L2 de la Licence Sciences de la vie
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Travaux Dirigés de Biochimie (réactions cellulaires) - BI301 TD 1 - Cinétique enzymatique Exercice A Une enzyme catalyse la réaction suivante sur un substrat : S + H2O P et la quantité de produit formé (en µmoles de produit par tube) est mesurée en fonction du temps et pour différentes concentrations de substrat. Les résultats obtenus sont résumés dans le tableau ci-dessous. Temps (min) 2,5 5 10 15 20 20 1,8 3,6 6,2 8 9 60 4 7,8 13,5 17 19 200 6,4 12,8 25 33,8 38 300 7,2 14 29 37 S]o (mM) 1) Cinétique d’apparition de P a) Tracez les cinétiques de réaction de cette enzyme et expliquez l’allure des tracés obtenus. b) Déterminez les vitesses initiales de réaction pour chaque concentration de S 2) Courbe de Michaelis a) Tracez la représentation de la vitesse initiale en fonction de la concentration de S. Commentez cette courbe. b) Déterminez les paramètres cinétiques. 3) Tracé de Lineweaver-Burk a) Déterminez à partir de cette représentation les paramètres cinétiques. b) Comparez les valeurs obtenues avec les précédentes et commentez ces résultats. 4) Déterminez l’activité spécifique de l’enzyme ainsi que la constante catalytique. La concentration d’enzyme initiale est de 60 µM, le volume réactionnel 3 ml et le volume d’enzyme utilisé 100 µl. La masse molaire de l’enzyme est 100.000 g / mole. Exercice B L'hexokinase catalyse la fixation de phosphate sur le glucose. Pour suivre la purification de cette enzyme, on 32 mesure la fixation de phosphate radioactif provenant l'ATP marqué au P sur le glucose : glucose + ATP glucose-6-phosphate + ADP Le mélange réactionnel (1 ml) renferme toutes les substances nécessaires à la réaction. Le volume d'extrait enzymatique utilisé est de 0,1 ml. L'activité spécifique de l'ATP est de 2000 coups par minute par nmol (CPM / nmol). Les résultats obtenus sont présentés dans le tableau suivant : Temps (minutes) 5 10 15 20 25 30 40 ___________________________________________________________________________ CPM / 40 µl de mélange réactionnel 1700 3400 5100 6700 7600 7800 7800 1) Calculer l'activité enzymatique de l'extrait en unité par ml. 1 UE est la quantité d'enzyme catalysant la fixation de 1 nmol de P / minute dans les conditions expérimentales. 2) Calculer l'activité spécifique sachant que la quantité de protéine utilisée dans l'expérience est de 60 µg. -6 3) Le KM de l'enzyme vis-à-vis du substrat est de 8.10 M. Démontrer que le glucose est en quantité suffisante pour déterminer l'activité enzymatique (on admettra que, dans une cinétique enzymatique, Vmax est atteinte quand la concentration en substrat est au moins égale à 10 KM). TD 2 - Métabolisme Problème 1 : Fermentation alcoolique des levures Des levures sont incubées dans un milieu de culture contenant du glucose, et on suit en fonction du temps les paramètres suivants : a) la concentration en glucose dans le milieu. b) le contenu en ATP des cellules de levure. c) la concentration en CO2 produit par les levures. d) la concentration en éthanol produit par les levures. Les levures sont incubées dans un premier temps dans un milieu sans oxygène, puis après 20 minutes, dans un milieu oxygéné. Les résultats sont représentés en unités arbitraires (0 - 100%). 1) Commentez les résultats obtenus dans la figure ci-dessous : 14 2) On utilise du glucose dont le C1 est radioactif ( C). Sur quel produit de la réaction (éthanol ou dioxyde de carbone) retrouvera-t-on la radioactivité ? Problème 2 : Fermentation des bactéries lactiques La plupart des bactéries lactiques sont dépourvues de cytochromes. Elles peuvent dégrader le glucose par deux voies : - La voie homofermentaire ou homolactique, qui est la voie de la glycolyse. - La voie hétérofermentaire. 1) Le bilan de la voie homofermentative peut s’écrire : 1 glucose->2 acide lactique Quel est le gain net en moles d’ATP par mole de glucose consommé ? On précisera les étapes au cours + desquelles il y a consommation ou production d’ATP et de NADH+H dans cette voie homofermentative. + On donne 1 pyruvate + NADH + H -> 1 lactate. 2) La voie hétérofermentative d’une bactérie lactique comporte la séquence de réactions précisée sur le schéma ci-dessous : Le 3-phosphoglycéraldéhyde formé est transformé en lactate par une séquence de réactions commune avec celle de la voie homofermentaire. Quel est le gain net en moles d’ATP par mole de glucose consommé par la voie hétérofermentaire, lorsque cette voie donne les produits de fermentation figurant dans le bilan suivant : 1 glucose -> 1 CO2 + 1 acide lactique + 1 éthanol + Etablir le bilan en NADH + H participant aux réactions de cette voie. TD 3 - Métabolisme et couplages énergétiques Ce TD concerne 2 voies métaboliques vues dans les cours : A) la voie de synthèse des ARN. B) la voie de fermentation alcoolique. En plus de ces voies métaboliques, il faut connaitre l'existence et les réactions de trois autres enzymes : + + * La Transhydrogénase qui catalyse la réaction : NADH + NADP ↔ NAD + NADPH * La glycérol kinase qui catalyse la réaction : Glycérol + ATP ↔ Glycérol 3 P+ ADP * La glycérol 3 phosphate déshydrogénase qui catalyse la réaction : + Glycérol 3 P + NAD ↔ Dihydroxy acétone phosphate + NADH 1) Quel est le bilan métabolique de la synthèse d'un petit ARN de séquence pppApGpCpUpCpU à partir de glucose, et des bases Uracile, Adénine et Guanine ? 2) Quel est le bilan métabolique de la conversion de glucose en glycérol ? 3) Comparer ce bilan avec les bilans des conversions de glucose en Ethanol et de glucose en acétaldéhyde. Que peut-on en déduire ? 4) En vous appuyant sur les bilans métaboliques précédemment obtenus, quels pourraient les ’autres’ produits synthétisés par une cellule de levure poussant sur un milieu contenant du glucose, les bases nucléotidiques U, A, et G qui fabrique le petit ARN ‘AGCUCU’ ? 5) En déduire les transferts possibles entre les voies anaboliques et les voies cataboliques ? TD 4 - Peptides et Protéines Question 1 a) Ecrire la formule développée du peptide suivant : Lys-Val-Asp-Gly b) Calculez la masse de ce peptide. On donne : Lys =146 Da, Val =117 Da, Asp = 133 Da, Gly = 75 Da. c) Apres avoir précisé à quel groupement correspondent les pKa ci-dessous, calculez la charge de ce peptide a pH 7 : Aminoacide Lys Val Asp Gly pK1 2,16 2 ,39 1,99 2,35 pK2 9,06 9,74 9,90 9,78 pK3 10,54 3,90 Question 2 La séquence d’aminoacides d’un peptide isolé du cerveau est la suivante : Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly a) Calculez la charge de ce peptide à pH 3,8; 6,3; 9,3; 10,5 et 12,5. Estimez son pHi. b) Le pHi de la Trypsine, qui est une enzyme localisée dans le suc gastrique, est d’environ 4,8. Quels groupements dissociables (et donc quels aminoacides) doivent être présents en proportions importantes dans cette enzyme ? c) Les histones sont des protéines fixées à l’ADN aux niveaux des groupements phosphate dans les noyaux des cellules eucaryotes. Quels seront les aminoacides majoritairement présents dans les histones et susceptibles de se fixer sur l’ADN ? Dans quel domaine de pH situeriez-vous le pHi de ces protéines ? Question 3 La Dynorphine, dérive de la prodynorphine (endomorphine) à la séquence suivante : Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-Arg-Arg-Ile-Arg-Pro-Lys-Trp-Asp-Asn-Gln Déterminez le pHi de ce peptide (pH 3,8 ; 10,5 et 12,5). Question 4 On sépare un mélange de lysine, glycine, alanine, isoleucine et d'acide glutamique par chromatographie échangeuse d'ions. Quel sera l'ordre d'élution des acides aminés si on utilise un tampon allant progressivement de pH 10 à pH 2 et si on utilise : a) une résine échangeuse de cations. b) une résine échangeuse d'anions. Quelle est la colonne donnant la meilleure séparation? Question 5 Représentez la structure du peptide GWYQR. Indiquez la forme ionisée de ce peptide aux pH suivants : a) pH 2 b) pH 7 c) pH 10. TD 5 - Structure des protéines Exercice 1 : STRUCTURE OF THE PLANT DEFENSIN PHD1 FROM PETUNIA HYBRIDA (PDB 1N4N) - Question 1 : décrivez la structure de cette protéine et donnez la topologie. - Question 2 : Identifiez les acides aminés qui composent le brin N-terminal représenté ci-dessous. - Question 3 : identifiez les liaisons qui stabilisent cette structure. Que pouvez-vous conclure sur l’environnement dans lequel cette protéine se trouve ? Exercice 2 - Question 1 : Décrivez les différentes vues de la structure ci-dessous. - Question 2 : Donnez la séquence primaire de l’hélice 4. - Question 3 : Comparez la séquence primaire de l’hélice 4 à celle des brins 7 et 8. - Question 4 : En vous appuyant sur la structure quaternaire, quelle hypothèse pouvez-vous faire concernant la localisation cellulaire de cette protéine ? La taille des structures secondaires impliquées est-elle cohérente avec la localisation cellulaire ? Quelle fonction pourrait avoir cette protéine ? Exercice 3 - Question 1 : Décrivez les interactions qui stabilisent cet ion. - Question 2 : L’oxygène de la chaine latérale de la Thr250 se trouve à 4,6 Å du centre de l’ion, pensez vous qu’il puisse y avoir une interaction ? Pourquoi ? - Question 3 : Quel type d’ion pourrait se trouver dans ce site ? Exercice 4 - Question 1 : Identifier le ligand. - Question 2 : Quels sont les interactions qui le stabilisent ? TD 6 - Identification d’une protéine sur gel 2D 1) Des chercheurs veulent savoir quelle est l'influence d'une substance toxique sur l'expression des protéines présentes dans le foie humain. Pour cela, à partir d'une biopsie d'un foie de patient intoxiqué, ils ont préparé un extrait et cherchent à identifier une ou plusieurs protéines présentant des variations importantes de leur niveau d'expression. a) Quel type d’expérience permettrait d’identifier de telles protéines ? b) Comment est réalisée cette expérience ? L’une des protéines (pointée par une flèche, dans le gel ci-dessous) présente des variations importantes de son niveau d'expression; il est important de pouvoir l'identifier. c) Quelle est la masse moléculaire et le pHi de la protéine pointée ? 2) A partir du fragment de gel contenant la protéine, on peut réaliser une analyse de sa composition en acides aminés par hydrolyse acide (HCl 6N, 105°C, 36 h). Le résultat de cette analyse, exprimé en pourcentage molaire, est donné dans le tableau 1. Amino acid (Da) Ala (89) Arg (174) Asn (132) Asp (133) Cys (121) Gln (146) Glu (147) Gly (75) His (155) Ile (131) % Amino acid (Da) % 6.4% Leu (131) 10.1% 6.4% Lys (146) 6.4% 0% Met (149) 0.9% 12.0% Phe (165) 2.8% 0.9% Pro (115) 6.4% 0% Ser (105) 3.7% 11.9% Thr (119) 5.5% 4.6% Trp (204) 1.8% * 1.8% Tyr (181) 3.7% 7.3% Val (117) 7.3% * Déterminé par spectrophotométrie Tableau 1 a) Après hydrolyse acide, par quelle méthode les acides aminés sont-ils séparés et identifiés ? b) Pourquoi Gln et Asn ne sont-ils pas détectés ? c) Pourquoi le nombre de résidus Trp peut-il être déterminé par spectrophotométrie et spectrométrie de masse ? Quelle sera la méthode utilisée préférentiellement après hydrolyse acide ? d) Combien de résidus Pro sont présents dans cette protéine ? 3) En utilisant cette composition, on peut interroger une banque de données (ExPASy SIB Bioinformatics Resource Portal) pour savoir quelles sont-les protéines ayant une composition semblable chez l'homme. Dans la liste reproduite ci-dessous, quel est selon vous le meilleur candidat ? Pourquoi ? The closest SWISS-PROT entries (in terms of AA composition) for the species HOMO SAPIENS: Protein pI MW Description ================================================================= AKD1_HUMAN 7.14 37377 3-oxo-5-beta-steroid 4-dehydrogenase CGC6_HUMAN 6.91 19458 Protein CGI-126 (Protein HSPC155). UBCG_HUMAN 5.20 19509 Ubiquitin-conjugating enzyme E2 G1 COXA_HUMAN 4.88 12513 Cytochrome C oxidase polypeptide Va ABE1_HUMAN 8.63 67314 ATP-binding cassette sub-family E member LOX5_HUMAN 5.51 77852 Arachidonate 5-lipoxygenase PHS3_HUMAN 6.40 96696 Glycogen phosphorylase, brain form TIE2_HUMAN 6.52 124051 Angiopoietin 1 receptor SAD1_HUMAN 6.69 72201 SAM domain and HD domain-containing MYOF_HUMAN 5.84 234709 Myoferlin (Fer-1 like protein 3). 4) La base de données nous donne ensuite la séquence de cette protéine. Cette protéine est synthétisée sous forme de précurseur (séquence ci-dessous). A partir des informations dont vous disposez, retrouvez la zone approximative de la coupure produite lors de la maturation. A partir d'un fragment de gel, les protéines peuvent être soumises à une digestion à la chymotrypsine. a) En aval de quels acides aminés la chymotrypsine clive-t-elle ? b) A combien de fragments doit-on aboutir ? Une analyse par spectrométrie de masse a permis d'isoler 8 peptides. En vous basant sur la taille des fragments produits et la séquence précédente, identifiez approximativement à quel fragment appartient chacune de ces masses. 5) A l'aide des masses des acides aminés (tableau 1), vérifiez précisément la masse du peptide que vous avez identifié comme faisant 546,57 Da. La mise en tandem de deux spectromètres de masse (MS-MS) en association avec une chambre de collision permet de fragmenter un peptide sélectionné. Le fractionnement du peptide à 546 Da donne les masses suivantes : 204,17 / 360,35 / 431,48. Toujours à l'aide des masses des acides aminés, vérifiez la séquence de ce peptide. 6) Une sensibilité accrue à certains produits toxiques a été corrélée avec la disparition en gel 2D du spot de la protéine qui vient d'être identifiée. De plus, un nouveau spot qui possède une masse apparente de 12350 Da et un pHi de 5,7 est mis en évidence. L'utilisation des banques de données n'a pas permis d'identifier cette protéine. Pourtant la spectrométrie de masse, après digestion chymotrypsique, montre que l'on retrouve les mêmes masses que dans la protéine précédente à l'exception du peptide à 1265,2 Da qui est remplacé par un peptide à 1117,2 Da. Ce peptide a pu être purifié, puis analysé par séquençage chimique et enzymatique. Sa composition en acides aminés est la suivante : Asp, Glu x 2, His, Lys, Met, Ala, Pro et Tyr. * Le dinitrofluorobenzene, qui réagit avec l’extrémité N-terminale des peptides, donne un dérivé DNP-Asp (Réaction de Sanger). * La digestion à la trypsine (qui clive en aval des acides aminés basiques) donne deux peptides qui sont séparés et purifiés. La composition en acides aminés est déterminée; elle est donnée entre parenthèses. La charge nette de chacun des peptides est estimée par simple électrophorèse à pH 6,4 : Peptide 1 : (Lys, Asp, Glu, Met, Ala). Neutre à pH 6,4. Peptide 2 : (His, Glu, Pro, Tyr). Positif à pH 6,4. * On a obtenu pour ce peptide un dérivé DNS-His par dansylation (qui réagit avec l’extrémité N-terminale des peptides). On a également trouvé que la séquence Pro-Tyr était C-terminale. Représentez l'électrophorégramme obtenu avec les peptides 1 et 2. * La digestion au bromure de cyanogène, qui clive après la méthionine, donne aussi deux peptides qui sont séparés et analysés : Peptide 3 : (Asp, Ala, Met). Neutre à pH 6,4. Peptide 4 : (Lys, His, Glu 2, Pro, Tyr). Positif à pH 6,4. Déduire la séquence probable du peptide A. TD7 - Purification d’une protéine Protocole de purification de CAB-48, une « Calcium Binding protein » cérébrale d’environ 48 kDa. A) Première étape de purification : Chromatographie échangeuse d’ions (IEX : Ion Exchange Chromatography). Un extrait de tissus cérébral de bovin est mixé dans un tampon 40 mM Tris pH 7,5. Le broyat est ensuite centrifugé à 100.000g et le surnageant déposé sur colonne Sephadex DEAE (DEAE= DiethylAminoEthyl) préalablement équilibré avec 2 CV (CV : Column Volume) de tampon 40 mM Tris pH 7,5. La colonne est ensuite lavée avec 3 CV de tampon de lavage (40 mM Tris pH 7,5, 25mM NaCl). L’élution se fait par un gradient de sel sur 6 CV, le chromatogramme est représenté figure 1. Afin de déterminer dans quelle fraction est éluée CAB-48, l’activité fixatrice de calcium est testée sur l’ensemble des fractions. La mesure se fait par radioactivité et est exprimée en cpm (counts per min). On donne 1 CV = 30 mL, et le volume de chaque fraction = 1 mL. - Question 1 : Expliquez l’utilité des différentes étapes réalisées (centrifugation, équilibration, lavage, gradient de sel). - Question 2 : Définissez et déterminez la phase fixe et la phase mobile - Question 3 : Donnez l’activité fixatrice de calcium, l’absorbance et la molarité en sel des pics I, II et III. Qu’est ce qu’on mesure avec l’absorbance ? Pourquoi est-elle mesurée à 280nm ? - Question 4 : Puisque CAB-48 est retenue sur la colonne, que peut-on déduire de son pHi ? - Question 5 : Classez les pHi des protéines éluées dans les pics I, II et III du plus acide au plus basique. B) Deuxième étape de purification : Size Exclusion Chromatography (SEC) ou Gel Filtration. Des études précédentes ont montrées que le broyat cérébral de bovin contenait une autre protéine fixatrice de calcium, la calmoduline, et que celle-ci s’éluait à une concentration en sel d’environ 0,21 M. - Question 1 : Quelles fractions allez-vous utiliser pour déposer sur la chromatographie gel filtration ? Le type de colonne utilisée est une HiLoad™ Superdex™ 75 16/60 (GE Healthcare). Caractéristiques de la colonne : Matrice : Dextran-Agarose Taille moyenne des billes : 34μm Diamètre de la colonne : 16mm Hauteur de la colonne : 60cm 3 4 Gamme de séparation des protéines globulaires : 3.10 à 7.10 Da - Question 2 : Calculez le volume total (Vt) de la colonne ? Calibration de la colonne : - Question 3 : Pourquoi les protéines 4 et 5 ne sont pas séparées. A partir de ces résultats, déterminez le volume mort de la colonne (V0). Déduisez en le volume de la phase stationnaire. - Question 4 : Tracez la courbe de calibration de cette colonne Kav = f (Log MW) Kav = (Ve-V0) / (Vt-V0) Les fractions provenant de l’échangeuse d’ions correspondantes à CAB-48 ont été regroupées. Un échantillon de 10 μl est prélevé pour dépôt sur gel SDS-PAGE, le reste est injecté sur la colonne gel filtration. La figure 2 cidessous présente le chromatogramme de l’élution de la colonne gel filtration. Comme dans l’étape précédente, l’ensemble des fractions est testé pour déterminer où se trouve l’activité fixatrice de calcium. - Question 5 : Déterminez les masses molaires des pics a, b et c. Que pouvez-vous déduire ? C) Troisième étape de purification : Analyse sur gels. Les fractions prélevées après l’IEX et celles des pics b et c de la gel filtration sont déposées sur gel SDS-PAGE (Figure 3). - Question 1 : Que signifie SDS-PAGE ? A quoi sert le SDS ? - Question 2 : Quels résultats vous apportent ce gel. Une focalisation isoélectrique (IEF : Isoelectric Focusing) est réalisée sur les fractions contenant CAB-48 (Figure 4). - Question 3 : Quels résultats complémentaires vous apportent IEF ?
