
0,0
B.
37°C stationary
25°C stationary
20°C stationary
Relative abundance (%)
50
40
30
20
10
0
Figure 3. Fatty acid composition of total phospholipids from L. pneumophila grown at
various temperatures. L. pneumophila was grown in BYE under shaking (150 rpm) in
exponential phase (OD600 ~0.4-0.8) or in stationary phase (OD600 > 3) at various temperatures.
Fatty acid methyl esters were analyzed by GC/MS. For each fatty acid, numbers to the left
refer to the number of carbon atoms; number to the right refer to the number of double bonds;
a, methyl branch at the anteiso carbon atom; i, methyl branch at the iso carbon atom. (A)
Exponential phase bacteria, (B) Stationary phase bacteria. Results represent the mean of two
independent experiments ± standard deviation.
Figure 4
WT exponential
Adapted exponential
WT stationary
Adapted stationary
50,0
Relative abundance (%)
40,0
30,0
20,0
10,0
0,0
Figure 4. Fatty acid composition of total phospholipids from L. pneumophila WT and
adapted strains. Strains of L. pneumophila were grown in BYE in exponential phase (OD600~
0.3-0.5) or in stationary phase (OD600 > 1.5). Fatty acid methyl esters were analyzed by
GC/MS. For each fatty acid, numbers to the left refer to the number of carbon atoms; number
to the right refer to the number of double bonds; a, methyl branch at the anteiso carbon atom;
i, methyl branch at the iso carbon atom. Results represent the mean of three independent
experiments ± standard deviation.
Table 1. Fatty acid families as a function of culture conditions. IP50 corresponds to the
minimal concentration of warnericin RK that induced at least 50% of permeabilization.
Strains
WT
WT
Growth phase
exponential
stationary
Temperature
% branched
% unsaturated
% short chain
IP50
37°C
25.0
10.0
7.8
< 0.6
25°C
23.9
16.3
4.1
< 0.6
20°C
30.1
15.5
7.0
< 0.6
37°C
66.1
8.1
17.9
2.5
25°C
63.7
12.5
11.3
2.5
20°C
64.4
11.4
17.8
5
Table 2. Fatty acid families in WT and adapted strains. IP50 corresponds to the minimal
concentration of warnericin RK that induced at least 50% of permeabilization.
Strains
Growth phase
Temperature
% branched
% unsaturated
% short chain
IP50
WT
exponential
37°C
18.1
29.2
4.3
1.2
Adapted
exponential
37°C
34.2
23.8
8.7
ND
WT
stationary
37°C
29.7
23.3
8.7
10
Adapted
stationary
37°C
47.0
19.8
15.2
ND
Table 3. Genes differentially expressed in adapted strain related to fatty acid
biosynthesis. Microarray experiments were performed on WT and adapted strains. Genes
likely involved in fatty acid biosynthesis were selected.
Gene* lpp0618 lpp1015 Expression Ratio Description* 0.66 Similar to fatty acid desaturase 0.67 Similar to long chain fatty acid CoA ligase (Fab D) *According to the LegioList server (http://genolist.pasteur.fr/LegioList/) III.2
Résultats complémentaires
III.2.1
Activité de perméabilisation de détergents sur la souche adaptée
Les résultats précédents ont montrés que les bactéries du genre Legionella sont très
sensibles aux détergents par rapport à d’autres genres bactériens. De plus, la warnéricine RK
possède un mode d’action de type detergent-like (voir publication 3). L’hypothèse avancée
est que les Legionella sont sensibles à l’action de la warnéricine RK car elles sont très
sensibles aux détergents.
Nous avons voulu comparer la possible résistance aux détergents des bactéries
adaptées à celle des bactéries sauvages en utilisant un test de perméabilisation membranaire.
Pour cela, nous avons utilisé la cytométrie en flux afin de mesurer l’impact des détergents
après une heure de temps de contact sur L. pneumophila. Les cellules adaptées ont été
cultivées en présence de warnéricine RK à 20 µM et diluées au 1/1000ième afin d’atteindre la
concentration de 106 UFC/ml. La quantité de warnéricine RK restante dans le milieu de
culture est donc négligeable. De manière à compléter l’étude menée dans l’article 3, nous
avons également testé l’impact de la phase de croissance sur la résistance aux détergents de L.
pneumophila (Figure 34).
Caractérisation et mode d’action de la warnéricine RK, un peptide anti-Legionella
139
Phase exponentielle
Phase stationnaire
120
A
100
Bactéries IP+ (%)
Bactéries IP+ (%)
100
120
80
60
40
20
B
80
60
40
20
0
0
0
0,001
0,01
0,1
1
0
Concentration en détergent (%)
120
100
80
60
40
20
D
80
60
40
0,001
0,01
0,1
1
0
Concentration en détergent (%)
0,01
0,1
1
120
E
100
Bactéries IP+ (%)
Bactéries IP+ (%)
0,001
Concentration en détergent (%)
120
80
60
40
20
F
80
60
40
20
0
0
0
0,001
0,01
0,1
1
0
Concentration en détergent (%)
0,001
0,01
0,1
1
Concentration en détergent (%)
120
120
H
G
100
Bactéries IP+ (%)
Bactéries IP+ (%)
1
0
0
100
0,1
20
0
100
0,01
120
C
Bactéries IP+ (%)
Bactéries IP+ (%)
100
0,001
Concentration en détergent (%)
80
60
40
20
80
60
40
20
0
0
0
0,001
0,01
0,1
Concentration en détergent (%)
1
0
0,001
0,01
0,1
1
Concentration en détergent (%)
Figure 34 : Perméabilisation induite par différents détergents sur L. pneumpohila Lens
WT et adaptée. Les bactéries cibles ont été cultivées en milieu BYE en présence ou non de
warnéricine RK à 20 µM et ajustée à 106 UFC/ml. La gamme de concentration des détergents
choisie est comprise entre 0,0001% et 1%. L. pneumphila Lens WT exponentielle (DO600
entre 0,3-0,5) ( ), L. pneumphila Lens adaptée exponentielle (DO600 entre 0,3-0,5) ( ), L.
pneumphila Lens WT stationnaire (DO600 > 2) ( ), L. pneumophila Lens adaptée stationnaire
(DO600 > 2) ( ).Tween 20(A) et (B), Triton X-100 (C) et (D), CHAPS (E) et (F), SDS (G) et
(H). Indice IP50(
). n=3
Caractérisation et mode d’action de la warnéricine RK, un peptide anti-Legionella
140
Les souches sauvages et adaptées possèdent le même profil de sensibilité pour un
détergent donné et ce, quelque soit la phase de croissance. Le Tween 20, pourtant très actif
lors des précédents tests de CMI (voir publication 3), possède une faible efficacité de
perméabilisation puisqu’il induit 50% de perméabilisation pour 1% de détergent (Figure 34A,
B). Le Triton X-100 et le SDS sont les détergents les plus efficaces puisqu’ils possèdent les
indices IP50 les plus faibles. En effet, l’indice IP50 du Triton X-100 est compris entre 0,001%
et 0,01% et celui du SDS est de 0,001% (Figure 34C, D, G et H). Le CHAPS, quant à lui,
possède un indice IP50 compris entre 0,1% et 1%. Il possède à peu près la même efficacité de
perméabilisation que le SDS (Figure 34E, F).
La sensibilité de L. pneumophila envers les détergents semble indépendante de la
phase de croissance, contrairement à la sensibilité envers la warnéricine RK qui est plus
prononcée sur L. pneumophila en phase stationnaire de croissance (voir Chapitre I des
résultats). Nous en concluons alors que l’adaptation à la warnéricine RK n’engendre pas de
résistance accrue aux détergents.
III.2.2
Activité hémolytique de la warnéricine RK en présence de
phospholipides
En 1971, Kreger et al. ont étudié l’effet de phospholipides sur l’activité hémolytique
de la δ-hémolysine de S. aureus. Ils ont ainsi montré que des phospholipides inhibaient
l’activité hémolytique de la toxine, notamment la PC et la PS (Kreger et al., 1971). La
warnéricine RK, tout comme la δ-hémolysine, est un peptide qui possède un mode d’action de
type detergent-like ainsi qu’un spectre d’activité spécifique des bactéries du genre Legionella.
De plus, Legionella fait partie des rares bactéries à Gram négatif à posséder de la PC en tant
que lipide membranaire (Kaneda, 1991). Dans le but de savoir si la warnéricine RK interagit
de façon spécifique avec certains phospholipides, un test d’hémolyse en présence de
phospholipides a été mis en place. Le peptide est incubé 10 minutes à température ambiante
en présence de phospholipides à différentes concentrations. Les érythrocytes humains sont
ajoutés à la suspension et le mélange est incubé 30 minutes à 37°C avant de mesurer la DO 576
du surnageant (Tableau 10).
Caractérisation et mode d’action de la warnéricine RK, un peptide anti-Legionella
141
Tableau 10 : Activité hémolytique de la warnéricine RK en présence de phospholipides.
Une solution de warnéricine RK à 5 µM de est incubée 10 min avec différentes concentrations
de phospholipides dans du PBS pH 7,4. Les érythrocytes humains (0,2% final ; v/v) sont
ajoutés. La DO576 du surnageant est mesurée après 30 minutes d’incubation à 37°C. Les
valeurs sont les moyennes de 3 expériences indépendantes ± écart-type. CL : cardiolipide,
PA : acide phosphatidique, PG : phosphatidylglycérol, PI : phosphatidylinositol, PS :
phosphatidylsérine,
PC :
phosphatidylcholine,
SM :
sphingomyéline,
PE :
phosphatidyléthanolamine.
Hémolyse (%)
Concentration en
phospholipides
(µg/ml)
CL
PA
PG
PI
PS
PC
SM
PE
0
44,3 ± 4,5
44,3 ± 4,5
44,3 ± 4,5
44,3 ± 4,5
44,3 ± 4,5
44,3 ± 4,5
44,3 ± 4,5
44,3 ± 4,5
1
30,2 ± 1,2
21,6 ± 4,6
16,8 ± 1,8
22,7 ± 1,5
18,8 ± 1,6
34,2 ± 1,5
47 ± 1,9
42,2 ± 9,3
2
12 ± 0,6
6,8 ± 0,6
7,4 ± 1,6
10,1 ± 1,3
4,2 ± 2,6
26,2 ± 3,1
42,6 ± 1,8
41,7 ±11,0
5
0±0
0±0
0±0
0±0
0±0
10,8 ± 0,1
34,7 ± 1,6
33,9 ± 5,0
10
0±0
0±0
0±0
0±0
0±0
3,4 ± 1,1
18,2 ± 0,1
15,4 ± 3,2
Les résultats indiquent que tous les phospholipides testés inhibent l’activité
hémolytique de la warnéricine RK. Deux groupes de phospholipides se distinguent selon s’ils
inhibent totalement l’activité de la warnéricine RK à partir de 5 µg/ml de phospholipides ou
non. Ainsi, la PE, la PC et la SM forment un groupe et le PI, le PG, la PS, le PA et le CL en
forment un autre. De façon intéressante, ces groupes sont également reliés à la charge globale
des phospholipides à pH neutre. En effet, la PE, la PC et la SM sont des phospholipides
zwitterioniques tandis que les autres sont des phospholipides anioniques. La warnéricine RK
est un peptide antimicrobien cationique qui possède une charge globale de +2 à pH neutre. De
plus, les pourcentages d’inhibition pour les phospholipides anioniques sont relativement
proches les uns des autres pour une concentration en phospholipide de 1 et 2 µg/ml. Pour 5 et
10 µg/ml, les phospholipides anioniques inhibent la totalité de l’activité hémolytique de la
warnéricine RK. Ces résultats peuvent s’expliquer par le développement d’interactions
électrostatiques entre la warnéricine RK et les phospholipides.
Concernant les phospholipides zwitterioniques, deux tendances apparaissent. La PE et la
SM inhibent l’activité hémolytique de la warnéricine de façon équivalente pour une
concentration en phospholipide donnée alors que la PC possède une capacité d’inhibition plus
Caractérisation et mode d’action de la warnéricine RK, un peptide anti-Legionella
142
forte. Or, la PE, la SM et la PC ont une charge globale nulle à pH neutre, les interactions
électrostatiques ne peuvent donc pas se faire avec le peptide. Il y a d’autres interactions qui
peuvent entrer en jeu comme les interactions hydrophobes par exemple.
L’ensemble des résultats indiquent que la warnéricine RK interagit avec les
phospholipides anioniques et n’est plus disponible ensuite pour exercer son activité
hémolytique. Les phospholipides zwitterioniques sont aussi capables d’inhiber l’activité
hémolytique de la warnéricine RK, certainenemnt par le biais d’autres intéractions que les
intéractions électrostatiques.
III.2.3
Analyse de la composition en phospholipides de L. pneumophila
Dans le but de comprendre la résistance des bactéries adaptées à la warnéricine RK, la
compostion en phospholipides des souches sauvage et adaptée de L. pneumophila a été
analysée par chromatographie sur couche mince (Figure 35).
Sens de
migration
1
2
3
4
Figure 35 : Analyse des phospholipides par chromatographie sur couche mince
monodimensionnelle. Un total de 50 µg de chaque échantillon a été déposé sur la plaque. Les
phospholipides ont été révélés avec une solution de bleu de molybdène à 1,3%. Les différents
phospholipides ont été identifiés par comigration avec des standards. L. pneumophila sauvage
en phase exponentielle (1), L. pneumophila sauvage en phase stationnaire (2), L. pneumophila
adaptée en phase exponentielle (3), L. pneumophila adaptée en phase stationnaire (4).
La séparation des phospholipides par chromatographie sur couche mince a permis de
montrer que L. pneumophila possède la PC, la PE, le PG et le CL comme phospholipides
majoritaires. Ces résultats sont en accord avec les données de plusieurs études (Conover et al.,
2008; Finnerty et al., 1979; Hindahl & Iglewski, 1984). D’un point de vue qualitatif, il semble
y avoir moins de PG par rapport aux autres espèces et ce, surtout dans les lignes 1 et 3. Les
Caractérisation et mode d’action de la warnéricine RK, un peptide anti-Legionella
143
phospholipides ont été révélés par du bleu de molybdène ou de la primuline et les mêmes
observations concernant la quantité relative de PG ont été faites quelque soit le colorant
utilisé. La quantité de chaque espèce de phospholipide a été dosée par la méthode du
ferrothiocyanate d’ammonium après élution des différentes espèces de la plaque de silice. Les
résultats sont présentés dans le Tableau 12.
Tableau 11 : Pourcentage relatif des phospholipides des souches sauvage et adaptée de
L. pneumophila. La quantité de chaque espèce a été déterminée puis exprimée en pourcentage
relatif. L. pneumophila sauvage en phase exponentielle (WE), L. pneumophila sauvage en
phase stationnaire (2), L. pneumophila adaptée en phase exponentielle (3), L. pneumophila
adaptée en phase stationnaire (4). n=4
% relatif des phospholipides de L. pneumophila
Espèces
WE
WS
AE
AS
PC
26.6 ± 5,9
29.6 ± 4,8
26.8 ± 4,2
31.6 ± 1,7
PE
PG
42.0 ± 10,7
0.6 ± 0,8
39.4 ± 6,4
4.7 ± 3,2
48.7 ± 9,9
0.8 ± 1,1
33.0 ± 7,4
7.4 ± 3,3
CL
30.8 ± 15,8
26.3 ± 8,1
23.8 ± 13,0
28.0 ± 2,3
Les résultats après dosage indiquent que le PG est minoritaire par rapport aux trois
autres espèces de phospholipides. De plus, il semble présent en plus grande quantité chez les
bactéries en phase stationnaire de croissance. Aucune variation significative n’est observée
pour les trois autres espèces de phospholipides, à savoir PC, PE et CL. Toutefois, il est
important de rappeler que, selon leur nature, les phospholipides répondent plus ou moins bien
à ce dosage et que le fait de gratter et d’éluer les phospholipides conduit à des résultats
difficilement reproductibles. Ces éléments peuvent, en partie, expliquer les valeurs élevées
des écarts-types dans certaines conditions.
III.2.4
Modifications de la composition de l’enveloppe
Les expériences présentées dans cette partie font suites aux résultats de la publication
4 puisque le but est de mesurer l’impact de la modification de la composition de l’enveloppe
chez L. pneumophila, notamment au niveau de la composition en acides gras, sur l’activité de
la warnéricine RK.
Caractérisation et mode d’action de la warnéricine RK, un peptide anti-Legionella
144
Nous avons ainsi étudié la résistance potentielle de deux mutants affectés dans la
structure de l’enveloppe et analysé l’impact d’un inhibiteur de la biosynthèse des acides gras à
chaîne longue.
III.2.4.1
Résistance de mutants de L. pneumophila à la warnéricine RK
Deux souches de L. pneumophila possédant une mutation qui affecte directement les
propriétés de l’enveloppe ont été testées pour leur sensibilité à la warnéricine RK.
Afin de vérifier de façon priliminaire si le LPS de Legionella pouvait jouer un rôle
éventuel dans la sensibilité à la warnéricine RK, un mutant de l’acide légionaminique a été
testé. Il s’agit d’un mutant naturel de L. pneumophila Corby qui possède une mutation en
position 169 du gène lag-1, gène qui code une O-acetyltransferase. Le LPS de ce mutant ne
possède pas de groupements O-acétylés en position 8 sur (Luck et al., 2001). L’activité
inhibitrice de la warnéricine RK a donc été évaluée sur ce mutant, nommé TF 3/1, ainsi que
sur la souche sauvage correspondante (Figure 36). Les deux souches ont été gracieusement
fournies par le Dr. C. Lück.
0,9
Croissance (DO595 nm)
0,8
0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0,0
0
0,3
0,6
1,2
2,5
5
10
20
Concentration en warnéricine RK (µM)
Figure 36 : Activité inhibitrice de la warnéricine RK contre L. pneumophila Corby. Les
bactéries cibles ont été cultivées en milieu BYE. La gamme de concentration de warnéricine
RK choisie est comprise entre 0,3 µM et 20 µM. Les résultats obtenus correspondent à la CMI
après 96 heures de culture à 37°C. L. pneumphila Corby sauvage ( ) L. pneumphila Corby TF
3/1 ( ). n=2
La warnéricine RK possède une CMI de 0,6 µM sur la souche de L. pneumophila
Corby WT et sur le mutant TF 3/1.Ces résultats indiquent que l’acide légionaminique n’est
pas impliqué dans la sensibilité de L. pneumophila vis-à-vis de la warnéricine RK.
Caractérisation et mode d’action de la warnéricine RK, un peptide anti-Legionella
145
L’activité inhibitrice de la warnéricine RK a également été testée contre deux mutants
de la souche L. pneumophila Philadelphia, nommés NU260 et NU261, qui possèdent une
mutation dans le gène chromosomique rcp (Figure 37). Ce gène, nécessaire à la
multiplication intracellulaire de L. pneumophila chez les amibes, confère également une
résistance accrue aux peptides antimicrobiens cationiques PmB et C18G (Robey et al., 2001).
Ces effets sont cohérents avec ceux retrouvés chez Salmonella chez qui PagP fonctionnent
comme une palmitoyl transferase. Elle est capable de modifier le lipide A du LPS par addition
d’acide palmitique (C16:0). Ainsi, l’acylation augmenterait la résistance aux peptides
antimicrobiens en diminuant la fluidité membranaire ce qui empêcherait l’insertion des
peptides (Guo et al., 1997; Guo et al., 1998). Les souches ont été gracieusement envoyées par
le Dr. N. P. Cianciotto.
0,9
Croissance (DO595 nm)
0,8
0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0
0
0,3
0,6
1,2
2,5
5
10
20
Concentration en warnéricine RK (µM)
Figure 37: Activité inhibitrice de la warnéricine RK contre L. pneumophila Philadelphia.
Les bactéries cibles ont été cultivées en milieu BYE. La gamme de concentration de
warnéricine RK choisie est comprise entre 0,3 µM et 20 µM. Les résultats obtenus
correspondent à la CMI après 96 heures de culture à 37°C. L. pneumphila Philadelphia
sauvage 130b ( ) L. pneumphila Philadelphia NU260 ( ) L. pneumphila Philadelphia NU261
( ). n=2
La CMI de la warnéricine RK contre la souche sauvage est de 0,6 µM. Les deux
mutants, NU260 et NU261, possèdent la même sensibilité que la souche sauvage puisque la
CMI du peptide est également de 0,6 µM. Les résultats indiquent que le gène rcp ne confère
pas à L. pneumophila une plus grande résistance à l’action de la warnéricine RK
contrairement aux peptides cationiques PmB et C18G. La warnéricine RK possède
Caractérisation et mode d’action de la warnéricine RK, un peptide anti-Legionella
146
probablement un mode d’action différent de PmB et C18G, ce qui pourrait expliquer que la
mutation du gène rcp n’affecte pas la sensibilité de la souche à la warnéricine RK.
III.2.4.2
Inhibition de la biosynthèse des acides gras à longue chaîne
Nous avons utilisé la céruline afin d’inhiber l’élongation des acides gras et ainsi, tester
l’impact d’une augmentation du taux d’acides gras à chaine courte sur la résistance de L.
pneumophila à la warnéricine RK. Ce travail a été en partie réalisé par une stagiaire de Master
2 Recherche, Vanessa Barbot, sous ma direction.
La cérulénine, découverte en 1960, est une mycotoxine de 223,27 Da produite par le
champignon Cephalosporium caerulens (Omura, 1976). Elle possède une longue chaîne
acylée (Figure 39A) et forme un complexe irréversible avec les enzymes FabB et FabF en
formant une liaison covalente avec un résidu cystéine et des liaisons hydrogènes avec les deux
histidines du site actif enzymatique (Figure 39B) (Campbell & Cronan, 2001). Elle mime
ainsi l’état de transition de l’étape de condensation et empêche la liaison de l’acide gras en
cours d’élongation (Moche et al., 1999).
A
B
Figure 38 : Structure de la cérulénine et action sur FabB. Structure chimique de la
cérulénine (A). Action de la cérulénine sur l’enzyme FabB comparée à l’étape normale de la
voie de biosynthèse de type II des acides gras (B) D’après (Campbell & Cronan, 2001; Price
et al., 2001).
L’enzyme FabB posséderait la plus haute affinité pour la cérulénine (IC50 = 3 µM) par
rapport à FabF (IC50 = 20 µM) et FabH (IC50 > 700 µM) (Price et al., 2001). Elle possède un
spectre d’activité antimicrobien et antifongique assez large (Omura, 1976).
Caractérisation et mode d’action de la warnéricine RK, un peptide anti-Legionella
147
III.2.4.2.1 Analyse des effets de la cérulénine sur la composition en acide gras
de L. pneumophila
Afin d’étudier les effets de la cérulénine sur la composition en acide gras de L.
pneumophila, il a fallu dans un premier temps déterminer la CMI de l’inhibiteur dans nos
conditions de cultures. Les cellules de L. pneumophila ont été cultivées pendant 200 heures en
milieu BYE sous agitation (200 rpm), en présence ou non de cérulénine (Figure 40).
Croissance (log(DO600))
1,E+01
1,E+00
1,E-01
1,E-02
0
50
100
150
200
250
Temps (heures)
Figure 39 : Croissance de L. pneumophila Lens en présence de différentes concentrations
de cérulénine. L’inoculum de départ est de 107 UFC/ml. La gamme de concentration de
cérulénine choisie est comprise entre 0 µM et 3,6 µM µM. La croissance de L. pneumophila
Lens a été réalisée à 37°C en milieu BYE sous agitation (200 rpm) en tube stériles de 15 ml.
Croissance sans cérulénine (
), en présence de 0,45 µM de cérulénine (
), en présence de
0,9 µM de cérulénine (
), en présence de 1,8 µM de cérulénine (
), en présence de 2,7
µM de cérulénine (
), en présence de 3,6 µM de cérulénine (
).
La courbe de croissance de L. pneumophila en présence de différentes concentrations
de cérulénine indique qu’un traitement à 0,45 µM induit un léger retard de croissance des
bactéries. Cet effet est accentué avec 0,9 µM de cérulénine. A partir de 1,8 µM, la croissance
de L. pneumophila est totalement inhibée pendant 200 heures. Afin d’observer un effet non
létal de la cérulénine pour les bactéries, la concentration en cérulénine choisie est de 0,45 µM.
L. pneumophila est cultivée jusqu’en phase exponentielle de croissance (DO600 comprise entre
0,3 et 0,5) puis les bactéries sont récupérées par centrifugation (10000 g, 10 minutes, 4°C).
Les lipides totaux sont extraits à partir de 4.109 cellules par la méthode de Folch (Folch et al.,
1957) c’est-à-dire en méthanol/chloroforme (2:1, v/v). Après purification sur colonne de
Caractérisation et mode d’action de la warnéricine RK, un peptide anti-Legionella
148
silice, les lipides sont méthylés par ajout d’une solution de méthanol alcalin à 0,2 M sous
agitation (200 rpm) pendant 1 heure. Les esters méthylés résultant sont ensuite analysés par
GC-MS (Tableau 12).
Tableau 12 : Influence de la cérulénine sur la composition en acides gras de L.
pneumophila Lens. L. pneumophila Lens est cultivée en absence ou en présence de
cérulénine à 0,45 µM sous agitation (150 rpm) à 37°C. Les lipides sont extraits à partir de
4.109 cellules en phase exponentielles de croissance et analysés par GC-MS.
% relatif des acides gras totaux de L. pneumophila Lens†
Acide gras
Sans traitement
Traitement à 0,45 µM de
cérulénine
0,6 ± 0,2
1,2 ± 0,2
4,2 ± 0,3
0,5 ± 0,1
11,5 ± 2,7
7,6 ± 0,5
41,2 ± 4,2
tr
8,3 ± 0,4
1,8 ± 0,1
17,4 ± 0,4
0,6 ± 0,2
3,8 ± 1,0
1,6 ± 0,5
7,5 ± 2,5
8,4 ± 1,9
1,2 ± 0,2
7,4 ± 1,0
9,6 ± 1,3
51,5 ± 5,4
tr
2,7 ± 0,7
tr
7,2 ± 0,7
tr
1,4 ± 0,7
Unknown
0,9
0,9
% branchés
25,0
20,2
% insaturés
7,6
9,6
% chaîne courte
6,5
18,7
iC14:0
C14:0
aC15:0
C15:0
iC16:0
C16:1
C16:0
iC17:0
aC17:0
C17:0
C18:0
C19:0
C20:0
† Les acides gras présentés sont ceux dont l'abondance relative est d'au moins 0,5 %. Les valeurs
sont les moyennes de 3 expériences indépendantes ± écart-type
tr (traces), acides gras ayant une abondance relative inférieure à 0,5 %
a, branchés en anteiso
i, branchés en iso
Les résultats obtenus permettent de mettre en évidence un effet important de la
cérulénine sur l’augmentation du taux d’acides gras à chaine courte c'est-à-dire ayant moins
de 16 atomes de carbone. En effet, les bactéries en présence de cérulénine possèdent 3 fois
plus d’acides gras à chaîne courte qu’en absence de cérulénine. A l’inverse, l’abondance
relative des acides gras ayant plus de 16 atomes de carbone diminue en présence de cérulénine
Caractérisation et mode d’action de la warnéricine RK, un peptide anti-Legionella
149
d’un facteur 2 à 3. Par exemple, le aC17:0 passe de 8,3 % à 2,7 %, le C18:0 de 17,4 % à 7,2
% et le C20:0 de 3,8 % a 1,4 %. Le pourcentage d’acides gras branchés reste globalement le
même dans les deux conditions.
La cérulénine agit bien comme un inhibiteur de l’élongation des acides gras en
favorisant l’augmentation du taux d’acides gras à chaîne courte au profit des acides gras à
chaîne longue. Ces résultats sont en accord avec d’autres études qui ont montrées qu’un
traitement à la cérulénine entraînait une diminution relative du taux de lipides à longue chaîne
(Parrish et al., 1999; Zhu et al., 2005).
III.2.4.2.2 Activité de la warnéricine RK en présence de cérulénine
Les résultats obtenus précédement montrent que la cérulénine module la composition
des acides gras chez L. pneumophila, notamment en entraînant une augmentation du taux
d’acides gras à chaîne courte. Afin de déterminer si les changements induits par la cérulénine
affectent la sensibilité de L. pneumophila à la warnéricine RK, un test de mesure de la
perméabilisation à été réalisé. L. pneumophila est cultivée en milieu BYE en absence ou en
présence de 0,45 µM de cérulénine. La croissance est suivie jusqu’en phase exponentielle
(DO proche de 0,5) puis les bactéries sont ajustées à 106 UFC/ml. Après 45 min de traitement
à différentes concentrations de warnéricine RK, les échantillons sont marqués au SYTO9 et à
l’IP pendant 15 minutes. Les suspensions sont ensuite analysées par cytométrie en flux
(Figure 41).
Caractérisation et mode d’action de la warnéricine RK, un peptide anti-Legionella
150
120
Bactéries IP+ (%)
100
80
60
IP50
40
20
0
0
1,2
2,5
5
10
Concentration en warnéricine RK (µM)
Figure 40 : Activité inhibitrice de la warnéricine RK contre L. pneumophila en présence
de cérulénine. Les bactéries cibles ont été cultivées en milieu BYE. La gamme de
concentration de warnéricine RK choisie est comprise entre 1,2 µM et 10 µM. Les résultats
obtenus correspondent au pourcentage de perméabilisation après 1 heure de temps de contact
avec la cérulénine. L. pneumphila LensWT ( ), L. pneumphila Lens cultivée en présence de
0,45 µM de cerulénine ( ). n=4
Les résultats obtenus, en absence de cérulénine, sont quasiment similaires à ceux déjà
présentés dans la publication 3. L’indice IP50 est cependant içi, inférieur à 1,2 µM de
warnéricine RK. En présence d’une concentration sub-inhibitrice de cérulénine (0,45 µM),
l’indice IP50 est égal à 1,2 µM de warnéricine RK. Cependant, L. pneumophila posséde
globalement la même sensibilité à la perméabilisation induite par la warnéricine RK, en
présence et en absence de cérulénine. Ainsi, le traitement à la cérulénine, même s’il modifie la
composition en acides gras de la membrane, ne semble pas affecter l’activité de la warnéricine
RK.
En conclusion, la cérulénine agit bien sur la voie de biosynthèse des acides gras de L.
pneumophila puisque nous voyons une diminution des acides gras à chaîne longue et une
augmentation des acides gras à chaîne courte. Cependant le traitement à la cérulénine ne
semble pas affecter la sensibilité de L. pneumophila à la warnéricine RK. Le taux d’acide gras
à chaine courte ne semble donc pas être un facteur impliqué dans l’activité de la warnéricine
RK. La résistance à la warnéricine RK pourrait être due à l’augmentation des acides gras
branchés ou à l’augmentation des acides gras branchés ainsi que des acides gras à chaine
courte.
Caractérisation et mode d’action de la warnéricine RK, un peptide anti-Legionella
151
Caractérisation et mode d’action de la warnéricine RK, un peptide anti-Legionella
152
Partie 4. Discussion
Caractérisation et mode d’action de la warnéricine RK, un peptide anti-Legionella
153
Caractérisation et mode d’action de la warnéricine RK, un peptide anti-Legionella
154
Notre étude décrit la caractérisation du premier peptide anti-Legionella, la warnéricine
RK et l’analyse de son mode d’action. Deux autres peptides anti-Legionella ont également été
isolés ; il s’agit des δ-hémolysines I et II produites par S. warneri. C’est la première fois que
ces deux peptides sont purifiés même si leurs gènes avaient déjà été décrits auparavant
(Tegmark et al., 1998). La δ-hémolysine est une exotoxine dont la séquence primaire est
hautement conservée au sein des bactéries du genre Staphylococcus. Nous avons montré, au
cours de ce travail, que la warnéricine RK partageait un grand nombre de similitudes avec la
δ-hémolysine I de S. warneri.
La warnéricine RK est copurifiée avec les δ-hémolysines I et II et ces 3 peptides sont
produits en fin de phase exponentielle de croissance. La δ-hémolysine de S. aureus est
produite également en fin de phase exponentielle de croissance (Balaban & Novick, 1995;
Janzon & Arvidson, 1990; Lyon & Novick, 2004). Les 3 peptides ont quasiment la même
taille et les mêmes propriétés d’hydrophobicité puisqu’ils sont élués en HPLC à des temps
très proches. Cependant la warnéricine RK ne possède aucune homologie de séquence avec
les δ-hémolysines de Staphylococcus (voir publication 2) mais adopte avec la δ-hémolysine I
une structure similaire, en hélice α amphiphile, au contact des membranes (Brauner et al.,
1987; Lee et al., 1987; Verdon et al., 2009). Ce dernier point suggère que les deux peptides
possèdent la capacité d’intéragir avec les membranes biologiques.
La warnéricine RK et la δ-hémolysine I possèdent le même spectre d’activité
antimicrobien, restreint aux bactéries du genre Legionella et certains Bacillus (Thèse de N.
Girardin ; publication 2). Ces peptides possèdent également la même CMI contre Legionella
(1 µM) et aussi contre Bacillus megaterium (4 µM). Jusqu’alors, les δ-hémolysines étaient
uniquement considérés comme des peptides hémolytiques sans activité antimicrobienne
connue (Dhople & Nagaraj, 1993). Une seule étude a décrit une très faible activité contre une
souche de B. megaterium (CMI = 20 µM) (Kreger et al., 1971). Aussi, c’est la première fois
qu’une δ-hémolysine est décrite comme possédant une activité antimicrobienne avec une
faible CMI. Évidemment, le spectre antimicrobien réalisé n’étant pas exhaustif, il reste
possible que la warnéricine RK et la δ-hémolysine I soient actives contre d’autres bactéries.
La gamme de concentration d’activité des deux peptides, de l’ordre de 1 à 4 µM, est
classiquement retrouvée pour de nombreux autres peptides antimicrobiens tels que la
cécropine P1 (0,3 à 17 µM), l’indolicidine (2 à 16 µM) ou encore la mélittine (9 à 18 µM)
(Melo et al., 2009).
L’activité bactéricide de la warnéricine RK et de la δ-hémolysine I est plus prononcée
sur les cellules de L. pneumophila en phase exponentielle de croissance que sur celles en
Caractérisation et mode d’action de la warnéricine RK, un peptide anti-Legionella
155
phase stationnaire de croissance. Dans la littérature, les bactéries en phase stationnaire de
croissance sont décrites comme plus résistantes à l’action de peptides antimicrobiens ; c’est le
cas par exemple de la warnérine IEGM KL-1 (Korobov et al., 2005) ou du tPMP (Koo et al.,
1996). De plus, Legionella en phase sationnaire est décrite comme plus résistante à l’action
d’antibiotiques et de biocides (Barker et al., 1992; Barker et al., 1995; Donlan et al., 2005).
Chez Legionella et d’autres bactéries à Gram négatif, la phase stationnaire de croissance est
associée à un état de carence alimentaire qui permet la synthèse de ppGpp (Gentry et al.,
1993; Hammer & Swanson, 1999). Cette molécule régule positivement le gène rpoS qui induit
notamment l’expression de facteurs de virulence et de résistance à des stress, expliquant ainsi
la résistance accrue des bactéries en phase stationnaire (Bachman & Swanson, 2001; Spira et
al., 2008). La diminution de l'intensité des processus énergétiques pourrait également
expliquer, en partie, cette augmentation de la résistance. En effet, le gradient électrochimique
Δψ décroit en phase stationnaire de croissance (Hoffmann & Dimroth, 1991; Ruhr & Sahl,
1985) ce qui entrainerait une diminution de l’adsorption des peptides cationiques sur les
bactéries cibles, réduisant ainsi l'activité antibactérienne du peptide (Breukink & de Kruijff,
1999; Korobov et al., 2005). Des changements dans la composition de l’enveloppe, tels
qu’une modification de la fluidité membranaire ou la modification des charges de surface
entrainant une diminution de l’interaction peptide/membrane pourraient être impliqués dans la
plus grande résistance des bactéries en phase stationnaire (Ernst et al., 2001; Kramer et al.,
2006; Nizet, 2006).
Les similitudes entre la warnéricine RK et de la δ-hémolysine I au niveau des activités
biologiques et des caractéristiques structurales plus le fait que Legionella et Bacillus ne
partagent pas la même niche écologique que la souche productrice S. warneri RK, laissent
suggèrer, d’une part que la warnéricine RK est peut-être une exotoxine, à l’image de la δhémolysine, faisant partie de l’arsenal de virulence de S. warneri RK et, d’autre part, que
Legionella, certains Bacillus et les érythrocytes possèdent une caractéristique commune qui
les rend sensibles à l’action des peptides d’intérêt.
Le mode d’action de la δ-hémolysine de S. aureus a été récemment décrit selon le
modèle detergent-like (Bechinger & Lohner, 2006). Ce mode d’action passe par la formation
de pores à faible ratio peptide/lipide (P/L) (Mellor et al., 1988) et par la desintégration de la
membrane via la formation de micelles à fort ratio P/L (Bechinger & Lohner, 2006; Lohner et
al., 1999). La warnéricine RK, à faible concentration (< 2µM) perméabilise des membranes
de diphytanoylphosphatidylcholine (DPhPC) (voir publication 3) de la même manière que la
Caractérisation et mode d’action de la warnéricine RK, un peptide anti-Legionella
156
δ-hémolysine (Mellor et al., 1988). Cette perméabilisation membranaire passe par la
formation de pores qui n’ont, cependant, pas de taille définie, comme le montrent les
expériences de protection osmotique. Ces résultats sont en accord avec une action de type
detergent-like (Bechinger & Lohner, 2006). De plus, nous avons montré que Legionella était
très sensible aux détergents par rapport aux autres bactéries testées. Ainsi, la warnéricine RK
semble possèder un mécanisme d’action detergent-like tout comme la δ-hémolysine de S.
aureus.
La perméabilisation de la membrane de L. pneumophila induite par la warnéricine RK
conduit, de manière directe ou indirecte, à la mort des bactéries. Ces résultats indiquent qu’il
ne s’agit pas d’un simple effet bactériostatique. L’étude de Dhople et al. a montré que la δhémolysine de S. aureus n’est pas capable de perméabiliser des liposomes imitant la
composition
en
phospholipides
(dioleoylphosphatidyléthanolamine
de
la
membrane
/dioleoylphosphatidylglycérol
(3:1))
bactérienne
alors
qu’elle
perméabilise des liposomes réalisés à partir de PC (Dhople & Nagaraj, 1993). Les mêmes
résultats ont été obtenus avec des liposomes de 1-palmitoyl-2-oleoylphosphatidylcholine
(POPC)
par Pokorny et al. (Pokorny et al., 2002). Les auteurs en ont conclu que l’incapacité
de la δ-hémolysine à perméabiliser la membrane bactérienne était, en partie, due à l’absence
de charge du peptide à pH neutre (Dhople & Nagaraj, 1993). Or, la warnéricine RK possède,
quant à elle, une charge globale de +2 à pH neutre ce qui tend à montrer que les activités
antimicrobiennes et hémolytiques observées dans notre étude ne sont donc pas uniquement
dépendantes de la charge du peptide. Malgré tout, cette différence de charge pourrait
expliquer, en partie, le fait que la warnéricine RK semble possèder un effet plus prononcé sur
L. pneumophila ou les érythrocytes que la δ-hémolysine I, à concentration équivalente. La
charge est une caractéristique importante pour l’activité des peptides antimicrobiens. Elle est
comprise majoritairement entre +2 et +9 (Hancock & Sahl, 2006). Ces données sont
confirmées par une étude qui a montré que l’augmentation de la charge de la δ-hémolysine de
S. aureus en remplaçant des acides aspartiques par des lysines permettait d’augmenter
l’activité hémolytique du peptide et d’obtenir une acitivité antimicrobienne (Dhople &
Nagaraj, 2005).
L’activité sur les érythrocytes pourrait s’expliquer par le fait que, contrairement aux
bactéries, ils ne possèdent pas de structures protectrices comme le peptidoglycane ou le LPS,
les rendant ainsi plus sensibles à l’action des peptides antimicrobiens (Virtanen et al., 1998) et
que la PC est un constituant majoritaire de la membrane (Matsuzaki, 1999). En effet, cette
membrane est riche en sphingomyéline, POPC et cholestérol, lipides qui peuvent exister sous
Caractérisation et mode d’action de la warnéricine RK, un peptide anti-Legionella
157
forme de domaines désordonnés et ordonnés (de Almeida et al., 2003; Dietrich et al., 2001).
Ces domaines ordonnés, enrichis en cholestérol et sphingomyéline, sont communément
appelés lipid rafts (Rietveld & Simons, 1998). La δ-hémolysine de S. aureus se lie
préférentiellement aux domaines désordonnés de la membrane eucaryote par exclusion des
domaines ordonnés (Pokorny & Almeida, 2005). Ce phénomène a également été observé pour
d’autres peptides antimicrobiens tels que le P-23, le MPR ou la mélittine (Gandhavadi et al.,
2002; McIntosh et al., 2003; Raghuraman & Chattopadhyay, 2004b). Ainsi, il est possible que
la différence de sensibilité observée pour un peptide antimicrobien contre des bactéries soit
liée à un mécanisme similaire d’interaction avec des domaines lipidiques particuliers de la
cible (Pokorny & Almeida, 2005). En effet, la composition de la membrane varie grandement
entre les bactéries à Gram positif et les bactéries à Gram négatif. Une hétérogénéité dans la
structure de la membrane telle que la présence de phases ordonnées/désordonnées, la présence
de clusters de lipides mais également les propriétés élastiques des membranes pourraient être
autant de facteurs qui influencent l’activité des peptides antimicrobiens (Pokorny et al., 2008).
La structure des chaînes d’acides gras des phospholipides détermine les propriétés élastiques
de la membrane c’est-à-dire la capacité de la membrane à résister à la distorsion induite par
des composés tels que les peptides antimicrobiens. Ainsi, l’activité de peptides tels que la δhémolysine, la mélittine ou l’alamethicine est fortement influencée par la structure des acides
gras (Chen et al., 2002; Faucon et al., 1995; Raghuraman & Chattopadhyay, 2004a). Nous
avons montré que L. pneumophila possède un taux d’acides gras branchés important (jusqu’à
70%), confirmant ainsi les données disponibles dans la littérature (Barker et al., 1993;
Lambert & Moss, 1989; Moss et al., 1977; Moss & Dees, 1979). Ce paramètre est cependant
inhabituel pour une bactérie à Gram négatif (Kaneda, 1991). D’autre part, ce taux d’acides
gras branchés est dépendant de l’état physiologique de la bactérie et des conditions de
cultures. Ainsi, l’absence de fer ou de phosphate ou encore la culture intra-amibienne diminue
le taux d’acides gras branchés chez L. pneumophila (Barker et al., 1993). Les acides gras
branchés jouent notamment un rôle prépondérant dans la fluidité membranaire puisqu’ils
possèdent une température de transition de phase plus basse que leurs homologues non
branchés, à nombre de carbone équivalent (Kaneda, 1971). Nous avons montré que lors du
passage de la phase exponentielle à la phase stationnaire de croissance, le taux d’acides gras
branchés de L. pneumophila passe de 25% à 66% et que le taux d’acides gras à chaine courte
passe de 8% à 18%, suggérant que la membrane de L. pneumophila en phase stationnaire de
croissance serait plus fluide qu’en phase exponentielle de croissance. Ces résultats sont en
accord avec les études de Finnerty et al., et de Brüggemann et al., qui montrent que L.
Caractérisation et mode d’action de la warnéricine RK, un peptide anti-Legionella
158
pneumophila en phase stationaire de croissance posséde, un taux élevé d’acides gras branchés
et à chaîne courte (Bruggemann et al., 2006; Finnerty et al., 1979). Un tel phénotype au
niveau des acides gras est notamment retrouvé chez de nombreuses bactéries exposées à des
stress environementaux tels que les stress thermiques ou les stress chimiques (Li et al., 2002;
Nielsen et al., 2005; Russell et al., 1995). Cette augmentation de la fluidité pourrait ainsi
limiter la perméabilisation induite par les peptides antimicrobiens en détabilisant les pores,
prévenant de la sorte leur translocation.
Que ce soit par mutagénèse aléatoire ou par pression de sélection, nous n’avons isolé
aucun mutant stable de L. pneumophila qui soit résistant à la warnéricine RK. L’absence de
résistance tend à montrer que si des gènes sont directement impliqués dans la résistance à la
warnéricine RK, alors ce sont des gènes essentiels pour L. pneumophila. Cette absence de
résistance est également un facteur important pour une éventuelle application de la
warnéricine RK dans les domaines de la santé ou de l’environnement. En effet, les
antibiotiques conventionnels sélectionnent naturellement des souches bactériennes résistantes
qui sont devenues un problème majeur de santé publique (Hancock & Chapple, 1999).
Plusieurs programmes de recherche et de développement ont ainsi été entrepris pour étudier
les applications possibles des peptides antimicrobiens. Ainsi, quelques peptides sont utilisés
comme conservateurs dans l’alimentation, comme la nisine, tandis que plusieurs dizaines
d’autres sont en cours de développement pour être utilisés comme antibiotiques chez
l’Homme (Giuliani et al., 2007).
Une souche de L. pneumophila adaptée à l’action de la warnéricine RK a cependant pu
être isolée par pression de sélection. Cette souche possède une CMI, pour la warnéricine RK,
32 fois supérieure (40 µM) à celle de la souche sauvage. Toutefois, cette souche présente une
sensibilité intermédiaire à la warnéricine RK en comparaison de bactéries, comme E. coli, qui
résistent même à 195,2 µM de warnéricine RK. Ces résultats accentuent la specificité du
spectre d’action de la warnéricine RK et renforcent l’idée d’une caractéristique particulière
qui serait présente, au moins, chez Legionella et certains Bacillus. Une autre étude a montré
l’adaptation d’une souche bactérienne, L. lactis, à un peptide antimicrobien, la nisine (Kramer
et al., 2006). La souche possède une résistance 75 fois supérieure à la souche sauvage et perd
son phénotype de résistance par culture en absence de nisine. Ainsi, les bactéries sont
capables de mettre en place un ou plusieurs mécanismes réversibles leur permettant
d’échapper à l’activité de peptides antimicrobiens.
Caractérisation et mode d’action de la warnéricine RK, un peptide anti-Legionella
159
L’analyse de la composition en acides gras de la souche adaptée de L. pneumophila a
permis de mettre en évidence qu’elle posséde un taux d’acides gras branchés et d’acides gras
à chaine courte deux fois supérieur à celui de la souche sauvage. De façon intéressante, la
souche adaptée en phase exponentielle de croissance possède le même profil d’acide gras que
la bactérie sauvage en phase stationnaire de croissance. Il semblerait que l’adaptation à la
warnéricine RK soit liée, en partie, à une modification de la composition en acides gras
branchés et à chaine courte ce qui entrainerait une augmentation de la fluidité membranaire.
L’analyse de la composition en phospholipides des souches sauvages et adaptées de L.
pneumophila révèle que PC, PE, PG et CL sont les espèces majoritaires. Ces résultats sont en
accord avec ceux d’autres études (Conover et al., 2008; Finnerty et al., 1979; Hindahl &
Iglewski, 1984). Le taux de PG augmente chez les bactéries en phase stationnaire de
croissance par rapport aux bactéries en phase exponentielle de croissance tandis qu’aucune
variation significative n’est obtenue pour les trois autres espèces de phospholipides. Etant
donné que bactéries sauvages et adaptées semblent possèder le même profil de
phospholipides, il apparait que les phospholipides ne seraient pas impliqués dans l’activité de
la warnéricine RK.
Quelques gènes impliqués dans la biosynthèse des acides gras ont été mis en évidence
par analyse de l’expression des gènes chez L. pneumophila adaptée. Il y a notamment des
gènes réprimés qui sont impliqués dans la biosynthèse des acides gras à chaine longue et des
acides gras insaturés. Peu d’études ont analysé les variations de l’expression des gènes en
réponse à l’action d’un peptide antimicrobien. Une étude a été réalisée sur une souche de L.
lactis adaptée à la nisine. Les résultats ont permis aux auteurs de mettre en évidence que des
variations dans l’expression de gènes impliqués dans la biosynthèse de la paroi, dans le
métabolisme des lipides, dans le transport actif et dans le métabolisme cellulaire seraient
responsable de la résistance accrue de la souche bactérienne à la nisine (Kramer et al., 2006).
De façon intéressante, ils montrent que la membrane de la souche adaptée de L. lactis serait
plus fluide (acides gras plus courts et insaturés) et empêcherait ainsi l’insertion de la nisine et
la formation de pores. Cependant, ce mécanisme serait accompagné de plusieurs autres
mécanismes de résistance connu comme l’ajout de charges positives dans le LPS et un
transport actif plus important.
Caractérisation et mode d’action de la warnéricine RK, un peptide anti-Legionella
160
CONCLUSION GENERALE ET PERSPECTIVES
Caractérisation et mode d’action de la warnéricine RK, un peptide anti-Legionella
161
Caractérisation et mode d’action de la warnéricine RK, un peptide anti-Legionella
162
Les objectifs de notre étude étaient de déterminer les activités biologiques d’un
peptide anti-Legionella, la warnéricine RK et d’analyser son mode d’action.
La première partie de l’étude concernant les activités biologiques de la warnéricine
RK a permis de montrer qu’il s’agit d’un peptide antimicrobien dont le spectre d’activité est
restreint aux bactéries du genre Legionella et à certains Bacillus. Il serait intéressant d’étendre
ce spectre d’activité, notamment à plusieurs espèces de Bacillus, afin de déterminer la
sensibilité potentielle d’autres bactéries et de vérifier ainsi la spécificité d’action de la
warnéricine RK. Des mutants de transposition chez L. pneumophila ont été réalisés sans
obtenir de resistants à la warnéricine RK. Une autre approche consisterait à cribler une
collection de mutants de Bacillus avec la warnéricine RK afin de voir s’il est possible
d’obtenir des résistants. Cela permettrait peut-être de comprendre pourquoi certains Bacillus
sont sensibles à la warnéricine RK.
Le peptide est produit en fin de phase exponentielle de croissance dans le surnageant
de culture de S. warneri RK avec d’autres peptides à activité anti-Legionella dont les δhémolysines I et II. L’étude des autres peptides purifiés pourrait permettre d’identifier de
nouveaux composés d’intérêt. La recherche de la warnéricine RK chez d’autres espèces de
Staphylococcus pourrait également être intéressante pour savoir si, comme la δ-hémolysine, il
s’agit d’un peptide produit par un grand nombre d’espèces ou alors spécifique de S. warneri
RK. Ce travail a été initié par Adrienne Marchand dans le cadre de sa thèse.
La warnéricine RK possède une activité hémolytique ce qui pourrait limiter son
utilisation dans le domaine médical. Cependant, l’étude des relations structure/fonction du
peptide pourrait aboutir à la génération de variants dépourvus d’activité hémolytique et ayant
conservé une forte activité anti-Legionella. Ce sujet est également developpé par Adrienne
Marchand.
La deuxième partie de l’étude a consisté à élucider le mode d’action de la warnéricine
RK. La warnéricine RK, qui se structure en hélice α amphiphile au contact des membranes,
perméabilise les membranes artificielles et naturelles en formant des pores. De plus, cette
perméabilisation est suffisante pour induire la mort de L. pneumophila, de manière directe ou
indirecte. Pour aller plus loin dans le détail du mécanisme d’action de la warnéricine RK,
nous pourrions faire varier la composition en lipides de vésicules lipidiques et mesurer
l’impact de ces changements sur l’activité de la warnéricine RK. Les vésicules lipidiques
enfermeraient un indicateur tel que la calcéine ou la carboxyfluorescéine et le relarguage de
fluorochrome serait un indicateur de perméabilisation induite par la warnéricine RK. Ainsi,
Caractérisation et mode d’action de la warnéricine RK, un peptide anti-Legionella
163
nous
serions
en
mesure
de
savoir,
par
exemple,
si
la
présence
de
phases
ordonnées/désordonnées, l’élasticité de la membrane ou encore la présence d’un
phospholipide particulier influencerait l’activité de la warnéricine RK.
La troisième partie de cette étude était axée sur l’analyse de l’enveloppe de L.
pneumophila, surtout au niveau des lipides membranaires. Les résultats obtenus ont permis de
mettre en évidence que L. pneumophila possède un taux élevé d’acides gras branchés et à
chaine courte, taux qui est dépendant de l’état physiologique de la bactérie. Une souche de L.
pneumophila adaptée à la warnéricine RK a été obtenue par pression de sélection. Cette
souche possède une résistance 32 fois supérieure à celle de la souche sauvage. L’analyse des
acides gras a montré que la souche adaptée, à l’image des bactéries en phase stationnaire,
possède un taux élevé d’acides gras branchés et d’acides gras à chaine courte. Cependant,
même si la souche adaptée résiste à 40 µM de warnéricine RK, il serait intéressant de savoir si
elle possède la même résistance au peptide selon la phase de croissance. En effet, nous avons
montré que L. pneumophila en phase stationnaire de croissance était plus résistante à l’action
de la warnéricine RK qu’en phase stationnaire de croissance. Ceci pourrait être réalisé en
mesurant la perméabilisation induite par la warnéricine RK sur les bactéries adaptées remises
en suspension dans un milieu sans warnéricine RK. La mesure serait effectuée par cytométrie
en flux avec un marquage préalable des cellules par les fluorochromes du kit Baclight™.
Les premiers éléments intéressants de l’analyse des variations de l’expression des
gènes de la souche adaptée par rapport à la souche sauvage semblent cohérents avec le
phénotype obtenu à savoir une diminution de la taille des chaines des acides gras et une
augmentation de la ramification. Dans un premier temps, l’analyse des résultats de
l’expression des gènes devra être compléter, puis, dans un second temps, les résultats devront
être confirmés au moins par RT-PCR (Reverse transcription-polymerase chain reaction)
quantitative et peut être en réalisant des mutants de gènes sélectionnés et en testant leur
résistance à la warnéricine RK.
Le phénotype observé au niveau de la composition en acide gras chez la souche
adaptée, ou lors du passage vers la phase stationnaire de croissance, suggère une
augmentation de la fluidité de la membrane. Cette fluidité membranaire des différentes
souches de L. pneumophila pourrait être déterminée par l’utilisation d’une sonde comme la
DPH (1,6-diphenyl-1,3,5-hexatriene) (Bayer et al., 2006; Mykytczuk et al., 2007). Cette
sonde très hydrophobe pénètre dans la partie hydrophobe de la membrane et émet de la
fluorescence lorsqu’elle est excitée. Nous pourrions moduler la composition en acides gras
Caractérisation et mode d’action de la warnéricine RK, un peptide anti-Legionella
164
chez L. pneumophila en lui apportant des acides gras exogènes comme cela a déjà été montré
auparavant pour d’autres microorganismes (Johnston & Goldfine, 1992; Khuller & Goldfine,
1975) et tester la résistance des souches à la warnéricine RK.
L’analyse des têtes polaires des phospholipides a permis de mettre en évidence que les
bactéries en phase stationnaire de croissance semble possèder un taux plus important de PG
que celles en phase exponentielle de croissance. Les analyses effectuées suggèrent qu’il
n’existe pas de différences au niveau des autres espèces de phospholipides (PE, PC et CL)
même si l’augmentation de PG devrait se traduire par la diminution d’une autre espèce. Peut
être qu’une autre méthode de quantification pourrait être envisagée afin de lever cette
ambiguïté telle que la chromatographie liquide couplée à un spectromètre de masse ou alors
l’utilisation de la radioactivité des acides gras en nourrissant au préalable les bactéries avec de
l’acétate radioactif.
Nous nous sommes focalisés sur la membrane de L. pneumophila puisque la
warnéricine RK et la δ-hémolysine sont des peptides dont l’activité est dirigée contre la
membrane. Cependant, la warnéricine RK doit traverser la membrane externe ainsi qu’une
fine couche de peptidoglycane avant de pouvoir interagir avec la membrane interne. Il est
possible que certains éléments de ces structures soient impliqués dans l’activité du peptide.
Des analyses pourraient être entreprises afin de vérifier cette hypothèse en testant des mutants
déficients au niveau du LPS ou du peptidoglycane ou encore en incubant un extrait cellulaire
de L. pneumophila avec la warnéricine RK pour voir avec quelles molécules elle pourrait
intéragir.
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Caractérisation et mode d’action de la warnéricine RK, un peptide anti-Legionella
194
Annexes
Caractérisation et mode d’action de la warnéricine RK, un peptide anti-Legionella
195
Caractérisation et mode d’action de la warnéricine RK, un peptide anti-Legionella
196
Résultats de l’analyse de l’expression des gènes
♦ Gènes induits
Ribosomal protein
lpp0383_rplK
lpp0384_rplA
lpp0385_rplJ 50S ribosomal
subunit protein L10
lpp0386_rplL 50S ribosomal
subunit protein L7/L12
lpp0387_rpoB
RNA
polymerase B-subunit
lpp0388_rpoC
RNA
polymerase beta' subunit
FC
50S ribosomal protein L11
50S ribosomal protein L1
50S ribosomal subunit protein L1
2,005
1,81
2,141
50S ribosomal subunit protein L7/L12
2,223
RNA polymerase B-subunit
1,502
RNA polymerase beta subunit
1,705
lpp0392_tufA2 translation translation elongation factor Tu
elongation factor Tu
lpp0393_rpsJ 30S
30S ribosomal subunit protein S1
1,257
lpp0395_rplD 50S ribosomal 50S ribosomal subunit protein L4
subunit protein L4
lpp0396_rplW 50S ribosomal 50S ribosomal subunit protein L23
subunit protein L23
lpp0397_rplB
50S ribosomal subunit protein L2
1,469
lpp0400_rpsC 30S ribosomal
protein S3
lpp0401_rplP
lpp0402_rpmC
lpp0403_rpsQ 30S ribosomal
protein S17
lpp0404_rplN 50S ribosomal
protein L14
lpp0405_rplX
lpp0406_rplE 50S ribosomal
protein L5
lpp0407_rpsN
lpp0408_rpsH
lpp0409_rplF 50S ribosomal
subunit protein L6
lpp0410_rplR 50S ribosomal
subunit protein L18
lpp0412_rpmD
50S
ribosomal subunit protein
L30
lpp0413_rplO
30S ribosomal protein S3
1,32
50S ribosomal protein L16
50S ribosomal subunit protein L29
30S ribosomal protein S17
1,457
1,364
1,345
50S ribosomal protein L14
1,406
50S ribosomal protein L24
50S ribosomal protein L5
1,625
1,551
30S ribosomal protein S14
30S ribosomal protein S8
50S ribosomal subunit protein L6
1,625
1,829
1,529
50S ribosomal subunit protein L18
1,591
50S ribosomal subunit protein L3
1,43
50S ribosomal subunit protein L15
1,617
lpp0418_rpsD
30S ribosomal subunit protein S4
1,433
Caractérisation et mode d’action de la warnéricine RK, un peptide anti-Legionella
1,452
1,358
1,275
197
lpp0419_rpoA
DNA-directed RNA polymerase alpha chain
lpp0420_rplQ 50S ribosomal 50S ribosomal protein L17
protein L17
1,508
1,491
lpp1546_lpp1546
lpp1547_rplI
lpp1548_lpp1548
lpp1549_rpsR 30S ribosomal
subunit protein S18
lpp1550_rpsF 30S ribosomal
protein S6
some similarity with Legionella 33 kDa polypeptide
50S ribosomal protein L9
membrane protein (chez Legionella Corby)
30S ribosomal subunit protein S18
1,737
1,757
1,592
1,666
30S ribosomal protein S6
1,821
lpp2703_rpmA
50S 50S ribosomal protein L27
ribosomal protein L27
lpp2704_rplU 50S ribosomal 50S ribosomal protein L21
protein L21
lpp2705_lpp2705
similar to 50S ribosomal subunit protein L25- RplY
1,512
lpp2767_rplT
lpp2768_rpmI 50S
50S ribosomal protein L2
50S ribosomal protein L35
1,758
1,436
lpp1679_rpsB 30S
lpp2761_rpsI 30S ribosomal
subunit protein S9
lpp3077_rpmH
50S
ribosomal protein L34
lpp1376_rpsA 30S ribosomal
protein S1
30S ribosomal protein S2
30S ribosomal subunit protein S9
1,578
1,393
50S ribosomal protein L34
1,973
30S ribosomal protein S1
1,986
1,463
1,906
Vitamins
lpp1180_ribD
Riboflavin Riboflavin biosynthesis protein RibD
biosynthesis protein RibD
lpp1181_ribE
Riboflavin synthase alpha chain
1,423
1,482
Complex
Carbohydrates
Metabolism
lpp1185_kdsA
lpp1186_lpp1186
KDO-8-phosphate synthetase
ORF
1,461
1,419
lpp1361_lpp1361
lpp1379_lpp1379
lpp0607_prs
lpp0867_ppsA
lpp0909_murA
Similar to dolichol-phosphate mannosyltransferase
similar to polysaccharide biosynthesis protein
Ribose-phosphate pyrophosphokinase
similar to phosphoenolpyruvate synthase
UDP-N-acetylglucosamine 1-carboxyvinyltransferase
1,646
1,405
1,487
1,282
1,307
Amino Acids metabolism
Caractérisation et mode d’action de la warnéricine RK, un peptide anti-Legionella
198
lpp1699_trpE
lpp1700_gatC
lpp1701_gatA
Anthranilate synthase
Glutamyl-tRNA(Gln) amidotransferase (subunit C)
Glutamyl-tRNA(Gln) amidotransferase (subunit A)
1,31
1,717
1,402
lpp1301_lpp1301
lpp1302_leuS
Similar to rare lipoprotein B RlpB
leucyl-tRNA synthetase
1,438
1,943
lpp1129_lpp1129
lpp1200_hisC1
Similar to guanine deaminase
1,29
Histidinol-phosphate aminotransferase (Imidazole acetol- 1,356
phosphate transaminase)
Nucleotide Metabolism
lpp1820_udk uridine kinase
lpp1821_fabI
uridine kinase (Nucleotide Metabolism;
metabolism)
similar to Enoyl-[acyl-carrier-protein] reductase
Pyrimidine 1,431
lpp1992_gmk
guanylate guanylate kinase
kinase
lpp1993_lpp1993
stress-induced protein (L. pneumophila Philadelphia, corby)
lpp0526_purH
lpp0559_lpp0559
lpp0598_sucB
1,274
1,416
1,396
similar
to
phosphoribosylaminoimidazolecarboxamide 1,329
formyltransferase and IMP cyclohydrolase
similar to adenosine deaminase
1,661
dihydrolipoamide succinyltransferase- E2 subunit
1,308
Stress proteins
lpp2552_dfp
lpp2553_radC
similar to DNA/pantothenate metabolism flavoprotein
DNA repair protein RadC
1,468
1,591
lpp2559_lpp2559
lpp2560_lpp2560
Similar to small heat shock protein
Predicted membrane protein
1,352
1,4
lpp0252_katG
peroxidase
lpp2298_lpp2298
catalase- catalase-peroxidase
Similar to alkyl hydroperoxide reductase AhpD
1,544
1,602
Energy Metabolism
lpp0920_ccmC
heme heme exporter protein CcmC
exporter protein CcmC
lpp0921_ccmD
heme heme exporter protein CcmD
exporter protein CcmD
1,502
Sid proteins
FC
lpl0189
Some similarity with SidC
Caractérisation et mode d’action de la warnéricine RK, un peptide anti-Legionella
1,478
1,707
199
lpl2385
lpp0304_sidE
Similar to SidD protein
SidE protein- substrate of the Dot/Icm system
1,735
1,783
Others
lpl1048
transcriptional regulator, ArsR family
lpl1093
Similar to plasmid maintenance system antidote protein
lpl1393
unknown
lpl1579
probable lrr-gala family type III effector protein (gala 5)
lpl1931
unknown
lpp0009_lpp0009
Similar to host factor-1 protein
lpp0024_hbp hemin binding hemin binding protein
protein
lpp0044_lpp0044
unknown
lpp0046_lpp0046
unknown
lpp0099_lpp0099
Putative secreted protein
lpp0113_polA
lpp0114_lpxD1
lpp0218_lpp0218
lpp0269_lpp0269
lpp0286_lpp0286
lpp0332_lpp0332
lpp0350_lpp0350
lpp0379_lpp0379
lpp0441_lpp0441
lpp0468_lpp0468
lpp0491_lpp0491
lpp0504_lpp0504
lpp0546_lpp0546
lpp0548_hflK
subunit HflK
lpp0561_lpp0561
lpp0581_lpp0581
lpp0604_lpp0604
FC
1,383
1,512
1,399
1,591
2,106
1,275
1,464
2,58
1,464
1,37
DNA polymerase I
1,423
similar to UDP-3-O-(R-3-hydroxymyristoyl)-glucosamine N- 1,529
acyltransferase/ Lipid A biosynthesis; third step
unknown
unknown
unknown
unknown
Ras GEF
similar to eukaryotic proteins
unknown
unknown
similar to hypothetical proteins
unknown
similar to endo-1-4-beta-glucanase (hypothetical)
protease protease subunit HflK
1,584
1,278
1,586
1,476
1,817
2,282
1,932
1,734
1,435
1,696
1,607
1,314
lpp0619_lpp0619
lpp0649_lpp0649
lpp0669_lpp0669
lpp0684_lpp0684
lpp0741_dsbD/lidC
lpp0773_lpp0773
lpp0782_lpp0782
similar to carboxy-terminal protease family protein
unknown
similar to putative transport proteins (phagosomal
transporter A)
unknown
unknown
CoA-binding domain protein
Similar to Tfp pilus assembly protein PilW
Similar to thiol:disulfide interchange protein DsbD
similar to transposase- partial
unknown
lpp0788_lpp0788
lpp0789_lpp0789
ORF hypothetical?
2,281
small ORF (145aa) zinc finger protein? VrrB? His rich 1,832
Caractérisation et mode d’action de la warnéricine RK, un peptide anti-Legionella
1,431
3,266
1,444
1,456
1,397
1,306
1,711
1,638
1,469
1,559
200
glycoprotein?
lpp0894_lpp0894
similar
to
oxidoreductasesdehydrogenase/reductase family
short-chain 1,421
lpp0934_lpp0934
ORF
lpp0935_prfC peptide chain peptide chain release factor 3 PrfC
release factor 3
lpp0936_lpp0936
small ORF (141aa) (60 kDa chaperonin features?)
1,442
1,485
lpp0959_lpp0959
lpp0964_lpp0964
lpp0988_lpp0988
lpp1031_lpp1031
lpp1042_lpp1042
lpp1066_lpp1066
lpp1105_lpp1105
lpp1112_lpp1112
lpp1120_map
lpp1132_lpp1132
lpp1138_lpp1138
lpp1162_lpp1162
unknown
Similar to hypothetical protein
unknown
unknown
unknown
unknown
unknown
unknown
Major acid phosphatase Map (histidine-acid phosphatase)
unknown
unknown
unknown
1,768
1,348
1,93
1,892
1,64
1,858
1,584
3,73
1,433
1,497
1,439
1,617
lpp1192_lpp1192
lpp1223_hemF
lpp1294_flaA flagelline
SAM-dependent methyltransferase
oxygen-dependent coproporphyrinogen III oxidase
flagelline
1,448
1,699
1,853
lpp1310_lpp1310
lpp1386_lpp1386
lpp1396_lpp1396
lpp1419_secA
lpp1428_bioB
synthase
lpp1452_lpp1452
lpp1507_lpp1507
lpp1515_lpp1515
lpp1522_lpp1522
lpp1572_lpp1572
lpp1623_iolG
lpp1628_lpp1628
lpp1634_lpp1634
lpp1662_lpp1662
lpp1667_lpp1667
lpp1681_lpp1681
TPR repeat protein
unknown
similar to phosphate starvation-inducible protein PhoH
Preprotein translocase- secretion protein SecA subunit
Biotin Biotin synthase
1,578
1,314
1,415
1,343
1,309
1,541
unknown
tRNA-(ms(2)io(6)a)-hydrolase(tRNA hydroxylase)
similar to pyruvate dehydrogenase- (E1 alpha subunit)
similar to eukaryotic thiamine biosynthesis protein NMT-1
2,526
1,39
1,436
1,374
similar to phosphoenolpyruvate carboxylase
similar to myo-inositol 2-dehydrogenase
similar to dimethylarginine dimethylaminohydrolase
unknown
conserved hypothetical protein
Tpr (L. pneumophila Philadelphia)
unknown
1,27
1,381
1,438
1,332
1,658
2,137
1,643
Caractérisation et mode d’action de la warnéricine RK, un peptide anti-Legionella
201
lpp1713_lpp1713
lpp1731_trxB
Thioredoxin
reductase
lpp1740_lpp1740
lpp1765_recA
lpp1771_hemB
similar to putative signal peptide peptidases
Thioredoxin reductase
1,423
1,336
unknown
RecA protein
similar to delta-aminolevulinic acid
(porphobilinogen synthase)
lpp1795_lpp1795
similar to proteins (VirK superfamilly)
lpp1801_lpp1801
SAM-dependent methyltransferase (Corby)
lpp1806_uvrD DNA helicase DNA helicase II
II
1,587
1,349
dehydratases 1,266
lpp1838_lpp1838
lpp1847_lpp1847
lpp1874_lpp1874
lpp1890_lpp1890
lpp1893_lpp1893
lpp1899_lpp1899
lpp1935_lpp1935
lpp1948_lpp1948
lpp1955_lpp1955
lpp1960_lpp1960
lpp1979_hisC2
lpp1982_secD
lpp1989_lpp1989
lpp1990_spoT
lpp2026_pal
lpp2033_lpp2033
lpp2067_lpp2067
lpp2093_lpp2093
lpp2104_lpp2104
lpp2128_lpp2128
lpp2136_lpp2136
lpp2159_lpp2159
lpp2164_lpp2164
lpp2169_lpp2169
lpp2174_lpp2174
lpp2225_lpp2225
lpp2275_lpp2275
lpp2301_mdh
dehydrogenase
lpp2310_rpoD
similar to membrane-bound lytic murein transglycosylase B
precursor
putative membrane protein
Transcription factor jumonji, jmjC
similar to type IV pilin PilA
weakly similar to endoglucanase
unknown
unknown
unknown
unknown
Similar to putative intracellular protease/amidase (legio
corby, protease)
similar to histidinol-phosphate aminotransferase
Similar to protein-export membrane protein SecD
Similar to putative endoribonuclease L-PSP
guanosine-3 -5 -bis(diphosphate) 3 -pyrophosphohydrolase
1,353
1,37
1,566
1,508
1,356
1,433
1,371
1,715
1,549
1,693
1,858
1,754
1,355
1,372
1,512
1,33
1,349
Peptidoglycan-associated lipoprotein precursor (19 kDa 1,367
surface antigen) (PPL)
unknown
1,367
Similar to conserved hypothetical proteins
1,442
similar to L. pneumophila SdeA protein
1,32
unknown
2,42
Similar to eukaryotic sphingosine-1-phosphate lyase 1
1,555
similar to polyketide synthase of type I
1,313
Similar to oxidoreductase
1,385
Similar to hemin binding protein Hbp
1,75
similar to chitinase
1,487
TPR repeat protein, protein-protein interaction
1,401
unknown
2,062
unknown
1,88
Malate Malate dehydrogenase
1,277
RNA polymerase sigma factor rpoD (Sigma-7)
Caractérisation et mode d’action de la warnéricine RK, un peptide anti-Legionella
1,478
202
lpp2331_lpp2331
lpp2376_lpp2376
lpp2458_sdbC
lpp2461_lpp2461
lpp2480_lpp2480
lpp2511_lpp2511
lpp2513_lpp2513
lpp2516_lpp2516
similar to ATP synthase A chain
Similar to Legionella vir region protein LvrA
SdbC proteins- putative substrate of the Dot/Icm system
unknown
unknown
unknown
unknown
Similar to N-hydroxyarylamine O-acetyltransferase
1,399
2,243
1,423
2,143
1,401
1,577
2,264
1,645
lpp2555_lepB2
effector protein B- substrate of the Dot/Icm secretion system
1,642
lpp2566_lpp2566
lpp2586_lpp2586
lpp2590_lpp2590
lpp2594_lpp2594
lpp2622_lpp2622
lpp2684_pepA
lpp2690_lpp2690
unknown
1,497
unknown
2,396
metal-activated pyridoxal enzyme (Legionella pneumophila 1,377
subsp. pneumophila str. Philadelphia 1)
unknown
2,967
putative membrane protein
1,54
Similar to leucine aminopeptidase
1,548
unknown
1,72
lpp2746_lpp2746
unknown
1,588
lpp2839_lepA
lpp2943_lpp2943
lpp2947_lpp2947
lpp2996_panD
lpp3022_cysK
lpp3031_lpp3031
lpp3050_lpp3050
lpp3076_rnpA
rsm
rsm
effector protein A- substrate of the Dot/Icm secretion system
unknown
unknown
similar to aspartate 1-decarboxylase
Highly similar to cystathionine beta-synthase
Similar to major outer membrane protein precursor
similar to conserved hypothetical protein
similar to ribonuclease P protein component (RNase P)
RsmY
RsmZ
1,376
2,029
1,557
1,327
1,35
1,389
1,36
1,459
2,551
2,666
Caractérisation et mode d’action de la warnéricine RK, un peptide anti-Legionella
203
♦ Gènes réprimés
Virulence proteins
FC
lpp0165_prpA
lpp0166_lvrA
lpp0167_lvrB Legionella vir region
protein
Similar to putative phage repressor
Legionella vir region protein
Legionella vir region protein
0,596
0,521
0,318
lpp0170_lvhB3 Legionella vir
homologue protein
lpp0171_lvhB4
Legionella vir homologue protein putative
type IV secretion protein
Legionella vir homologue protein putative
type IV secretion protein
Legionella vir homologue protein B5
0,313
lpp0174_lvrD Legionella vir region
protein
Legionella vir region protein
0,328
lpp0176_lvhB8 Legionella vir
homologue protein
lpp0177_lvhB9 Legionella vir
homologue protein
lpp0178_lvhB10 Legionella vir
homologue protein
lpp0179_lvhB11 Legionella vir
homologue protein
Legionella vir homologue protein
0,461
Legionella vir homologue protein
0,537
Legionella vir homologue protein
0,411
Legionella vir homologue protein
0,629
lpp0272_lpp0272
lpp0273_lpp0273
similar to membrane protein LrgB
Predicted membrane protein- similar to
conserved hypothetical protein LrgA
0,689
0,613
lpp0278_lpp0278
Similar to conserved hypothetical protein
(RND efflux membrane fusion
protein)
Nitrogen regulatory protein P-II
0,632
Similar to toxin secretion ABC transporter
ATP-binding protein
Similar to RND efflux membrane fusion
proteins
similar to outer membrane component of
multidrug efflux pump
0,298
Similar to tyrosine-specific transport protein
Similar to tyrosine-specific transport protein
0,736
0,646
lpp0172_lvhB5 Legionella vir
homologue protein B5
0,475
0,373
Transport and efflux system proteins
lpp0279_lpp0279
lpp0283_lpp0283
lpp0284_lpp0284
lpp0285_lpp0285
lpp0709_lpp0709
lpp0710_lpp0710
Caractérisation et mode d’action de la warnéricine RK, un peptide anti-Legionella
0,79
0,547
0,516
204
lpp0711_lpp0711
Putative lipoprotein- similar to other proteins
lpp0904_lpp0904
lpp0905_lpp0905
Similar to permease of ABC transporter
toluene tolerance protein Ttg2C
lpp1210_lpp1210
Similar to transcriptional regulator- MarR
family
Similar to conserved hypothetical protein
similar to transporter LysE family (threonine
efflux))
Similar to transcriptional regulator- MarR
family
Similar to conserved hypothetical protein (
hypothetical (ATPase))
0,687
Similar to potassium efflux transporter
Similar to major facilitator family transporter
Highly similar to H+-transporting ATP
synthase chain a
Similar to multidrug resistance efflux pump
Similar to efflux transporter- RND family
Predicted membrane protein- similar to
transporter
Similar to drug resistance transporter- MFS
superfamily
similar to ATPase components of ABC
transporters with duplicated ATPase
domains
Chemiosmotic efflux system C protein B
similar to sodium-proton antiporter
0,665
0,682
0,496
lpp0514_icmM/dotJ
lpp0515_icmL/dotI
icmM/dotJ
icmL/dotI
0,768
0,721
lpp0508_icmS
lpp2741_icmV intracellular
multiplication protein IcmV
lpp0763_lpp0763
icmS
intracellular multiplication protein IcmV
0,7
0,635
weakly similar to L. pneumophila IcmL
protein
0,728
Peptidase component of the HslUV protease
(Heat shock protein)
ATP-dependent hsl protease ATP-binding
subunit HslU
0,455
lpp1211_lpp1211
lpp1213_lpp1213
lpp1214_lpp1214
lpp1215_lpp1215
lpl0567
lpl1060
lpp3059_atpB
lpp0015_lpp0015
lpp0787_lpp0787
lpp1011_lpp1011
lpp1278_lpp1278
lpp1586_lpp1586
lpp2352_cecB
lpp2448_lpp2448
0,589
0,64
0,517
0,537
0,609
0,767
0,74
0,581
0,693
0,687
0,617
0,778
Icm/Dot
Protein folding
lpp0694_hslV
lpp0695_hslU
Caractérisation et mode d’action de la warnéricine RK, un peptide anti-Legionella
0,584
205
lpp0742_groES
1 kDa chaperonin (Protein Cpn1) (groES
protein) (Heat shock protein A)
6 kDa chaperonin (Protein Cpn6)(groEL
protein)(Heat shock protein B).
0,364
chaperone protein DnaJ (heat shock protein)
Chaperone protein DnaK (Heat shock protein
7) (Heat shock 7 kDa protein) (HSP7)
Heat-shock protein GrpE(HSP-7 cofactor)
0,646
0,497
similar to peptidyl-prolyl cis-trans isomerase
proteins
Similar to DnaJ-like protein
Class III heat-shock protein HtpG(molecular
chaperone)
0,648
Similar to disulfide bond chaperones of the
HSP33 family
0,67
Similar to MraZ protein (E. coli : cell
division protein MraZ )
Similar to S-adenosyl-methyltransferase
MraW
similar to cell division protein FtsL
Peptidoglycan synthetase FtsI precursor
0,677
lpp1254_lpp1254
lpp1256_lpp1256
similar to sensor histidine kinase
similar to intracellular septation protein
0,694
0,702
lpp1588_lpp1588
lpp1589_lpp1589
Similar to class-D beta-lactamase
0,419
similar to Cell division protein FtsI/penicillin- 0,447
binding protein 2
Similar to transcriptional regulator (MarR
0,363
family)
lpp0743_htpB 60
lpp2006_dnaJ
lpp2007_dnaK
lpp2008_grpE Heat-shock protein
GrpE(HSP-70 cofactor)
lpp1946_lpp1946
lpp2289_djlA
lpp1323_htpG Class III heat-shock
protein HtpG(molecular
chaperone)
lpp2870_lpp2870
0,487
0,514
0,552
0,423
Cell division proteins
lpp0974_lpp0974
lpp0975_lpp0975
lpp0976_lpp0976
lpp0977_ftsI Peptidoglycan
synthetase FtsI precursor
lpp1590_lpp1590
0,507
0,541
0,755
lpp2840_msrA
lpp2841_folP
lpp2842_ftsH
lpp2843_rrmJ
Similar to phosphoglucomutase
Dihydropteroate synthase
Cell division protease ftsH
Ribosomal RNA large subunit
methyltransferase (Cell division
protein FtsJ)
0,693
0,611
0,646
0,442
lpp2951_parB2
similar to chromosome partitioning protein
parB
0,696
Caractérisation et mode d’action de la warnéricine RK, un peptide anti-Legionella
206
Fatty acids
lpp1013_tldD TldD protein
TldD protein Suppresses the inhibitory
activity of the carbon storage
regulator (csrA)
Similar to conserved hypothetical protein
Similar to long-chain-fatty-acid--CoA ligase
0,669
similar to fatty acid desaturase
Phosphatidylglycerophosphatase A
0,664
0,798
Similar to glycerophosphodiester
phosphodiesterase
Similar to Legionella pneumophila putative
phospholipase C
0,766
lpp1894_kdsB 3-deoxy-mannooctulosonate
cytidylyltransferase
lpp1895_lpp1895
3-deoxy-manno-octulosonate
cytidylyltransferase
0,774
Similar to hypothetical protein
(tetraacyldisaccharide-1-P-4'-kinase
lpXK)
0,702
lpp0687_lpp0687
Similar to peptidoglycan GlcNAc deacetylase
proteins
Similar to soluble lytic murein
transglycosylase
Similar to periplasmic dipeptidase for D-alaD-ala dipeptidase
similar to glycosyl transferase
0,758
lpp2710_lpp2710
lpp2711_feoB
lpp2712_feoA
hypothetical gene
ferrous iron transporter B
ferrous iron transporter A
0,716
0,698
0,623
lpp2763_lpp2763
lpp2764_himA
similar to putative ferredoxin 2fe-2s protein
Similar to integration host factor- alpha
subunit
0,692
0,68
lpp0536_lpp0536
lpp2964_lpp2964
Similar to ferredoxin--NADP reductase
similar to ferredoxin component of
dioxygenase
FrgA protein (siderophore biosynthetic
protein)
0,645
0,722
lpp1014_lpp1014
lpp1015_lpp1015
lpp0618_lpp0618
lpp0795_pgpA
Phosphatidylglycerophosphat
ase A
lpp2228_lpp2228
lpp1411_lpp1411
0,637
0,67
0,69
Lipopolysaccharide metabolism
lpp0720_lpp0720
lpp2638_lpp2638
lpp0843_lpp0843
0,767
0,646
0,761
Iron metabolism protein
lpp2846_frgA
Caractérisation et mode d’action de la warnéricine RK, un peptide anti-Legionella
0,533
207
Vitamins metabolism
lpp2715_panB
similar to 3-methyl-2oxobutanoatehydroxymethyltransferas
e
similar to pantothenate synthetases
Similar to conserved hypothetical proteins
0,494
unknown
Similar to C-terminal part of NAD(P)H-flavin
reductase UbiB
Highly similar to 3-polyprenyl-4hydroxybenzoate decarboxylase
transcription termination factor Rho
0,699
0,642
GTP cyclohydrolase I
Similar to molybdopterin cofactor synthesis
protein A
similar to 5-formyltetrahydrofolate cycloligase
0,788
0,757
lpp2901_lpp2901
lpp2902_lpp2902
similar to PhoH protein
similar to guanosine monophosphate
reductase GuaC
0,67
0,635
lpp1647_purC
Phosphoribosylamidoimidazolesuccinocarboxamide synthase
similar to IMP dehydrogenase/GMP
reductase
similar to Adenylate cyclase 1(ATP
pyrophosphate-lyase 1;
Adenylylcyclase 1)
similar to ribonucleoside-diphosphate
reductase- alpha subunit
similar to N-terminus of Diadenosine
tetraphosphate (Ap4A) hydrolase
0,758
lpg0691
lpg2024
Lph3025.1
transcriptional regulator, XRE family
0,781
0,696
0,661
0,683
lpp2716_panC
lpp2717_lpp2717
lpp2999_lpp2999
lpp3000_lpp3000
lpp3001_ubiD
lpp3002_rho transcription
termination factor Rho
lpp2814_folE
lpl0804
lpp0643_lpp0643
0,6
0,748
0,69
0,518
0,658
Purine Metabolism
lpp1688_guaB
lpp1704_lpp1704
lpp1738_rir1
lpp0494_lpp0494
0,739
0,697
0,686
0,668
Others
lpg0691
lpg2024
lpg2416
lpg2914
Caractérisation et mode d’action de la warnéricine RK, un peptide anti-Legionella
208
lpg2920
0,792
lpg2921
nucleotidyltransferase substrate binding
protein
DNA polymerase, beta domain protein region
lpl0145
lpl0172
Similar to cytosine-specific DNA methylase
unknown
0,757
0,497
lpl0211
lpl0212
Similar to hypothetical protein
Similar to putative aminotransferase
0,569
0,603
lpl1041
lpl1051
Similar to putative lipoprotein
Hypothetical protein
0,668
0,733
lpl1083
lpl1084
hypothetical transcriptional regulatory protein
Similar to DNA-damage-inducible protein J
0,644
0,657
lpl1588
lpl2035
0,624
0,756
lpl2284
lpl2354
Weakly similar to stability protein StbE
putative signal-transduction protein with CBS
domains
Similar to C-terminal part of transposase
unknown
lpl2489
lpl2490
lpl2491
Similar to conserved hypothetical protein
Similar to conserved hypothetical protein
Similar to hypothetical protein
0,605
0,548
0,582
lpl2837
lpl2847
0,739
0,743
lpl2875
lpp0020_lpp0020
CRISPR-associated protein Cas1
nucleotidyltransferase substrate binding
protein, HI0074 family
unknown
Putative integral membrane protein
lpp0025_rcp
lpp0026_lpp0026
Rcp protein
similar to amino acid permease
0,725
0,77
lpp0034_lpp0034
lpp0035_lpp0035
unknown
Similar to conserved hypothetical protein
0,762
0,733
lpp0053_lpp0053
lpp0055_lpp0055
lpp0056_lpp0056
putative membrane protein
transferase enzyme
unknown
0,695
0,422
0,418
lpp0061_lpp0061
lpp0084_lpp0084
lpp0108_lpp0108
Similar to glutaredoxin
unknown
Highly similar to ribose 5-phosphate
isomerase RpiA
Similar to conserved hypothetical protein
0,385
0,722
0,707
lpp0121_lpp0121
Caractérisation et mode d’action de la warnéricine RK, un peptide anti-Legionella
0,779
0,662
0,777
0,704
0,701
0,754
209
lpp0138_lpp0138
lpp0139_lpp0139
similar to cytochrome c4
Similar to GTP-binding protein
0,768
0,767
lpp0146_dapB
similar to dihydrodipicolinate reductase
proteins
0,748
lpp0221_lpp0221
0,583
lpp0222_lpp0222
Similar to type I methionine aminopeptidase
proteins
Similar to conserved hypothetical protein
lpp0229_lpp0229
lpp0244_htpX
lpp0261_lpp0261
peptide chain release factor
Similar to protease heat shock protein
Similar to conserved hypothetical protein
0,572
0,384
0,74
lpp0317_lpp0317
lpp0320_rhlE
unknown
similar to ATP-dependent RNA helicase
RhlE
unknown
Weakly similar to chromate transport protein
putative lipopeptide
N-formylglutamate amidohydrolase
unknown
0,685
0,698
lpp0523_citA/tphA proline/betaine
transport protein homolog
proline/betaine transport protein homolog
0,735
lpp0578_lpp0578
Weakly similar to eukaryotic phytanoyl coA
dioxygenase
unknown
0,639
unknown
similar to suppressor of groEL
polyhydroxyalkonate synthesis repressor,
PhaR
transferase
Similar to conserved hypothetical protein.
Predicted membrane protein.
Similar to hypothetical protein- predicted
membrane protein
0,774
0,557
0,74
unknown
0,645
lpp0340_lpp0340
lpp0369_lpp0369
lpp0432_lpp0432
lpp0444_lpp0444
lpp0501_lpp0501
lpp0579_lpp0579
lpp0583_lpp0583
lpp0613_sugE
lpp0622_lpp0622
lpp0629_lpp0629
lpp0646_lpp0646
lpp0677_lpp0677
lpp0733_lpp0733
Caractérisation et mode d’action de la warnéricine RK, un peptide anti-Legionella
0,418
0,498
0,713
0,721
0,775
0,579
0,572
0,751
0,753
0,601
210
lpp0746_parE Topoisomerase IV
subunit B
Topoisomerase IV subunit B
0,652
lpp0916_lpp0916
lpp0943_lpp0943
unknown
unknown
0,653
0,734
lpp0956_lpp0956
lpp0957_lpp0957
unknown
unknown
0,686
0,645
lpp0991_pilO
lpp0994_aroK
Tfp pilus assembly protein PilO
shikimate kinase I
0,776
0,703
lpp1019_lpp1019
lpp1026_lpp1026
Similar to hypothetical protein
similar to putative 4-hydroxybenzoate
octaprenyltranferase
0,744
0,765
lpp1036_lpp1036
lpp1038_lpp1038
hypothetical protein
Similar to conserved hypothetical protein
0,701
0,474
lpp1086_lpp1086
lpp1087_lpp1087
lpp1088_lpp1088
unknown
Similar to putative transcriptional regulator
Similar to prophage integrase
0,61
0,547
0,665
lpp1099_lpp1099
lpp1115_lpp1115
lpp1146_lpp1146
lpp1176_pilR
unknown
Similar to circadian rhythm protein
unknown
Similar to type 4 fimbriae expression
regulatory protein PilR
0,597
0,584
0,676
0,607
lpp1241_lpp1241
Similar to conserved hypothetical protein
0,74
lpp1276_lpp1276
lpp1358_lpp1358
lpp1383_lpp1383
0,718
0,758
0,72
lpp1397_lpp1397
lpp1432_lpp1432
lpp1440_lpp1440
lpp1497_lpp1497
Similar to oxydoreductase
Similar to conserved hypothetical proteins
Tfp type 4 fimbrial pilin related signal
peptide protein domain
similar to TrpH protein
Similar to conserved hypothetical protein
weak similarity to myosin
similar to universal stress protein A UspA
lpp1651_lpp1651
similar to hypothetical proteins
0,635
Caractérisation et mode d’action de la warnéricine RK, un peptide anti-Legionella
0,793
0,618
0,575
0,782
211
lpp1707_lpp1707
lpp1711_lpp1711
lpp1714_clpB
lpp1725_fliE Flagellar hook-basal
body complex protein
lpp1736_lpp1736
lpp1784_pyrD Dihydroorotate
dehydrogenase
lpp1789_lpp1789
lpp1809_lpp1809
lpp1859_lpp1859
lpp1881_lpp1881
lpp1900_lpp1900
lpp1916_lpp1916
lpp1954_lpp1954
lpp1956_lpp1956
lpp1958_lpp1958
lpp1991_rpoZ RNA polymerase
omega subunit
lpp1998_lpp1998
lpp2041_lpp2041
lpp2048_lpp2048
lpp2066_lpp2066
lpp2141_gspA
lpp2143_lpp2143
lpp2157_lpp2157
lpp2213_lpp2213
lpp2216_ack acetate kinase
lpp2243_lpp2243
lpp2276_lpp2276
lpp2306_gcp
lpp2470_lpp2470
lpp2502_lpp2502
lpp2528_lpp2528
lpp2536_hypE Hydrogenase
expression/formation protein
HypE
similar to DNA-binding protein fis
similar to putative tRNA/rRNA
methyltransferase
endopeptidase Clp ATP-binding chain B
(ClpB)
Flagellar hook-basal body complex protein
0,766
0,74
Similar to conserved hypothetical protein
Dihydroorotate dehydrogenase
0,783
0,665
hypothetical gene
conserved lipoprotein
signal peptide predicted
Similar to conserved hypothetical protein
0,649
0,764
0,78
0,621
unknown
similar to transcription regulators
Similar to organic hydroperoxide resistance
protein
unknown
major outer membrane protein
RNA polymerase omega subunit
0,734
0,754
0,75
Predicted integral membrane protein
0,674
Similar to cold shock protein
unknown
unknown (putative domain Smc, chromosome
segregation ATPases)
global stress protein GspA
Similar to carbonic anhydrase proteins
unknown
periplasmic, osmotically inducible protein Ylike [Legionella
pneumophila subsp. pneumophila str.
Philadelphia 1]
acetate kinase
unknown
N-terminal similar to Legionella 33 kDa
polypeptide
Similar to O-sialoglycoprotein endopeptidase
Similar to MutT/nudix family protein
unknown
Similar to hypothetical protein
Hydrogenase expression/formation protein
HypE
0,374
0,768
0,623
Caractérisation et mode d’action de la warnéricine RK, un peptide anti-Legionella
0,579
0,744
0,784
0,788
0,718
0,628
0,643
0,728
0,708
0,645
0,612
0,712
0,675
0,656
0,798
0,735
0,772
212
lpp2574_lpp2574
similar to sensor histidine kinase/response
regulator
0,784
lpp2645_lpp2645
lpp2646_lpp2646
Predicted integral membrane protein
similar to rRNA methylase (sun protein)
0,731
0,721
lpp2648_def
lpp2695_lpp2695
similar to polypeptide deformylase
regulatory protein (GGDEF and EAL
domains)
0,786
0,732
lpp2720_lpp2720
probable hydrolase [Legionella pneumophila
subsp. pneumophila
str. Philadelphia 1]
RNA polymerase sigma-32 factor
0,743
lpp2721_rpoH RNA polymerase
sigma-32 factor
0,668
lpp2759_petB
Similar to ubiquinol--cytochrome c reductase- 0,704
cytochrome b
lpp2822_lpp2822
Uncharacterized BCR, YhbC family
(eucaryote like protein)
0,673
lpp2867_lpp2867
Putative membrane protein
0,751
lpp2905_lpp2905
lpp2978_lpp2978
unknown
similar to hypothetical protein
0,721
0,761
lpp2993_apaH
similar to bis(5 -nucleosyl)-tetraphosphatase
ApaH
similar to protein
similar to dimethyladenosine transferase (16S
rRNA dimethylase)
0,733
lpp3024_lpp3024
lpp3038_grlA
lpp3024
glutaredoxin-like protein
0,628
0,747
lpp3060_atpI
lpp3061_lpp3061
Similar to ATP synthase subunit i
lpp3061
0,697
0,701
lpp3065_lpp3065
lpp3068_lpp3068
similar to conserved hypothetical protein
similar to alkane monooxygenase
0,673
0,468
plpl0001
plpl0001
0,465
lpp2994_lpp2994
lpp2995_ksgA
Caractérisation et mode d’action de la warnéricine RK, un peptide anti-Legionella
0,766
0,576
213
plpl0002
unknown
0,631
plpl0033
plpl0037
plpl0033
plpl0037
0,659
0,181
plpl0039
plpl0040
plpl0041
plpl0039
unknown
plpl0041
0,549
0,695
0,483
plpl0043
plpl0043
0,38
plpl0049
plpl0050
plpl0051
plpl0052
plpl0053
plpl0049
plpl0050
unknown
plpl0052
plpl0053
0,777
0,778
0,735
0,712
0,691
Caractérisation et mode d’action de la warnéricine RK, un peptide anti-Legionella
214
Curriculum Vitae
Caractérisation et mode d’action de la warnéricine RK, un peptide anti-Legionella
215
Caractérisation et mode d’action de la warnéricine RK, un peptide anti-Legionella
216
VERDON Julien
Julien VERDON
Né le 18 Août 1983
8, rue du Père Jean Fleury, Apt 145
86000 POITIERS
France
 05.49.30.17.53
 06.80.93.09.32
E-mail : [email protected]
Adresse professionnelle:
Laboratoire Chimie et Microbiologie de l’Eau UMR CNRS 6008
IBMIG, 40 avenue du Recteur Pineau
86022 Poitiers Cedex
France
 05.49.45.37.00
E-mail : [email protected]
Formation
2009-2010 :
ATER temps complet à l’Université de Poitiers
2006-2009 :
Allocataire de Recherche (bourse ministérielle) avec monitorat au sein du laboratoire de
Chimie et Microbiologie de l’Eau (LCME) UMR CNRS 6008, Université de Poitiers
(86). Thèse financée par le biais de l’AFSSET. Directeur de thèse : Dr Yann
HECHARD. Soutenance de thèse : le 25 Novembre 2009
2005-2006 :
Master 2 en Chimie et Microbiologie de l’Eau. Université de Poitiers (86). Mention Bien
2004-2005 :
Master 1 en Biochimie, Biologie Moléculaire et Génétique. Université de Poitiers (86).
Mention Bien
2003-2004 :
Licence de Biochimie. Université de Poitiers (86). Mention Bien
2001-2003 :
DEUG (Diplôme d’Etudes Universitaires Générales) Sciences de la vie. Université de Poitiers
(86). Mention Bien
2001 :
Baccalauréat série S. Lycée Jean Monnet, Cognac (16).
Activités d’enseignement
Matières enseignées : Biochimie (métabolisme cellulaire, enzymologie), Microbiologie, Biophysique
2009 – 2010 : ATER dans le Département 64 (Biochimie) de l’Université de Poitiers. 192 h équivalent TD.
2008 – 2009 : Moniteur dans le Département 64 (Biochimie) de l’Université de Poitiers. 64 h équivalent TD.
2007 – 2008 : Moniteur dans le Département 64 (Biochimie) de l’Université de Poitiers. 64 h équivalent TD.
2006 – 2007 : Moniteur dans le Département 64 (Biochimie) de l’Université de Poitiers. 64 h équivalent TD.
VERDON Julien
Activités de recherche
▪ Depuis octobre 2006 : Doctorant en biologie
Laboratoire Chimie et Microbiologie de l’Eau, UMR CNRS 6008, Université de Poitiers, France
Titre du projet de recherche : « Caractérisation et étude du mode d’action de la warnéricine RK, un
peptide anti-Legionella. »
Sous la direction du Dr Yann HECHARD.
▪ Septembre 2005 – Juin 2006 : Stage pratique en laboratoire (Master 2)
Laboratoire Chimie et Microbiologie de l’Eau, UMR CNRS 6008, Université de Poitiers, France
Titre du projet de recherche : « Etude de la résistance de Legionella pneumophila à la warnéricine
RK, un peptide antimicrobien. »
Sous la direction du Dr Yann HECHARD.
▪ Avril 2005 – Mai 2005 : Stage d’initiation à la recherche (Master 1)
Laboratoire Chimie et Microbiologie de l’Eau, UMR CNRS 6008, Université de Poitiers, France
Titre du stage : « Étude de la formation des biofilms développés par Legionella pneumophila. »
Sous la direction du Dr. Yann HECHARD.
Compétences associées
▪ Microbiologie et culture cellulaire : culture de bactéries pathogènes ou non, culture de lignées
cellulaires adhérentes ou en suspension.
▪ Biochimie des protéines et des lipides : HPLC, spectrométrie de masse en électrospray, extraction
et purification d’acides gras et de phospholipides, GC-MS, chromatographie sur couche mince
(CCM), préparation de liposomes, cytométrie en flux, microscopie à fluorescence et confocale,
purification de protéines recombinantes.
▪ Biologie moléculaire : extraction d’ADN et d’ARN, PCR, RT-PCR quantitative, transformation
Publications scientifiques
▪ Detergent-like activity and α-helical structure of warnericin RK, an anti-Legionella peptide. Julien
Verdon, Mirjam Falge, Elke Maier, Heike Bruhn, Michael Steinert, Cornelius Faber, Roland Benz
and Yann Héchard. Sous Presse, Biophysical Journal, Volume 97 October 2009 1–8.
▪ Delta-hemolysin, an uptade on a membrane-interacting peptide. Julien Verdon, Nicolas Girardin,
Christian Lacombe, Jean-Marc Berjeaud and Yann Héchard. Peptides (Review), 2009 Apr ;
30(4):817-23.
▪ Characterization of anti-Legionella activity of warnericin RK and delta-lysin I from Staphylococcus
warneri. Julien Verdon, Nicolas Girardin, Christian Lacombe, Jean-Marc Berjeaud et Yann
Héchard. Peptides, 2008 Jun ; 29(6):978-84.
VERDON Julien
Communications aux congrès scientifiques
Communications orales
▪ Caractérisation de l’activité anti-Legionella de peptides produits par Staphylococcus warneri : la
warnéricine RK et la delta-lysine I. Julien Verdon, Jean-Marc Berjeaud et Yann Héchard. Octobre
2007. 1er Congrès National légionelles et légionelloses, Lyon, France.
▪ Detergent-like activity of warnericin RK, a specific anti-Legionella peptide. Julien Verdon,
Miriam Falge, Elke Maier, Heike Brunh, Christian Lacombe, Jean-Marc Berjeaud, Michael Steinert,
Cornelius Faber, Roland Benz et Yann Héchard. Juin 2009. Second International Symposium on
Antimicrobial Peptides, Saint Malo, France.
Posters
▪ Mode of action of warnericin RK, a unique anti-Legionella peptide. Julien Verdon, Elke Maier,
Jean-Marc Berjeaud, Christian Lacombe, Roland Benz, Michael Steinert et Yann Héchard. 23rd
meeting of the European Working Group for Legionella Infections (EWGLI). Mai 2008, Madrid,
Espagne.
▪ Membrane lipids composition affects the activity of an anti-Legionella peptide, warnericin RK.
Julien Verdon, Jérome Labanowski, Heike Bruhn, Michael Steinert, Yann Héchard et Jean-Marc
Berjeaud. 5ème congrès de lipidomique du Groupe d'Etude et de Recherche en Lipidomique
(GERLI). Octobre 2008, Compiègne, France.
▪ Mode of action of warnericin RK, a specific anti-Legionella peptide. Julien Verdon, Elke Maier,
Jean-Marc Berjeaud, Christian Lacombe, Roland Benz, Michael Steinert et Yann Héchard. The 2009
Gordon Conference on Antimicrobial Peptides. Mars 2009, Ventura, USA.
▪ Membrane composition is involved in high sensitivity to warnericin RK peptide. Julien Verdon,
Jérôme Labanowski, Tobias Sahr, Christian Lacombe, Thierry Ferreira, Carmen Buchrieser, JeanMarc Berjeaud et Yann Héchard. Legionella 2009, Octobre 2009, Institut Pasteur de Paris, France.
Animation et vulgarisation scientifique
2009 : Animation d’ateliers scientifiques (biologie) grand public, Ecole de l’ADN, Poitiers (86).
2008 : Secrétaire de l’Association ADBEP (Association des Doctorants En Biologie de Poitiers)
2008 : Rencontres avec des lycéens dans le cadre du module Action Plus de l’école doctorale ICBG
de l’Université de Poitiers. Cette action a pour but de promouvoir la Recherche auprès des lycéens.
Autres compétences
Langues étrangères : Anglais: lu, écrit et parlé (Score TOEIC : 825)
Logiciels : Word, Excel, PowerPoint, Endnote, HPCHEM, Internet
Résumé
Une souche de Staphylococcus warneri, possédant une activité anti-Legionella, a été décrite par notre
équipe en 2005. Cette souche produit plusieurs peptides, dont l’un a fait l’objet d’un dépôt de brevet en 2006
pour son activité anti-Legionella, sous le nom de warnéricine RK. Deux autres peptides actifs, nommés δhémolysine I et II, sont des hémolysines produites par de nombreuses espèces de Staphylococcus, sans activité
connue contre les bactéries. Ces trois peptides possèdent un spectre d’activité antimicrobien restreint au genre
Legionella. Afin de comprendre cette spécificité d’action, l’objectif de cette étude a été de déterminer les
propriétés biologiques et le mécanisme d’action de la warnéricine RK.
Dans la première partie de ce travail, l’étude de l’activité de la warnéricine RK et de la δ-hémolysine I a
montré que leur spectre d’activité est restreint au genre Legionella et à Bacillus megaterium. Les deux peptides
ont des activités biologiques et des caractéristiques structurales similaires, ce qui laisse penser qu’ils possèdent
un mécanisme d’action semblable.
La seconde partie de ce travail a consisté en l’étude du mécanisme d’action de la warnéricine RK.
L’approche utilisée a été d’analyser l’activité du peptide sur des membranes artificielles et naturelles. Les
résultats ont permis de mettre en évidence que la warnéricine RK est capable de perméabiliser ces membranes en
formant des canaux de taille variable. L’analyse de la structure tridimensionnelle par résonnance magnétique
nucléaire a permis de montrer que la warnéricine RK, à l’image de la δ-hémolysine, adopte une structure en
hélice α amphiphile au contact des membranes. L’ensemble des données obtenues sont en accord avec un mode
d’action detergent-like, comme proposé dans la littérature pour la δ-hémolysine.
Dans la dernière partie de ce travail, une souche de L. pneumophila résistante à l’action de la
warnéricine RK a été isolée par pression de sélection. Les travaux menés ont permis d’étudier l’impact des
modifications de l’enveloppe de L. pneumophila (sauvage vs résistant) sur l’action de la warnéricine RK et, plus
particulièrement, celles des lipides membranaires. Les travaux ont montré que les bactéries résistantes à l’action
du peptide sont enrichies en acides gras à chaîne courte et en acides gras branchés. Ces caractéristiques sont
corrélées à une fluidité membranaire plus importante.
L’ensemble des résultats obtenus a permis de montrer l’action de perméabilisation membranaire de la
warnéricine RK sur L. pneumophila. Même si la forte sensibilité de Legionella reste encore mal comprise, il
semble que celle-ci soit, en partie, due à une composition particulière de sa membrane.
Mots clés : Legionella, peptide antimicrobien, mode d’action, détergents, souche adaptée, acides
gras, phospholipides.
Abstract
A strain of Staphylococcus warneri that possess an anti-Legionella activity was described in our
laboratory in 2005. This strain produces numerous peptides, of which warnericin RK was patented in 2006 for its
anti-Legionella activity. Two other active peptides were described, δ-hemolysin I and II. They are hemolysins
produced by Staphylococcus species without known antimicrobial properties. Those three peptides display the
same spectrum of activity, restricted to Legionella and some Bacillus. In order to understand this specific action,
the aim of our study was to determine biological activities of warnericin RK and to define its mode of action.
In the first part of our study, the spectrum of activity of warnericin RK and δ-hemolysin I showed that
both peptides was active against Legionella and Bacillus megaterium. These peptides shared some biological and
structural properties, indicating that they could possess a similar mode of action.
The second part of the work was dedicated to the study of warnericin RK mode of action using both
artificial and natural membranes. Results showed that warnericin RK permeabilized membranes by forming
pores of various sizes. Tri-dimensional analysis of warnericin RK by nuclear magnetic resonance revealed a well
defined amphipatic α-helical structure in an environment mimicking membrane. Taken together, all data are
consistent with a detergent-like mode of action, as previously proposed for δ-hemolysin.
In the last part, a resistant strain of L. pneumophila to warnericin RK was isolated by selection pressure.
Modifications of membrane composition were investigated on both wild-type and resistant strains to see whether
it can affect the sensitivity to warnericin RK. Resistant bacteria were enriched in branched chain fatty acids and
short chain fatty acids. Those characteristics are related to an increase in membrane fluidity.
Finally, our study showed that warnericin RK permeabilized the membrane of L. pneumophila. Even if
the high sensitivity of Legionella is poorly understood, it seems that the particular membrane composition could
be involved in warnericin RK sensitivity.
Keywords : Legionella, antimicrobial peptide, mode of action, detergents, adapted strain, fatty acids,
phospholipids.