- Electrophorèses
Détermination de la structure primaire :
Les méthodes :
- Hydrolyse acide
- Hydrolyse enzymatique
- Combinaison hydrolyse acide et enzymatique
1- Hydrolyse acide dʼun peptide
On va partir dʼun milieu acide (HCl 6N) à une température élevée (110°C) dans des tubes
scellés pour couper les liaisons peptidiques.
Conséquences :
- Rupture de la liaison peptidique
- Destruction complète de Trp, Cys et Cystine
- Désamidation de Gln => Glu
- Désamidation de Asn => Asp
Après lʼhydrolyse on fait une analyse par chromatographie, ce qui permet de séparer tous
les aa isolés. Ce qui permet dʼavoir une idée de la composition (mais aucun sur la
séquence) du peptide.
Coupure sélective : voie chimique
Le bromure de cyanigène (BrCN), on a une coupure à droite de la méthionine, et à gauche
on a la présence dʼune homosérine lactone.
On peut aussi utiliser lʼacide de 2-nitro-5-thiocyanobenzoique, qui coupe à droite de la
cystéine.
Ou encore lʼhydroxylamine qui coupe les liaisons Asn-Gly.
Détermination de la séquence : (cʼest le code génétique qui impose la séquence)
Quatre méthodes :
- Méthode de Sanger
- Méthode dʼEdman
- Méthodes enzymatiques
- Analyse de lʼADN
2- Méthode de Sanger
Frédérick Sanger a obtenu le Noble en 1958 pour la détermination de la structure de
lʼinsuline et en 1980 pour la séquence dʼun acide nucléique.
Sa méthode :
- Marquage des fragments par lʼaction du 1-fluoro-2,4 dinitrobenzène qui va se fixer sur
lʼacide N-terminal
- Hydrolyse enzymatique de la chaine polypeptidique
- Isolement du dérivé dʼinitrobenzylé et dʼautres fragments par chromatographie
Ce qui permet lʼidentification de lʼacide aminé N-terminal.
Schéma de la méthode de Sanger