thèmes des rapports pour le seminaire

Le ministère de la Santé
de la Fédération de Russie
Université d'Etat de médecine d'Astrakhan
Littérature éducative
pour les étudiants
d'universités de médecine
Nikulina D.M., Kokhanov A.V., Bisalieva R.A.
PRATIQUES BIOCHIMIQUES
Partie 1
Учебно-методическое пособие для студентов,
обучающихся на французском языке
Sa traduction en russe est recommandée par l'Union d'enseignement et de méthodologie pour les universités de formation médicale et pharmaceutique en Russie et pour les étudiants en médecine.
Astrakhan – 2015
УДК 577.1(076) avec
ББК 28.902
N63
Nikulina D.M., Kokhanov A.V., Bisalieva R.A. –
PRATIQUES BIOCHIMIQUES Partie 1. – Astrakhan:
UEMA 2015. – 59 p.
La traduction et l’adaptation sont réalisées par les Professeurs du Département de biochimie, Kokhanov A.V., Bisalieva
R.A. La redaction du texte est effectuée par le traducteur Voévodina
T.I.
Le manuel contient les informations requises pour effectuer
par les étudiants de langue française le plan de travail en classe laboratoire, des séminaires et des colloques sur la chimie biologique.
Le manuel est destiné aux étudiants des universités de médecine.
Les critiques sont: A.A.Nikolaev, Professeur, docteur en médicine, chef du Departement de la chimie de l’Université d’Etat de
médecine d’Astrakhan; T.S.Kirillova, Professeur, docteur es letters,
chef du Departement des langues étrangères de l’Université d’Etat
de médecine d’Astrakhan; E.I.Kondratenko, docteur en biologie,
Professeur de Departement de la chimie biologique et thérapeutique
de la Faculté de médecine fondamentale de l’Université d’Etat
d’Astrakhan.
Publié par décision du Comité de rédaction des publications
de l'Université d'Etat de Médecine d'Astrakhan.
ISBN 978-5-4424-0101-1
 Nikulina D.M., Kokhanov A.V., Bisalieva R.A., 2014
 Астраханский государственный
медицинский университет, 2015
Tous droits réservés. Pas une part de cette édition ne peut être reproduite par aucun moyen
sans permission écrite préalable de l’éditeur.
2
REGLEMENTATION
SECURITE POUR LES ETUDIANTS
AU TRAVAIL AUX LABORATOIRES
1. Pour travailler dans des laboratoires permis aux étudiants
qui ont été orientés à travailler avec des réactifs et des biopsies.
2. Dans les laboratoires du département les étudiants ne sont
autorisés à travailler que dans une robe à manches longues. Les cheveux longs doivent être retroussés.
3. Toutes les procédures lorsque l'on travaille sur la préparation de médicaments, réactifs de dosage (leur transvasement) doivent
être effectuées uniquement dans son lieu de travail sur la table (ou
dans une hotte de laboratoire). Le chauffage des réactifs flamme nue
est produite dans une hotte spécialement équipée. Ne pas effectuer
toute manipulation des réactifs sur le sol.
4. Il est nécessaire d'être très prudent lorsque vous travaillez
avec des acides forts et les alcalis (10% et plus). Un soin extrême et
la prudence sont nécessaires lorsque l'on travaille avec les acides
concentrés et les alcalis, ainsi qu’avec d'autres substances agressives
(anhydride acétique, phénol, perhydrol et al.). Une mesure prohibée
pour ces réactifs est de les aspirer par la bouche pour éviter les brûlures chimiques de la bouche. Le dosage de réactifs nécessaires doit
se produire par siphon ou par pipette. Il faut se méfier d'obtenir ces
produits chimiques sur la peau (brûlures) et les vêtements (érosion
du tissu). Il est nécessaire de travailler avec ces substances dans des
gants de caoutchouc. Lors de la dilution des acides forts pour empêcher les projections il faut ajouter de l'acide à l'eau, et non vice versa.
5. Il est nécessaire de remplir l’alcali déversé avec du sable ou
de la sciure. Puis il faut nettoyer du sable ou de la sciure et remplir
ce lieu avec de l’acide fortement dilué (chlorhydrique, acétique).
L'acide déversé devrait être recouvert de sable (défendu d’user
sciure de bois ), puis retirez le sable avec une pelle et remplir avec
de la soude, puis retirez le bicarbonate de sodium et rincer abondamment avec de l'eau (dans des gants de caoutchouc).
6. Lorsque des tubes sont chauffés dans une flamme du brûleur l’éffervescence est possible ; le contenu peut bouillir et la libé3
ration rapide du contenu à une distance de 2 à 3 m devient possible,
ce qui est particulièrement dangereux en cas de contact avec ébullition de l'eau pulvérisée dans le visage et les yeux. Pour éviter de tels
cas, le chauffage des tubes devrait être effectué au niveau du ménisque du liquide, plutôt que vers le bas, avec rotation permanente
continue, et il faut les retirer périodiquement de la flamme. Il faut
veiller à ce que les trous des tubes n’étaient pas dirigés contre vousmême ou contre quelqu'un présent dans le laboratoire. Ne couvrez
pas la solution chaude par un bouchon jusqu'à son refroidissement.
7. Au cours de la combustion (minéralisation) des substances
organiques dans des fioles de Kjeldahl, au cours de l’hydrolyse de
protéines, de l’analyse de l'urine, lorsque l'on travaille avec du phénol, de l'anhydride acétique, du chlorure de benzol, du nitrobenzène,
de l'aniline et d'autres substances similaires des vapeurs irritantes
sont accumulées dans l'air. Tous ces travaux devraient être effectués
dans une hotte de laboratoire.
9. Ne laissez pas la lampe à alcool allumée sans surveillance.
Ne pas entreposer près du feu nu de la gaze, de l’ouate, d'alcool et
d'autres substances inflammables.
10. Lorsque vous travaillez avec la centrifugeuse vous devez
fermer bien le couvercle et verrouiller-le à serrure. La vitesse de rotation ne peut être augmentée que graduellement. N’ouvrez le couvercle qu'après un arrêt complet du rotor.
11. Travailler sur l’équipement électrique médical est permis
aux personnes ayant étudié l’ instruction sur les méthodes de travail
sûres attachée à l’appareil. Ne jamais faire fonctionner l'équipement
avec panne électrique, claquage électrique, câblage cassé qui n'est
pas mis à la terre (sauf les plaques galvaniques et des appareils à
basse tension - du réseau 24 volts). En cas de cessation de l'alimentation en courant électrique tous les appareils électriques doivent être
éteints.
12. Toutes les questions sur la sécurité du travail survenant au
cours de travaux doivent être immédiatement posées à l'enseignant
ou à son assistant.
4
CONTENU DE LA LEÇON
I. La partie théorique.
I.1. Contrôle du niveau initial de connaissances.
I.2. Discussion des principales questions sujet.
I.3. Le contrôle des tests.
II. La partie pratique.
II.1. Le travail de laboratoire.
II.2. Travail indépendant avec matériaux méthodologiques.
II.3. Traitement des résultats.
III. La partie finale.
III.1. L'analyse des résultats obtenus.
III.2. Rapport individuel sur le travail de laboratoire.
III.3. Devoirs pour la leçon suivante.
III.4. Travail individuel de l'enseignant avec ses étudiants.
MATERIAUX POUR LES ETUDES INDIVIDUELLES
I. REFERENCES
а) impératives
1. Biochimie de Harper // La traduction en langue français.
Pour l’Afrique francophone. Paris: Nouveau Horizons, 2010. - 693p.
b) supplémentaires
1. Bourin M.-C.// Carnet de révision PAES. UE1. Biochimie.
Paris: Maloine, 2011. - 779 с - 329 p.
2. Allouche S. et al. // Biochimie cours et QSM UE1. Paris:
Ellipses, 2011. - 279 p.
3. Березов Т.Т., Коровкин Б.Ф. // Биологическая химия.
М.: Медицина, 2002- 750 с.
4. Биохимия. //Под ред. Е.С.Северина. М.,Геотар-мед,
2003. - 779 с.
5. Кольман Я., Рем К.-Г. // Наглядная биохимия. М.: Мир,
2000. - 470 с.
II. RESUMES DES CONFERENCES
III. LE MATERIEL DIDACTIQUE: dossiers thématiques,
des tableaux, des placards etc.
5
CRITERES D'EVALUATION DES ETUDIANTS
L'étudiant reçoit une évaluation:
PARFAITEMENT - avec une connaissance approfondie de
la matière démontrer: a) une réponse globale; b) la théorie de la maîtrise compétente pour résoudre des problèmes logiques et les tâches
pratiques; c) la familiarité avec la littérature supplémentaire..
BIEN - avec de solides connaissances et la présentation compétente de la matière du programme, l'absence d’inexactitudes significatives dans la réponse, l'application correcte des propositions
théoriques pour aborder les questions et les défis pratiques.
SATISFAISANT – n’est reçu qu'avec la connaissance des
positions fondamentales de la matière de programme et le manque
d'assimilation de ses détails ; elles sont libellées d’une manière imprécise, une réponse insuffisamment compétente et cohérente, de la
difficulté à résoudre les problèmes.
INSATISFAISANT - en l'absence de connaissance des parties importantes de la matière il y a des erreurs significatives dans la
réponse, l'incapacité d’utiliser le matériel théorique dans la solution
des problèmes logiques.
6
SECTION PREMIERE
Processus généraux dans les êtres vivants
Partie 1. Structure, fonction et propriétés des protéines
Cours 1.
SUJET: LE RÔLE BIOLOGIQUE ET LES PROPRIÉTÉS PHYSICO-CHIMIQUES DES PROTÉINES. LES MÉTHODES DE L'EXTRACTION ET DU FRACTIONNEMENT DES PROTÉINES.
Le but éducatif:
1. Répéter les propriétés physico-chimiques et explorer les propriétés biologiques des protéines.
2. Se familiariser avec la procédure d'isolement de protéines.
3. Étudier le principe de la séparation des protéines fractionnées
par relargage.
Niveau initial de connaissances:
- Acides et bases en chimie organique;
- Propriétés chimiques du groupe carboxyle;
- Mécanisme de substitution nucléophile sur l'atome de carbone
trigonal;
-Propriétés chimiques des groupes aminés: basicité et nucléophilie;
-Structure, amphotérisation et solubilité des acides aminés(amino-acides);
- Solutions colloïdales et leurs propriétés.
Le contenu de la leçon.
I.2. Composition élémentaire des protéines.
Classification et nomenclature des acides aminés qui composent les
protéines.
Fonctions des protéines.
Propriétés physico-chimiques typiques des protéines.
Méthodes de l'isolement et de la purification des protéines.
7
II.1. Travaux pratiques: RELARGAGE DES PROTEINES
Le relargage des globulines par les sels est la précipitation
des protéines avec l’utilisation de grandes concentrations des sels
neutres: NaCl, (NH4)2 SO4 etc.
Le principe de la méthode.
La réaction de relargage dépend de la déshydratation des
macromolécules de la protéine avec la neutralisation simultanée de
la charge éléctrique. Pour le relargage des protéines différentes il
faut avoir une certaine concentration de mêmes sels. Pendant le relargage la protéine habituellement ne perd pas ses propriétés natives.
Il peut, par exemple, montrer de nouveau l'activité enzymatique. La
méthode du relargage permet d'obtenir des protéines sous forme cristalline et diviser un mélange de protéines en fractions, à savoir : des
protéines sériques en albumines (A) et globulines (G). Les globulines précipitent quand on augmente la force ionique du milieu à
l'aide de sels. En présence de 30-50 % de sulfate d'ammonium (ou de
sodium) les globulines précipitent alors que l'albumine reste en solution. Les globulines ont de grandes masses moléculaires et ils précipitent en solution demi-saturée (50%), alors que les albumines précipitent en solution saturée (100%).
Le chlorure de sodium précipite les globulines en solution saturée (100%), mais il faut acidifier la solution pour identifier (précipiter) les albumines.
Le relargage, cette réaction est réversible. Le précipité de globulines peut être de nouveau mis en solution après que la concentration de sels soit diminuée par dialyse ou par dilution dans l’eau. Pour
déterminer la protéine en solution on utilise la réaction du biuret
universelle.
Le chimisme de la réaction du biuret. Réaction du biuret révèle une liaison peptidique (-CO-NH-) dans la protéine. Dans un milieu alcalin, la solution de protéines dans la réaction avec des ions
cuivre devient bleue-violette, et les produits de son hydrolyse partielle (les peptones) –prennent la coloration rose. Les substances qui
contiennent au moins deux liaisons peptidiques sont capables de
produire la réaction du biuret. La réaction du biuret est due à la formation de complexes de biuret résultant de la combinaison des ions
du cuivre avec un groupement peptidique de la protéine. Dans un mi8
lieu alcalin des formes lactimes sont formées des formes lactame.
La réaction du biuret procède schématiquement comme suit:
H
R2 O
H R4 O
| | ||
| | ||
Cu(OH)2+2NaOH
H2N-CH-C-N-CH-C-N-CH-C-N-CH-C-N-CH- .....
| ||
| | ||
| |
R1 O
H R3 O
H R5
polypeptide (forme lactame)
R2 OH
R4 OH
| |
| |
H2N-CH-C=N-CH-C=N-CH-C=N-CH-C=N-CH- ....
| |
| |
|
R1 OH
R3 OH
R5
polypeptide (forme lactime)
R2
|
R1-HC-C=N-CH-C=N-CH-R3
| |
|
|
H2N O
O
C-ONa
||
Cu  — ―N
↑
¦
|
R4-CH
|
|
|
C -ОNа
|
||
└――― N
|
CH-R5
Les acides aminés individuels
ne donnent pas la réaction du
biuret positive. Exception:
l'histidine et l'asparagine, avec
lesquelles la réaction du biuret
se passe à condition de leur
présence en fortes concentrations en solution.
СOONa
|
CH-NH2
|
CH2
|
N
COONa
|
CH-NH2
|
CH2
N
N
Cu
N
complexe de cuivre biuret
complexe de cuivre avec l'histidine
violet
dans le cas de la réaction du biuret
REMARQUE: lors de la mise de la réaction du biuret il ne faut pas
9
ajouter un excès de sulfate de cuivre parse que le précipité bleu
d'hydroxyde de cuivre masque la couleur violette du complexe biuret protéique.
Protocole du test du biuret:
Réactifs
Tube 1
Tube 2
Suspension protéique
20 gouttes
20 gouttes
NaCl en poudre
Jusqu'à la saturation
complète de la solution
Solution saturée
(NH4)2SO4
-
20 gouttes
FILTRATION
Précipité
Globulines
Globulines
Ajouter dans le filtrat 1:
CH3COOH en
solution de 1 %
10-20 gouttes
(NH4)2SO4 en poudre
-
Jusqu'à la saturation
complète de la
solution
FILTRATION
Précipité
Albumines
Albumines
CONTROLE DE LA REACTION DU BIURET
Filtrat 2
5 gouttes
5 gouttes
10% NaOH
5 gouttes
5 gouttes
1% CuSO4
1 goutte
1 goutte
Résultats:
CONCLUSION:
III.2. Questions de contrôle.
10
1. Quels facteurs tiennent les protéines en solution?
2. De quoi dépendent les propriétés colloïdales des solutions
protéiques?
3. Pourquoi utilise-t-on les réactions de précipitation des
protéines?
4. Quelles propriétés physico-chimiques des protéines
permettent-elles de les fractionner?
5. Qu'est-ce que c'est que la précipitation des globulines par les
sels(le relargage)?
6. Comment s'appelle la réaction mettant en évidence les
liaisons peptidiques? les protéines en solution ?
7. De quelles couleurs sont les solutions protéiques et non
protéiques au cours de la réaction de biuret?
8. Notez les acides aminés individuels pour lesquels la réaction
du biuret est positive.
9. En quoi consiste la difference entre les albumines et les
globulines?
Matériaux pour l'auto-étude. I а)1. p.19-49, II, III.
Cours 2.
SUJET: L'ORGANISATION DE STRUCTURE DES MOLECULES DE PROTÉINES. LES MÉTHODES DE LA PURIFICATION DES PROTÉINES.
Le but éducatif: 1. Étudier l'organisation de structure des molécules
de protéines comme base pour le fonctionnement de toutes les protéines.
2.Se familiariser avec les particularités de la structure de protéines
fibrillaires.
3. Assimiler les procédés de purification des protéines des impuretés à l’exemple de la dialyse.
Niveau initial de connaissances:
- les acides aminés: la structure, la classification;
- les liaisons covalentes et non covalentes: les caractéristiques, les
exemples;
11
- des propriétés physico-chimiques des protéines.
Le contenu de la leçon.
I.2. La structure des protéines globulaires (la structure primaire, secondaire, tertiaire et quaternaire).
Les caractéristiques de la structure moléculaire des protéines fibrillaires.
La corrélation de la structure et la fonction des protéines.
La spécificité d’espèce de la structure primaire et les propriétés antigéniques des protéines.
Des méthodes de la purification des protéines (chromatographie,
électrophorèse, dialyse, et al.).
L'hydrolyse des protéines (les espèces, les conditions, les produits
d’hydrolyse complètete et incomplète.e).
II.1. Travaux pratiques: DIALYSE DES PROTÉINES
Le principe de la méthode.
La dialyse permet de séparer les molécules selon leur taille en
utilisant des membranes semiperméables dont les pores ont une
taille inférieure aux dimensions macromoléculaires. Ces pores laissent diffuser les petites molécules, telles que celles du solvant, des
sels, et de petits métabolites, au travers de la membrane mais
bloquent le passage de molécules plus grandes. La cellophane
(acétate de cellulose) est le matériau de dialyse le plus utilisé.
Manipulation.
Préparation du sac de dialyse: Mouiller le tube de cellophane
sous un mince filet d'eau en le frottant entre les doigts jusqu'à son
ouverture puis fermer le tube à l'une de ses extrémités par une pince.
Rincer à l'eau distillée.
Remplir le sac avec 5 ml d’une solution protéique à dialyser.
Refermer le sac de dialyse avec l'autre pince en ménageant une bulle
d'air dans le sac pour éviter son éclatement à cause du phénomène
d'osmose. Mettre le sac de dialyse dans un bécher contenant un volume minimal d'eau distillée (liquide de contre-dialyse). Après environ 1 H, faire les réactions du biuret et des chlorides. Les protéines
sont retenues à l'intérieur du sac de dialyse, tandis que les sels
traversent les pores de la membrane et apparaissent dans le dialysat à
l'extérieur du sac. Laver soigneusement le sac de dialyse et le faire
12
sécher.
А)
В)
1
2
3
Figue. 1. Variantes de l'appareil du système pour la dialyse de
protéine. А) le dialyseur au fond du cylindre de verre fait de la membrane
semi-perméable. В) le dialyseur fait du sac de collodion. 1 - le support, 2 solution dialysée, 3 - dialysat.
Protocole.
Réactifs (en gouttes)
Tube 1
(solution dialysée)
Réaction du biuret
Liquide analysé
5
NaOH en solution de 10%
5
CuSO4 en solution de 1%
1
RÉSULTATS:
Liquide analysé
HNO3 en solution de 10%
AgNO3 en solution de 1%
RÉSULTATS:
Réaction aux chlorides
10
1
1
Tube 2 (dialysat)
5
5
1
10
1
1
CONCLUSION:
III.2. Questions de contrôle.
Qu'est-ce que c'est que la dialyse?
13
Qu'est-ce que c'est que le dialysat et le liquide dialysé?
Quelles sont les réactions utilisées au contrôle de la dialyse?
Quelle est l'importance de la dialyse en médecine?
Matériaux pour l'auto-étude. I а) 1. p.26-32, 49-71; II; III.
Cours 3.
SUJET: LA CLASSIFICATION DES PROTEINES. LA CHIMIE
DES PROTEINES SIMPLES ET COMPLEXES. LES METHODES
DE LA PRECIPITATION DES PROTEINES.
Le but éducatif: 1. Se familiariser avec la classification des protéines, caractéristiques de groupes particuliers de protéines et de
peptides.
2. Maîtriser les techniques de la précipitation des protéines.
Niveau initial de connaissances:
- la structure et les propriétés des protéines;
- le rôle biologique des protéines.
Le contenu de la leçon.
I.2. Caractéristiques des groupes principaux de protéines simples.
Le principe de la classification des protéines complexes.
Caractéristiques des peptides naturels.
Le contenu des protéines et des acides aminés dans le sang dans des
conditions normales et pathologiques.
I.3. Travail de contrôle.
II.1. Travaux pratiques 1. PRÉCIPITATION THERMIQUE DES
PROTÉINES
Le principe de la méthode est basée sur la dénaturation de la
plupart des protéines pendant le chauffage de leurs solutions à une
température supérieure de 50 à 60 °C, ce qui conduit à une perte de
solubilité, en particulier au point isoélectrique.
La dénaturation est le processus par lequel une macromolécule
biologique (protéine) perd sa conformation tridimensionnelle
normale. Cette conformation tridimensionnelle est le plus souvent
nécessaire pour que les macromolécules biologiques puissent remplir
14
leur fonction. L'augmentation de la température engendre une
agitation thermique des atomes de la molécule. Celle-ci qui
provoque une rupture des interactions faibles, comme les liaisons
hydrogène, qui stabilisent la structure spatiale. Ce processus est à
l'origine de la coagulation. Les protéines sont des molécules
sensibles à leur environnment et peuvent être facilement dénaturées.
C'est à dire que leur structure peut être modifiée jusqu'au point où
elles perdent temporairement ou définivement leurs propriétés biologiques. La solubilité des protéines dans une solution aqueuse dépend, entre autres, des conditions ioniques et de pH.
En effet, si les protéines sont électriquement chargées de la
même façon, elles auront tendance à se repousser, donc à ne pas
s'aggréger. Au contraire, si elles sont électriquement neutres, cette
répulsion disparaît, et l'agrégation devient possible. On peut utiliser
ce phénomène soit en jouant sur le pH de la solution ou avec des
électrolytes. Les électrolytes employés ici sont des sels très solubles
en milieu aqueux Les cations peuvent neutraliser les charges négatives des chaînes latérales des acides aminés et les anions neutralisent les charges positives. Ces protéines neutralisées ne se repousseront plus, elles pourront s'agréger en complexes de solubilité substantiellement réduite pouvant facilement précipiter.
Presque toutes les protéines coagulent et précipitent lorsqu’elles sont chauffées dans un milieu neutre ou légèrement acide.
Dans les milieux fortement acides et alcalins les solutions de protéines sont dénaturées par ébullition, mais non coagulées et ne peuvent donner un précipité que sous l'addition d'une quantité suffisante d’un sel neutre (NaCl, le sulfate d'ammonium et d’autres.). La
stabilité de la protéine dans une solution dépend de l'acquisition de
la(+) charge dans un milieu fortement acide et de l'amplification de
la(-) charge en milieu alcalin.
Le point isoélectrique (pI) est le pH d'une solution aqueuse
dans laquelle un solide existe sous un potentiel électrique neutre. Au
point isoélectrique les protéines sont également neutres. En amenant
le pH au pI de certaines protéines, on peut donc aussi précipiter
celles-ci. Dans les deux cas, pH ou électrolytes, les protéines ne précipiteront pas toutes en même temps puisque leur pI ou le nombre et
la nature de leurs charges ne sont pas identiques. La plupart des élec15
trolytes combinent à la fois la déshydratation et la neutralisation des
protéines. Très souvent la dénaturation cause la perte de solublité
des protéines.
+H+
-H+
+
+
H3N -CH-COOH
H3N -CH-COO
H2N-CH-COO
|
|
|
R
R
R
molécule est chargé forme zwitterionique
molécule est chargé
positivement
des acides aminés
négativement
рН = 2-3
рН = 4-9
рН = 9-10
(forme bipolaire)
En abaissant le pH la dissociation du groupe carboxyle est
supprimée et la molécule se charge positivement. Avec l'augmentation du pH le proton lié d’amino-acide se détache et la molécule
acquiert une charge négative. Une précipitation plus complète et rapide se produit lorsque le point isoélectrique est atteinte. Au point
isoélectrique la charge électrique totale de la protéine est zéro, et
donc cette protéine dans un champ électrique perd la mobilité, c’
est–à-dire reste au début. Pour la plupart des protéines, le point isoélectrique correspond à un milieu faiblement acide (dans la plage de
5.5 à 6.9).
Protocole:
Réactifs (en gouttes)
Tubes
1
2
3
4
5
Blanc d'oeuf en
10
10
10
10
10
solution de 1%
CH3COOH en solu2
10
10
tion de 1%
NaCl en solution
4
saturée
NaOH en solution de
4
10%
FAIRE BOUILLIR
Réaction en milieu
Neutre Acide Acide Acide fort Basique
faible
fort + électrolyte (alkaline)
RÉSULTATS:
Ainsi la concentration en ions hydrogène, à savoir, une certaine réaction du milieu, et la présence de sels jouent un rôle impor16
tant dans la dénaturation des protéines par chauffage.
CONCLUSION:
Travaux pratiques 2a. PRÉCIPITATION DES PROTÉINES PAR
LES SELS DE MÉTAUX LOURDS
Le principe de la méthode.
La précipitation des protéines par les sels de métaux lourds,
par opposition à la précipitation des protéines avec des sels neutres
(au relargage)se produit à de faibles concentrations de sels. Les protéines interagissant avec des sels de métaux lourds (plomb, cuivre,
argent, mercure, etc.) les adsorbent en formant des composés salines
et complexes solubles dans l’excès de ces sels (à l'exception des sels
AgNO3, HgCl2), mais insoluble dans l'eau. Les sels contenant des
métaux lourds (Pb, Cu, Ag, etc.) dénaturent les protéines.
La capacité de la protéine à lier étroitement des ions métalliques lourds sous la forme de précipités insolubles dans l'eau est utilisée comme un antidote pour l'empoisonnement avec des sels de
mercure, de cuivre, de plomb et d'autres. Les protéines de lait et
d'oeufs sont utilisées d’habitude immédiatement après l'empoisonnement pendant que ces sels sont encore dans l'estomac et n’ont pas
eu le temps d'être absorbés. A la suite de l'introduction de la protéine
on fait vomir le patient pour faire sortir les restes du poison de l'organisme.
La dissolution du précipité dans l'excès de sels s’appelle la
peptisation absorbante. Ce phénomène se produit par suite de la
survenance du (+) charge de même signe sur les particules protéiques. La peptisation est le procédé responsable de la formation
d'une dispersion stable de particules colloïdales dans l'eau.
Les charges électriques présentes à la surface des particules
sont ainsi "neutralisées" et disparaissent. En réalité, la double
couche électrique existant à la surface des particules est compressée
par l'électrolyte ajouté et s'écrase à force ionique élevée. La
répulsion électrique n'empêche plus l'agglomération des particules et
17
elles peuvent former un précipité facile à filtrer. Si le précipité est
lavé avec une grande quantité d'eau distillée, la double couche
électrique présente à la surface des particules s'expand de nouveau et
la répulsion électrique réapparaît: le précipité peptise et les
particules passent encore à travers le filtre.
Protocole:
Tubes
Réactifs (en gouttes)
1
2
3
а) Blanc d'oeuf en solution
5
5
5
de 1%
CuSO4 en solution de 1%
2
Pb(CH3COO)2 en solution
2
de 5%
AgNO3 en solution de 5%
2
RÉSULTATS:
b) continuer l'expérience dans les mêmes tubes et ajouter
CuSO4 en solution de 1%
5-10
Pb(CH3COO)2 en solution
5-10
de 5%
AgNO3 en solution de 5%
5-10
RÉSULTATS:
CONCLUSION:
Travaux pratiques 2b. PRECIPITATION DES PROTEINES PAR
LES ACIDES MINERAUX CONCENTRÉS
Le principe de la méthode.
Les protéines ne sont souvent solubles qu'à l'intérieur d'une
gamme restreinte de pH. Même des concentrations modérées
d'acides peuvent induire une dénaturation et une précipitation des
protéines.
Les acides minéraux concentrés provoquent la dénaturation
des protéines pour former des sels complexes de la protéine avec
18
des acides. En cas d'excès d'acides minéraux, à l'exception de
l'acide nitrique la protéine précipitée se dissous. La réaction qualitative avec HNО3 concentré est la base pour la détermination quantitative de la protéine dans l'urine par la méthode de RobertsStolnikov-Brendberg.
Protocole:
I étape
II étape
Réactifs (en gouttes)
Tubes
1
2
1
2
HNO3 concentré
10
10
H2SO4 concentré
10
10
Solution protéique
10
10
Remarque: Ajouter doucement au acide de la suspension protéique au tube
incliné à un angle d'environ 45°.
RÉSULTATS:
CONCLUSION:
1
2
Figue. 2. Les échantillons de superposition de couches à l'acide concentré:
1 - solution de protéines; 2 - acide.
III.2. Questions de contrôle.
Quels sont les facteurs qui retiennent les protéines dans la solution?
19
Par quoi la réaction de précipitation de protéines est-elle conditionnée ?
Qu'est-ce que c'est que la coagulation des protéines? Les types de la
coagulation.
Qu'est-ce que c'est que la dénaturation des protéines? Les types de
la dénaturation.
Dans quelles conditions la coagulation avec la dénaturation; la coagulation sans dénaturation; la dénaturation sans coagulation se produisent-elles?
Qu'est-ce que c'est que la peptisation absorbante?
Comment utilise-t-on la réaction de la peptisation absorbante en médicine?
Matériaux pour l'auto-étude: I а)1. p.19-74, 662-565. II, III.
DES QUESTIONS GENERALES POUR LE TRAVAIL DE
CONTROLE SUR LA SECTION «STRUCTURE ET PROPRIETES DES PROTEINES»
1. La définition de la classe de protéines. La composition élémentaire, la plus petite unité structurelle de protéines, la masse moléculaire de protéines.
2. Classification des acides aminés qui composent les protéines sur
la base de la polarité des radicaux; des exemples des acides aminés
polaires et non polaires, chargés positivement et négativement.
3. L’amphotérisme et la solubilité des acides aminés. Les groupes
fonctionnels des acides aminés impliqués dans la formation de liaisons covalentes, ioniques, électrostatiques et hydrophobes (de Van
der Waals) de la molécule de protéine.
4. La structure et les noms des acides aminés dérivés des acides propionique, butyrique, valérique, caproïque, succinique et glutarique.
5. Structure et noms des acides aminés contenant du soufre et un
groupe oxy, des acides aminés homo- et hétérocycliques.
6. Facteurs retenant la protéine en solution. Le point isoélectrique de
la protéine. Des méthodes de la précipitation de protéines, l’ importance pour la médecine. Précipitation réversible et irréversible.
Exemples.
8. Méthodes de la détection des protéines dans la solution et de
20
l'étude de la composition qualitative de la protéine. L'hydrolyse de
protéine, des espèces de l’hydrolyse, produits intermédiaires et finaux. L'utilisation d'hydrolysats de protéine dans la pratique médicale.
9. Nommez un tripeptide, par exemple:
H3C-CH-CH2-CH-CO-NH-CH-CO-NH-CH-COOH
|
|
|
|
CH3
NH2
CH3
CH2
|
CH2-S-CH3
-CH2-CH-CO-NH-CH-CO-N
|
|
|
NH2
(CH2)3
COOH
|
CH2NH2
10. Ecrivez un tripeptide: a) valyl-glycyl-isoleucine; b) tyrosylleucyl-histidine; c) alanyl-méthionyl-tryptophane etc.
11. Protéines sont la base des processus vitaux. La valeur de travaux de Danilevsky, Fisher, Pauling dans l'élaboration des idées de
la structure des protéines. Les niveaux de l'organisation structurelle
des molécules de protéines.
12. La structure primaire et les liaisons qui la forment. La dépendance des propriétés biologiques des protéines de la nature de la séquence d'acides aminés de la chaîne polypeptidique (HbA, HbS).
13. La conformation de chaînes peptidiques dans les protéines: structures secondaires et tertiaires, les liaisons définissant ces structures.
La dénaturation réversible et irréversible de protéines; des causes, la
valeur.
14. La forme supérieure d'organisation de la molécule de protéine
c’est la structure quaternaire. Les changements coopératifs de la
conformation de protomères(à l’exemple de l'hémoglobine et de la
myoglobine).
15. La dépendance des propriétés fonctionnelles de protéines de
leur conformation. La possibilité d’interactions spécifiques («recon21
naissance») comme base pour le fonctionnement de toutes les protéines. Les propriétés antigéniques de protéines.
16. Les fonctions biologiques des protéines. Les différences de la
composition protéique des organes. Le changement de la composition protéique à l'ontogenèse et aux maladies.
17. La classification des protéines. La chimie des protéines complexes. Les représentants les plus importants des protéines simples et
complexes dans le corps humain.
18. Les protéines structurales. La classification, les caractéristiques
structurelles, la distribution tissulaire. L'auto-assemblage de structures de protéines multimoléculaires à l’exemple des fibres de collagène.
PARTIE II. ENZYMES
Cours 4.
SUJET: STRUCTURE ET PROPRIETES PRINCIPALES DES
ENZYMES
Le but éducatif: 1. Répétez la matière sur les propriétés physicochimiques des protéines.
2.Se familiariser avec des idées modernes sur la structure des enzymes, examiner leurs propriétés caractéristiques.
Niveau initial de connaissances:
- la structure et les propriétés physico-chimiques des protéines;
- le concept des catalyseurs.
Le contenu de la leçon.
I.2. Le concept de la catalyse.
La nature chimique des enzymes.
Les propriétés des enzymes.
La structure de l'enzyme (centres fonctionnels, leur structure).
Les facteurs qui déterminent l'activité des enzymes.
Les vitamines comme les coenzymes.
Le concept des isoenzymes.
Systèmes enzymatiques multimoléculaires.
II.1. Travaux pratiques 1. L’INFLUENCE DE LA TÉMPERATURE
22
SUR L'ACTIVITÉ DE L'AMYLASE SALIVAIRE
Le principe et la chimie de la méthode.
L'amylase salivaire (α-1-4 glucosidase) catalyse l'hydrolyse
des liaisons glucosidiques α-1→4 de l’amidon et d’autres polysaccharides associés pour produire du maltose et d’autres oligosaccharides. On utilise un réactif « ioduré » lugol pour visualiser la dégradation de l’amidon, le complexe coloré Iode et Polymère glucosidique est d’autant plus intense qu’il y a un taux de polymérisation
importante. L’amidon est mis en évidence par le lugol (=eau iodée)
en donnant une coloration bleue et les amylodextrines – violette,
erythrodextrines – rouge, flavodextrines et maltose – jaune.
La vitesse de la réaction est maximale pour une température
de l’ordre de 38°C; l’amidon disparait progressivement au cours du
temps, alors qu’apparaissent simultanément les sucres réducteurs; la
molécule d’amidon est un polymère de glucose. Les sucres réducteurs issus de l’hydrolyse de l’amidon seraient soit du maltose
(dioside formé de deux molécules de glucose.
Les produits finaux de l'hydrolyse de l'amidon, le glucose et le
maltose ont un groupe aldéhyde libre, et peuvent être détectés par la
réaction de Trommer, basée sur la réaction d'oxydoréduction.
Lorsqu'il est chauffé, le groupe aldéhyde est oxydé en acide
gluconique et le cuivre de l'hydroxyde de cuivre Cu (bleu) est réduit
à l'hydrate d'oxyde cuivreux (jaune). Le chauffage supplémentaire
provoque la formation de l’ oxyde cuivreux rouge:
H
O
C=O + 2CuSO4 + 5NaOН  C–O–Na + 2CuOH + 2Na2SO4 + 2H2O
R
R
Une des propriétés caractéristiques des enzymes est la thermolabilité, c’est-à-dire la sensibilité de l’enzyme à la température. Pour
de nombreuses enzymes la vitesse enzymatique maximale est observée à 38-40°C. Cette température est appelée une température optimale. Lorsque la température dépasse 70°C, ils perdent leurs propriétés de catalyseurs biologiques. Le degré d'inactivation dépend de
la durée de l'exposition à la chaleur. Le ralentissement et l’arrêt de la
réaction enzymatique sont dues à la dénaturation thermique de la
molécule protéique de l'enzyme. A basse température, les enzymes
ne sont pas dénaturés, mais la vitesse de réaction est fortement ré23
duite par l'abaissement de l'énergie cinétique des molécules. L'action
de l'enzyme est déterminée par la disparition du substrat ou l'apparition des produits de réaction.
Protocole:
On ajoute environ 2 ml de salive native(non diluée) dans un
tube et on laisse la bouillir 5 min. Laisser refroidir.
Tubes
1
2
3
10
10
10
Amidon en solution de 1%
10
Salive native diluée 10 fois
10
Salive bouillie non diluée
10
Eau distillée
Laisser tous les tubes au thermostat à 38°C et attendre 10 min.
Puis, prendre 5 gouttes du contenu de chaque tube et les verser dans les
autres tubes. a) test de l'amidon
Tubes
Réactifs (en gouttes)
1-a
2-a
3-a
5
5
5
Solution analysée
1
1
1
Eau iodée (solution de l'iodure de
potassium)
RÉSULTATS:
Réactifs (en gouttes)
b) Réaction de Trommer (test
Réactifs (en gouttes)
Solution analysée
NаОН en solution de 10%
CuSO4 en solution de 1%
RÉSULTATS:
au glucose et au maltose)
1-b
2-b
3-b
5
5
5
5
5
5
3
3
3
CONCLUSION:
TP 2. L’INFLUENCE DE LA REACTION DU MILIEU A L'ACTIVITE ENZYMATIQUE ET LA DETERMINATION DU pH OPTIMUM
Le principe et la chimie de la méthode.
Chaque enzyme a son pH optimum du milieu quand l’enzyme
est le plus actif. Ainsi l’activité de la pepsine est maximum pour un
24
milieu très acide – 1,5-2,0 (comme celui de l’estomac où elle est
secrétée), l'arginase a son pH optimum d’action plus alcalin– 9.9
(enzyme du foie). L’amylase salivaire a le pH optimum – 6,8-7,2.
Au milieu acide et alcalin son activité diminue grace à l’interaction
de la molecule protéique avec des ions de la solution.
La chimie de la réaction voir ci-dessus (TP. 1).
Protocole:
Il faut diluer la salive 10 fois. Prendre 5 tubes et préparer les
mélanges selon le tableau(on prend toutes les solutions.en gouttes)
Tubes
Réactifs (en gouttes)
1
2
3
4
5
Solution 1
5
5
5
5
5
Solution 2
8
6
5
3
1
NaCl en solution de 10%
7
9
10
12
14
рН
5,8
6,9
7,4
7,9
8,5
Amidon en solution de
7
7
7
7
7
0,5%
Salive diluée
7
7
7
7
7
Mélanger, laisser tous les tubes au thermostat à 38°C et attendre 10 min.
Solution d'iode
1
1
1
1
1
Coloration
Produits d'hydrolyse de
l'amidon
CONCLUSION:
TP 3. SPECIFITE D'ACTION DE L'AMYLASE SALIVAIRE
Le principe de la méthode.
Les enzymes ont une spécifité d'action. Un enzyme ne catalyse
qu’un seul type de réaction chimique. .Les enzymes se distinguent
par leur haute spécificité: la spécificité absolue :il catalyse une
seule réaction de transformation d’un substrat bien determiné; la
25
spécificité rélative –l’ action sur une certaine liaison chimique,
n’influençant pas la structure chimique du substrat ; la spécificité
stéréochimique – exprimée par rapport au mode d’arrangement des
atomes dans la molécule du substrat. Elle est déterminée par le fait
que seuls certains groupes fonctionnels strictement définis qui composent les enzymes peuvent être impliqués dans la formation de
complexes enzyme-substrat.
L'amylase salivaire accélère uniquement l'hydrolyse de polysaccharides sans produire effet sur des disaccharides. La maltase de
la salive accélère l'hydrolyse du disaccharide du maltose et n'a aucun
effet sur le saccharose.
La chimie de la réaction voir ci-dessus (TP. 1).
Protocole:
Réactifs (en gouttes)
Tube 1
Tube 2
Salive diluée 1:5
5
5
Amidon en solution de 1%
10
Saccharose en solution de 1%
10
Laisser tous les tubes au thermostat à 38°C et attendre 10 min.
Réactif de Fehling
9
9
Chauffer les tubes au bain-marie et laisser les bouillir 1 min.
RÉSULTATS:
CONCLUSION:
III.2. Questions de contrôle.
Comment et pourquoi l'activité enzymatique dépend-elle de la témperature?
Qu'est-ce que c’est que l'optimum de la témperature des enzymes?
Comment et pourquoi l'activité enzymatique dépend-elle du pH du
milieu?
26
Quels enzymes sont actifs au milieu acide, alcalin, neutre?
Qu'est-ce que c’est que la spécificité d'action des enzymes?
Notez les types de spécificité des enzymes.
Exemples
Indiquez la réaction qualitative à l'amidon.
Matériaux pour l'auto-étude: I а)1. p.44-49, 114-129, II; III.
Cours 5.
SUJET: LE MÉCANISME DE L'ACTION DES ENZYMES. LA
CINÉTIQUE DES RÉACTIONS ENZYMATIQUES.
Le but éducatif: Se familiariser avec les concepts modernes du mécanisme d'action des enzymes et la cinétique des réactions enzymatiques.
Niveau initial de connaissances:
- la nature protéique des enzymes;
- la structure des enzymes complexes;
- la structure de la molécule d'enzyme;
- la cinétique des réactions chimiques.
Le contenu de la leçon.
I.2. Des vues modernes sur le mécanisme d'action des enzymes (hypothèse de Fisher, de Koshland).
Catalyse multifonctionnelle.
Les cinétiques de réactions enzymatiques. Constante de Michaelis.
La dépendance de l'activité des enzymes de divers facteurs.
Détermination de l'activité enzymatique: principes, la valeur en médecine.
II.1. Travaux pratiques 1. L’ACTIVITÉ DE LA α-AMYLASE SALIVAIRE.
Le principe de la méthode.
La méthode est fondée sur la définition de la plus petite quantité d’amylase (à la dilution maximale de la salive), désagrégeant
entièrement tout l'amidon ajouté. L'activité d’amylase de la salive
27
s'exprime par la quantité (en ml) de l'amidon en solution de 0,1 %
qui se désagrège par 1 ml de la salive non diluée à la température
38ºC pendant 30 minutes. L'activité normale de l’amylase est 160
- 320. L'activité de l’amylase est désignée А 38º/30'. Cette méthode
est utilisée largement pour la définition de l'activité d’amylase du
sang et de l'urine.
Protocole:
Dans chaqun des 10 tubes verser 1ml d'eau. Au 1-er tube
ajouter 1 ml de salive diluée 10 fois. Mélanger plusieurs fois le contenu du tube, en rétractant et en faisant sortir le liquide de la pipette.
Prendre à la pipette 1.0 ml de mélange et le transférer à la 2-ème tube.
Mélanger aussi le contenu et transférer1.0 ml à la 3-ème tube etc.
jusqu'au 10- ème tube. De la 10-ème tube il faut déverser 1.0 ml du
mélange.
1 ml de salive
1 мл смеси
1 ml d'eau
I
II
III
n
Figue. 3. La dilution de la salive
À tous les tubes ajouter 1.0 ml d'eau et 2.0 мл d'amidon en
solution de 0.1 % en secouant, mélanger et placer au thermostat à
38º pour 30 minutes. Après l'incubation refroidir les tubes par l'eau
de robinet, ajouter par une goutte de l'iode en solution de 0.1 % et
mélanger. Marquer la coloration dans chaque tube et en se servant
du tableau de la solution faire le calcul.
Le calcul: marquer le tube où l'hydrolyse de l'amidon a passé
entièrement à la plus petite quantité de l’enzyme et par la quantité de
28
la salive non diluée (A) dans ce tube calculer l'activité d’amylase
(X) comme suit :
A ml de la salive ont désagrégé 2,0 ml de l'amidon en solution
de 0,1 %.
1 ml de la salive a désagrégé Х ml de la solution de l'amidon.
Dans le 3-ème tube, par exemple, А = 1/ 80 ml.
1
2
3
4
Tubes
5 6 7
8
9
10
La dilution de la
salive
La coloration de
la solution avec
de l'iode
CONCLUSION:
TP 2. L’ACTIVITÉ DE L’AMYLASE (LA DIASTASE) DE
L’URINE
Le principe de la méthode.
La méthode est fondée sur la définition du temps nécessaire à
la désagrégation complète de l'amidon en présence d’un ml
d'urine. Conventionnellement pour l'unité de l'activité d’amylase de
l'urine on prend la quantité de l’ enzyme désagrégeant 2 mg de l'amidon en 15 minutes. On exprime l'activité d’amylase par la quantité
d'unités à 1 ml de l'urine. Normalement elle fait 1-2 unités, et selon
la méthode de Vol'gemout elle hésite de 16 à 64 unités.
L'urine des gens saines a l'activité basse d’amylase en comparaison avec le ferment amylolytique de la salive. La définition de
l'activité de l’-amylase dans l'urine et le sérum du sang est utilisée
largement dans la clinique au diagnostic des maladies du pancréas.
Aux premiers vingt-quatre heures de la maladie l'activité d’amylase
augmente dans l'urine et le sérum du sang en dizaines de fois, et
puis revient graduellement à la norme. À l'insuffisance rénale
l’amylase manque dans l'urine.
En enfance l'augmentation de l'activité d’amylase est observée
à la parotidite endémique ce qu'indique la lesion simultanée du pan29
créas par le virus de parotidite. Le virus de grippe frappe aussi le
pancréas, mais plus rarement.
Protocole:
Sur la boîte de Pétri sèche verser goutte à goutte dans de différentes places une goutte de l'iode dans la solution de l'iodure du potassium de 0.1% (en tout 8-10 gouttes). Verser dans un tube 2 ml
de l'amidon en solution de 0,1 % contenant 2 mg d'amidon, 1 ml de
chlorure de sodium en solution de 0,85 % et placer le tube au thermostat à 37ºC pour 2 minutes. Dans 2 minutes ajouter au tube 0,5
ml de l'urine, mélanger et marquer le temps du début de la réaction.
Puis toutes les 2-3 minutes transférer une goutte du mélange du tube
sur la boîte de Pétri dans une goutte de la solution de l'iode jusqu’à
l'apparition de la coloration jaune (ou incolore) et marquer le temps
de la réaction en minutes. L'activité de l’amylase de l’urine calculer
selon la formule:
15
Х=
Т ∙ 0,5
oú X – l’activité de l’amylase dans 1 ml de l’urine;
15 - le temps nécessaire pour la désagrégation complète de 2
mg d'amidon en minutes;
0,5 - la quantité de l'urine prise au mélange réactionnaire à ml;
T - le temps de la réaction en minutes.
RÉSULTATS:
CONCLUSION:
III.2. Questions de contrôle.
L'amylase quelle réaction catalyse-t-elle?
Indiquez les produits intermédiaires et finis de l’hydrolyse de
l'amidon.
Quel est le niveau normal de la diastase de l'urine(urinaire)?
Quelles maladies provoquent l’augmentation de l'activité de la dias30
tase urinaire (chez les adultes et les enfants)?
Quand l'amylase manque-t-elle dans l'urine?
Écrivez la formule des vitamines В2 et PP, indiquer les co-enzymes
appropriées.
Matériaux pour l'auto-étude: I а) 1. p.129-139, 143-152; II; III
Cours 6.
SUJET: LA REGULATION DE L'ACTIVITE DES ENZYMES.
LA CLASSIFICATION, LA NOMENCLATURE ET L'UTILISATION PRATIQUE DES ENZYMES.
Le but éducatif: Se familiariser avec les méthodes de régulation des
enzymes in vivo, les principes de caractéristique quantitative, la
classification, la nomenclature des enzymes, leur application en médecine.
Niveau initial de connaissances:
- la structure de l'holoenzyme;
- la spécificité de l'action enzymatique;
- le mécanisme de la formation du complexe enzyme-substrat;
- la dépendance de l'activité enzymatique de divers facteurs.
Le contenu de la leçon.
I.2. Des facteurs régulant l'activité des enzymes in vivo.
L'activation des enzymes, ses types.
Lest types d'inhibition de l'enzyme.
Les classes d'enzymes, des exemples.
La nomenclature des enzymes.
Les sections d'enzymologie médicale, des exemples.
Les enzymes immobilisées.
Les enzymes du plasma sanguin.
II.1. TP 1. L'INFLUENCE DES ACTIVATEURS ET DES INHIBITEURS SUR L'ACTIVITE D’AMYLASE DE LA SALIVE.
Le principe et la chimie de la méthode.
Les activateurs stimulent l'action des enzymes, mais ne participent pas à la réaction. Les activateurs de certains enzymes : pour
l’amylase de la salive c’est le chlorure de sodium ; pour la pepsine
31
ce sont les ions H+ d’acide chlorhydique; pour la lipase ce sont les
acides biliaires; pour l’adenosinetriphosphatase ce sont Мg++, Mn++.
Les inhibiteurs freinent l'action des enzymes jusqu'à l'arrêt
complet de la réaction. Les inhibiteurs sont souvent les produits des
réactions intermédiaires ou finales de quelque procès biochimique.
Des exemples d'inhibiteurs: DFP (diisopropyl-fluorophosphate) pour la cholinestérase et la trypsine; acide cyanhydrique - pour la
cytochrome oxydase; l'acide malonique - pour la succinate déshydrogénase; sulfate de cuivre - pour l'amylase salivaire.
Les activateurs et les inhibiteurs changent l'activité de
l’enzyme, en influençant son site actif ou allostérique.
La chimie de la réaction voir ci-dessus (TP. 1) (cours 4).
Protocole:
Tubes
Réactifs
1
2
3
Salive – 1:40 (en ml)
1
1
1
Н2О
2
NaCl en solution de 1%
2
CuSO4 en solution de 1%
2
Amidon en solution de 1%
5
5
5
Incuber à la température ambiante 2 min
Solution d'iode
1
1
1
Н2О (en ml)
2
2
2
RÉSULTATS:
CONCLUSION:
III.2. Questions de contrôle.
Indiquer le rôle d'activateurs et d'inhibiteurs de la réaction enzymatique.
Quelles substances peuvent agir comme inhibiteurs et activateurs des
enzymes?
Indiquez le contenu normal de l'amylase dans le sang.
Indiquez la signification clinique de la détermination de la diastase
32
de sérum sanguin.
Qu’est-ce qui est l’ inhibiteur de l'amylase salivaire?
Qu’est-ce qui est l’ activateur de l'amylase salivaire?
Matériaux pour l'auto-étude: I а)1. p.152-168, 579-580; II; III.
COLLOQUE SUR LA SECTION "ENZYMES"
Questions au Colloque
1. L'histoire de la découverte et de l'étude des enzymes. La valeur
des travaux de Pasteur, Manasseine, Buchner, Sumner fait à établir
la nature des enzymes.
2. La similitude (la différence) des enzymes et des catalyseurs inorganiques.
3. Caractéristiques générales des enzymes. Le rôle biologique des
enzymes et la place de l’enzymologie en biologie et médecine.
4. La nature chimique des enzymes. Les enzymes simples et complexes.
5. La structure des enzymes. Le concept de centres actifs et allostériques.
6. Le concept de co-facteurs, co-enzymes et groupements prosthétiques. La structure chimique et la fonction de co-enzymes.
7. Isoenzymes comme un exemple de polymorphisme biochimique.
8. Systèmes enzymatiques multimoléculaires. Les enzymes immobilisés.
9. Fondements de la cinétique enzymatique. Constante de Michaelis.
10. La dépendance de l'activité enzymatique de la température.
Comment déterminer expérimentalement la thermolabilité des enzymes?
11. La dépendance de l'activité enzymatique du pH. Comment détecter cette dépendance à l'expérience?
12. La dépendance de la vitesse de réaction de la concentration de
l’enzyme et du substrat.
13. La spécificité de l'action des 'enzymes. La complémentarité de la
structure du substrat et du site actif de l'enzyme. Espèces de la spécificité des enzymes.
14. La structure des enzymes allostériques. Transition allostérique.
33
15. Les théories de l'action d'enzymes comme catalyseurs biologiques.
16. La théorie moderne de la catalyse enzymatique. Des idées sur le
mécanisme d'action des enzymes.
17. La catalyse multifonctionnelle. Acido-basique (électrophilenucléophile) catalyse.
18. Le réglement de l'action enzymatique.
19. L'activation des enzymes. Types d'activation. Proenzymes.
20. L'inhibition des enzymes. Inhibiteurs réversibles, irréversibles et
compétitifs. Inhibiteurs comme les médicaments.
21. Principes de la détermination quantitative d'enzymes. Les unités
d'activité et de la quantité enzymatiques. Mesure de l'activité enzymatique à des fins de diagnostic.
22. Enzimopathies: héréditaires (primaires), secondaires. Les
troubles métaboliques aux cas de l’alcaptonurie, la phénylcétonurie,
la hyperammoniémie et autres.
23. Les différences de composition enzymatique des organes et des
tissus. Les enzymes organospécifiques. Les enzymes du plasma sanguin.
(Modification
de
la
composition
enzymatique
à l'ontogenèse).
24. Classification et nomenclature des enzymes.
25. Le concept du enzymodiagnostic et de la enzymothérapie
PARTIE III. INTRODUCTION AU METABOLISME ET
DE L'ENERGIE. BIOCHIMIE DE LA NUTRITION
Cours 7.
SUJET: LA CLASSIFICATION, LA STRUCTURE ET LE ROLE
BIOLOGIQUE DES VITAMINES. LES METHODES DE LA DEFINITION DES VITAMINES
34
Le but éducatif: Comprendre le rôle des vitamines dans le métabolisme, leur classification, la caractéristique des représentants de
chaque classe des vitamines.
Niveau initial de connaissances:
- les notions générales des vitamines, leur signification biologique;
- les symptômes de certaines hypovitaminoses;
- les voies de l’entrée dans le corps humain.
Le contenu de la leçon.
I.3. Travail de controle.
DES QUESTIONS GENERALES AU TRAVAIL DE CONTROLE SUR LA SECTION "LES VITAMINES"
1. L'histoire de l'étude de vitamines. La contribution des savants nationaux.
2. Définition de la classe "Vitamines", fonctions de vitamines,
leur participation dans le métabolisme.
3. Classification des vitamines, des symboles, dénominations
empiriques.
4. Les vitamines liposolubles: rôle biologique, sources, formules de vitamines A et D3.
5. Les vitamines solubles dans l'eau: rôle biologique, sources,
formules de vitamines В1, В2, В3, В6, РР, Н, С.
6. Des substances similaires aux vitamines: les noms, le rôle
biologique; formules de l'acide lipoïque, de la choline, de l'inositol,
de KoQ, de l'acide para-aminobenzoïque.
7. La notion de l’avitaminose alimentaire et secondaire, hypoet hypervitaminose.
8. Les causes des hypovitaminoses.
9. Les maladies associées à un excès, un manque ou une carence en vitamines dans le corps. Préciser leurs symptômes principaux.
10. Fonctions de coenzyme de vitamines; formules de NAD
(NADP), FAD (FMN), PP, TPP.
11. Le concept des antivitamines et leur mécanisme d'action.
12. Analogues structurels de vitamines : médicaments, leur
35
domaine d'application.
13. Provitamines. Provitamine A.
14. La définition des substances par la formule. Par exemple:
СООН
НОНС
НОНС
N
СНОН
СНОН
СНОН
CНОН
II.1. TP 1. LA REACTION QUALITATIVE A LA VITAMINE В2
La riboflavine fait partie du groupe prosthétique des enzymes
flaviniques – flavoprotéines sous la forme de coenzymes flavineadénine- dinucléotide (FAD) et flavine- mononucléotide (FMN).
Flavoprotéines participent à la réaction de la déshydrogénation,
c’est-à-dire le détachement des électrons et des protons du substrat.
Elles participent à l'oxydation de NAD*H (Н+) dans la chaîne de
l'oxydation biologique des α-aminoacides, des β-céto-acides et
d’autres substratums.
Le principe de la méthode et la chimie de la reaction.
La forme oxydée de la vitamine В2 est une substance jaune
fluorescente dans les rayons ultraviolets(rayons UV). La réaction à
la vitamine В2 est basée sur sa capacité de se réduire facilement. A
ce moment-là la solution de la vitamine В2 de couleur jaune acquiert
tout d’abord la coloration rose grâce à la formatiion de composés intermédiaires et puis elle se décolore parce que la forme réduite de le
vitamine В2 est incolore.
H3CН3С-
36
CH2-(CHOH)3-CH2OH
|
N N
═O
H3C+Zn+2HCl
NH
H3CN ║
O
CH2-(CHOH)3-CH2OH
|
N NH
═O
NH
NH ║
O
La riboflavine (В2)
acidifiée (jaune)
La riboflavine (В2)
réduite (incolore)
Protocole:
À 10 gouttes de la solution de la vitamine В2 ajouter 5 gouttes
d'acide chlorhydrique concentré et baisser le granule de zinc métallique.
RÉSULTATS:
TP 2. LA REACTION QUALITATIVE A LA VITAMINE В3 (РР)
La vitamine PP fait partie de co-enzymes des enzymes de nicotinamide-adénine-dinucléotide - НАД+ et nicotinamide- adéninedinucléotide- phospate - NADP+. Ces co-enzymes font partie des
déshydrogénases et participent dans de nombreuses réactions
d’oxydo-réduction. L'absence de la vitamine РР dans la ration provoque la pellagre.
Le principe de la méthode.
Vitamine PP lorsqu'elle est chauffée avec une solution d'acétate de cuivre forme un précipité bleu peu soluble du sel de cuivre
de l'acide nicotinique.
Protocole:
Avant d’analyser la vitamine PP en solution de 3% n’oubliez
pas de l’agiter. Ensuite prenez 20 gouttes de celle-là et chauffez à
l'ébullition pendant quoi la solution trouble devient limpide. Ajoutez
après avoir agité 20 gouttes d'acétate de cuivre en solution de 5% à
la solution réchauffée de vitamine PP. Puis amenez le contenu du
tube à l’ébullition et refroidissez immédiatement sous l’eau courante froide.
RÉSULTATS:
TP 3. LA REACTION QUALITATIVE A LA VITAMINE С
L'acide ascorbique est lié au système de glutathione et parti37
cipe aux procédés d'oxydo-réduction tissulaires. Elle est nécessaire
pour l’hydroxylation des hormones stéroïdes, la formation de l'acide
hydrofolique, l'activation de la dopamine-hydroxylase.
Le principe de la méthode.
L'acide ascorbique est capable de s’oxyder facilement et réduire de diverses substances (ferricyanure de potassium, bleu de
méthylène, l'iode moléculaire, 2, 6 – dichlorophénolin-dophénol et
ect ).
1.
O
OH
|
O=C-CHO=COH-CH-CH-CH2OH+2K3Fe(CN)6+2KOH
O
OH
|
---->O=C-CO-CO-CH-CH-CH2OH+2K4Fe(CN)6+2H2О
2. 3K4Fe(CN)6+4FeCl3
Fe4[Fe(CN)6]3+12KCl
bleu de Prusse (bleu)
Protocole:
À 5 gouttes de la vitamine C en solution de 1% ajouter 1
goutte de soude caustique en solution de 10% et 1 goutte de potassium ferricyanide en solution de 5 %, mélanger, ajouter 3 gouttes
d’acide chlorhydrique en solution de 10% et 1 goutte de perchlorure
de fer en solution d’1%.
RÉSULTATS:
III.2. Questions de contrôle.
Quels co-enzymes ont-ils dans leur composition la vitamine В2?
Comment peut-on identifier les formes oxydées et réduites de la riboflavine?
L'acide ascorbique dans quelles réactions participe-t-il ?
Le principe de la détection de l'acide ascorbique sur quoi est-il basé ?
Quels co-enzymes ont-ils dans leur composition la vitamine PP?
Quelle maladie se développe-t-elle en l'absence de vitamine РР dans
38
la ration?
Matériaux pour l'auto-étude: I а) 1. p.204-247; II; III.
PARTIE IV. LA BIOÉNERGÉTIQUE
Cours 8.
SUJET: LA CHAINE MITOCHONDRIALE DU TRANSPORT
DES ÉLECTRONS ET DES PROTONS. L'IDENTIFICATION DES
MACROERGS.
Le but éducatif: 1. Former des connaissances sur l'oxydation biologique comme source d'énergie dans les systèmes vivants.
2. Apprendre la structure et le rôle biologique de macroergs, de
ferments respiratoires de Warburg et de leurs co-enzymes.
3. Se mettre au courant de la méthodologie de détermination des
macroergs.
Niveau initial de connaissances:
- le concept du métabolisme et de ses constituants;
- la liaison du métabolisme avec les échanges énergétiques;
- la structure de la cellule, le rôle des mitochondries;
- la nature chimique des enzymes;
- la fonction co -enzymatique de vitamines.
Le contenu de la leçon.
I.2. Les étapes principales du métabolisme.
Les rapports des notions du métabolisme, de l'anabolisme, du catabolisme.
Les notions générales de voies métaboliques et d’échanges énergétiques.
L’oxydation biologique et la respiration tissulaire.
La déshydrogénation des substrats comme source d'énergie pour la
synthèse d'ATP.
La composition de la chaîne de transport d'électrons et de protons
lors de l'oxydation de substrats.
Le rôle des vitamines dans la respiration tissulaire.
39
La structure et la fonction des co-enzymes des déshydrogénases.
II.1. Travaux pratiques 1. LA DÉTERMINATION QUANTITATIVE
DES COMPOSÉS MACROÉRGIQUES DE MUSCLES (ATP ET
PHOSPHOCREATINE).
ATP et l’acide créatine-phosphorique sont les principaux macroergs du tissu musculaire. ATP est synthétisé principalement pendant la phosphorylation oxydante et l’acide créatine-phosphorique avec la participation de l'ATP à l'état de repos musculaire. Pendant le
travail musculaire actif l’acide créatine-phosphorique fournit de
l'énergie pour la synthèse de l'ATP à partir d'ADP.
Le principe de la méthode.
Les résidus phosphatés de l'ATP et de l’acide créatinephosphorique sont facilement détachés par hydrolyse acide (soidisant le phosphore labilement lié). On compare la teneur en phosphore inorganique dans les échantillons avant et après l’hydrolyse
par la réaction colorée avec du molybdate d'ammonium en présence
de l'acide ascorbique.
Protocole:
Mettre 0,5 g de bouillie de muscle dans un tube à essai, placer
dans un bain de glace et ajouter 5 ml de TCA en solution refroidie.
Agiter le contenu du tube avec un baguette de verre pendant 5 minutes. L’extrait doit être filtré dans un tube jaugé placé dans un bain
de glace. Verser de l'eau distillée (5 ml) au-dessus des résidus de
bouillie, dans 5 min. filtrer dans le même tube volumétrique et porter
le volume de filtrat à 10 ml par addition du distillat.
Réactifs
Le filtrat sans protéines
La soution de HCl 1M
40
Tubes
Tube de contrôle
Tube à essais
0,5
0,5
1,0
1,0
Fermer par
une feuille de
metal et faire
bouillir 10
min. au bain-
marie, refroidir
La solution de NaOH 1M
1,0
1,0
L'eau distillée
7,5
7,5
Transferer 5 ml de chacun de deux tubes dans les autres
tubes et ajouter:
La solution de molybdate
0,5
0,5
d'ammonium
L'acide ascorbique
0,5
0,5
L'eau distillée
2,0
2,0
Mélanger, laisser à la température ambiante à 10 min.,
Mesurer l'absorbance contre de l'eau sur un colorimètre photo-électrique
à la longueur d'onde 670 nm.
Le calcul. Trouver la différence entre la densité optique de
l'échantillon et celle du contrôle. Trouver la concentration du phosphore inorganique faiblement lié (A) dans l'échantillon par la courbe
d'étalonnage.
Х = А ∙ ( 3,3 ∙ 400 ) ∙ 100, où
Х –le contenu des macroergs en mg / 100 g (mg%)
А – la teneur en ATP dans l'échantillon.
3,3 ∙ 400 – coefficient de conversion par 1 g de tissu en tenant
compte de la dilution des solutions.
RÉSULTATS:
III.2. Questions de contrôle.
Qu'est-ce que c’est que les macroergs? Donnez des exemples.
Quels voies de la formation de l'ATP connaissez-vous?
Où et quand l’acide créatine-phosphorique est-il formé?
Quel est le rôle biologique de l’acide créatine-phosphorique ?
Matériaux pour l'auto-étude: I а) I. p.305–311; II; III.
41
Cours 9.
SUJET: LA PHOSPHORYLATION OXYDATIVE. REGULATION
DE LA CHAINE DE TRANSPORT ELECTRONIQUE (CONTROLE
RESPIRATOIRE).
Le but éducatif: Avoir une idée de la conjugaison de l’oxydation biologique avec les processus cataboliques et anaboliques dans la cellule,
des étapes de synthèse de macroergs dans la chaîne respiratoire, de la
valeur et du mécanisme de régulation de la phosphorylation oxydative.
Niveau initial de connaissances:
- l'anabolisme et le catabolisme comme les deux faces d'un même
processus du métabolisme;
- la composition de la chaîne respiratoire de transport d'electrons;
- la structure et la fonction des deshydrogénases
Le contenu de la leçon.
I.2. La structure des mitochondries.
Les étapes de la synthèse d'ATP dans la chaîne d'enzymes respiratoires au cours de la phosphorylation oxydative. Le coefficient de
P/O.
La phosphorylation substrative, sa valeur énergétique.
Découplage de la respiration et de la phosphorylation.
Régulation de la respiration tissulaire.
Cycle des acides (tricarboxyliques) citriques (cycle de Krebs) - le
"foyer” dans lequel toutes les voies métaboliques se croisent
II.1. TP 1. LA DETERMINATION DE L’ACTIVITE DE LA SUCCINATE- DESHYDROGENASE DES MUSCLES ET L'INHIBITION COMPETITIVE DE SON ACTIVITE
Le principe de la méthode et la chimie de la réaction.
La succinate-déshydrogénase catalyse l'oxydation (déshydrogénation) de l'acide succinique dans de l'acide fumarique. Le coenzyme est le flavine- adénine -dinucléotide (FAD). Comme accepteur d'hydrogène on utilisé la forme oxydée de 2,6-dichloro-phénol42
indophénol (son sel de sodium) en solution aqueuse qui est de couleur
bleue. La forme réduite de ce composé est incolore. La source de l'enzyme est la bouillie musculaire. L'inhibition compétitive de la succinate -déshydrogénase est provoquée par l'acide malonique (НООССН2-СООН) qui est un analogue structural de l'acide succinique.
Cl
|
HOOC-CH2-CH2-COOH + O=
le succinate
|
Cl
–ONa
la succinate déshydrogénase
=N–
Cl
|
HOOC-CH=CH-COOH + HO–
–NH–
le fumarate
|
Cl
–ONa
Protocole:
Couper avec des ciseaux et râper dans un mortier du tissu
musculaire frais (environ 1 g) avec une petite quantité d'eau (2-3 ml)
pendant 1 minute. Puis la suspension doit être transféree à double
couche de gaze placée sur un entonnoir, rincée avec de l'eau, passée
sur du papier filtre et séchée.
Réactifs
Un tampon de phosphate (pH 7,4)
La pâte de muscle
Acide succinique en solution de
3%
NаОН en solution 0,1 N
Н2О distillée
Acide malonique en solution de
Tube 1
3 ml
0,1 g
5 gouttes
Tubes à essais
Tube 2
3 ml
0,1 g
5 gouttes
Tube 3
3 ml
0,1 g
-
5 gouttes
-
5 gouttes
5 gouttes
10 gouttes
43
3%
2,6-dichloro- phénol -indophénol
1 ml
1 ml
en solution 0,001 N
Mettre dans un thermostat à 370С à 40 minutes
RÉSULTATS:
1 ml
CONCLUSION:
III.2. Questions de contrôle.
La succinate déshydrogénase quelle réaction catalyse-t-elle?
Qu’est-ce qui est le co-enzyme de la succinate déshydrogénase ?
Qu’est-ce qui est l’analogue structural de l'acide succinique provoquant une inhibition compétitive de la succinate déshydrogénase?
Matériaux pour l'auto-étude: I а)1. p.311-313, 345-353; II; III.
Cours 10.
SUJET: L'OXYDATION MICROSOMALE. LES COMPOSANTS
DE LA PROTECTION ANTIOXYDANTE. LA DETERMINATION
DE L'ACTIVITE DES ENZYMES RESPIRATOIRES.
Le but éducatif: 1. Obtenir une idée des particularités spécifiques de
l'oxydation microsomale, des composants de la chaîne de monooxygénase, de la signification biologique de l’hydroxylation de substrats, des anti-oxydants.
2. Maîtriser la technique de la détermination de l'enzyme ca44
talase.
Niveau initial de connaissances:
- l’anabolisme et le catabolisme comme les deux faces d'un même
procès du métabolisme;
- la compréhension de la phosphorylation oxydative;
- la structure des cellules, les microsomes;
- les oxydoréductases.
Le contenu de la leçon.
I.2. La composition de la fraction microsomale isolée des cellules.
Les caractéristiques de la structure des monooxygénases (hydroxylases).
Le rôle de l'oxydation microsomale dans le métabolisme des xénobiotiques, des molécules régulatrices.
Le rôle antioxydant des vitamines C et E.
La notion de l'oxydation peroxysomale.
Le rôle de la peroxydase, la catalase, la superoxyde dismutase.
II.1.TP 1. LA RÉACTION QUALITATIVE A LA CATALASE
L’enzyme la catalase se rapporte à la classe des oxydoréductases. Cet enzyme se trouve dans tous les tissus et les liquides de
l'organisme, mais sa teneur est particulièrement grande au stroma
des érythrocytes et du foie.
Le rôle biologique de la catalase consiste en la décomposition
de l'eau oxygénée nuisible à l'organisme en l’oxygène moléculaire et
l’eau.
2H2O2
2H2O + O2
la catalase
Le principe de la méthode.
L’enzyme la catalase contient l’hème. Au cours de la destruction de l'eau oxygénée le fer faisant partie de l’enzyme est oxidé et
réduit.
L’activité de la catalase est exprimé en utilisant le nombre de
catalase. Le numéro de la catalase (CN) c’est le nombre de milligrammes de Н2О2, qui se décomposent dans 1 μl de sang.
Valeur diagnostique clinique. Normalement, le nombre de catalase est de 10 à 15 unités. Le cancer, l'anémie, la tuberculose di45
minuent le contenu de la catalase dans le sang .
Protocole:
Réactifs
Ballon de contrôle
Ballon d’essais
Н2О (ml)
1
1
Le sang dilué 1:1000
2
2
(goutte)
Faire boullir 2-3 min, après refroidir
Н2О2 en solution de 3%
5-10
5-10
(goutte)
Secouer
RÉSULTATS:
CONCLUSION:
III.2. Questions de contrôle.
La catalase et la peroxydase à quelle classe d'enzymes se rapportentelles ?
Quelles cellules ont–elles la plus grande teneur en catalase?
Quel est le substrat spécifique pour la catalase?
Qu'est-ce que c’est que le numéro de la catalase?
Qu'est-ce que c’est que le nombre normal de la catalase?
Indiquez la valeur diagnostique de la détermination quantitative de la
catalase du sang.
Matériaux pour l'auto-étude: I а) 1. p.313–318, 595-596; II; III.
COLLOQUE SUR LA SECTION "LA BIOÉNERGÉTIQUE.
LA CHAINE MITOCHONDRIALE DE TRANSPORT DES
46
ÉLECTRONS ET DES PROTONS. LA VOIE GENERALE DU
CATABOLISME"
Questions au Colloque
1. 1. Sources et voies d'utiliser l'énergie pour différents organismes.
Le rapport entre les concepts du métabolisme énergétique, oxydation
biologique, la respiration tissulaire.
2. Les échanges nutritifs et énergétiques comme la base de la vie.
Concepts généraux de voies métaboliques et le métabolisme énergétique.
3. Les réactions endergoniques et exergoniques dans les cellules vivantes.
4. Des composés macroergiques sont des accumulateurs d'énergie
universels au cours du métabolisme. Le cycle de ADP↔ATP. Les
voies principales de phosphorylation de l'ADP et de l'utilisation de
l'ATP.
5. Le concept moderne de l'oxydation biologique. La valeur des travaux de A.N.Bach et V.I.Palladine.( ?)
6. La structure des mitochondries et l'organisation structurelle de la
chaîne de transport d'électrons et de protons.
7. La déshydrogénation des substrats et l'oxydation de l'hydrogène
comme source d'énergie pour la synthèse d'ATP. Caractéristique des
déshydrogénases.
8. La place et la valeur des déshydrogénases dépendant de pyridine
dans la chaîne des enzymes respiratoires , la structure des coenzymes (formes oxydées et réduites). Les substrats les plus importants pour les déshydrogénases dépendant de NAD.
9. La place et la valeur des déshydrogénases dépendant de flavine
dans la chaîne des enzymes respiratoires , la structure des coenzymes (formes oxydées et réduites). Les substrats les plus importants pour les déshydrogénases dépendant de FAD.
10. La place et la valeur de l'ubiquinone (KoQ) dans la chaîne des
enzymes respiratoires, la nature chimique et le rôle dans les processus oxydatifs.
11. Les cytochromes, la cytochrome oxydase, la nature chimique et
le rôle dans les processus oxydatifs.
47
12. L'oxydation libre, la phosphorylation oxydative et substrative.
13. Les étapes de la production des macroergs dans la chaîne des enzymes respiratoires. Le coefficient de P / O.
14.La régulation de la chaine de transport d'electrons (contrôle respiratoire). Le rôle de certains médicaments et de substances biologiquement actives.
15. La dissociation de la respiration et de la phosphorylation, la
fonction thermorégulatrice de la respiration tissulaire.
16. La structure des mitochondries. Perméabilité sélective de la
membrane mitochondriale pour les substrats, ADP et ATP.
17. Les troubles du métabolisme énergétique et des conditions hypoxiques.
18. Les vitamines В2 et PP, l'ubiquinone. Le rôle de ces vitamines
dans l'oxydation biologique.
19. Les particularités spécifiques de l'oxydation microsomale et peroxysomale. Le rôle du tocophérol et de l'acide ascorbique dans la
protection contre les effets toxiques de l'oxygène.
20. Le cycle de l'acide citrique(des acides tricarboxyliques) (séquence de réactions). La signification biologique du
cycle de Krebs.
21. Mécanisme allostérique de la régulation du cycle de l'acide citrique (cycle de Krebs).
22. La correlation entre les voies générales du catabolisme et la
chaine de transport des électrons et des protons (à l’ exemple du
cycle de Krebs).
PARTIE V. BIOSYNTHESE DES ACIDES NUCLEIQUES ET
DES PROTEINES. MECANISMES MOLECULAIRES DE LA
VARIATION.
Cours 11.
SUJET: STRUCTURE DES ACIDES NUCLÉIQUES.
Le but éducatif: 1. Répéter la structure des mononucleotides.
2. Apprendre les caractéristiques structurelles d'ADN et d'ARN,
les types de liaisons chimiques dans ces molécules.
Le niveau initial de la connaissance:
48
- les bases nucléiques: types, structure;
- la structure des mononucléotides;
- le rôle biologique d'acides nucléiques.
Le contenu de la leçon.
I.2.La structure d'ADN et le mécanisme de auto-réplication de gènes.
Les espèces d'ARN, leurs proportions relatives et leur localisation.
Les ribosomes et ARNr.
ARN de transfert: une structure unique, la spécificité d'action.
II.1. TP 1. HYDROLYSE DES NUCLÉOPROTÉIDES DE LEVURE
Pour étudier la composition chimique des nucléoprotéides on
fait l’hydrolyse acidique de la levure puisqu’ elle est riche en nucléoprotéides. On découvre les produits d'hydrolyse : des polypeptides, des bases puriques, des glucides et l'acide phosphorique par
des réactions spécifiques pour chaque substance.
а) La reaction de biuret aux polypeptides.
La chimie et de l'ordre d'exécution voir TP 1 (pp.9-11)
RÉSULTAT:
b) Test Argent pour les bases puriques.
La chimie de la réaction:
NH2
⌡
N
N
+ AgNO3+NH4OH
N
NH2
⌡
NH
N
N
+ NH4NO3 + H2O
49
N
N-Ag
Protocole:
À 10 gouttes de l'hydrolysat on ajoute une solution forte
d'ammoniac, goutte à goutte (environ 10 gouttes) jusqu’ à la réaction alcaline déterminée au tournesol descendu dans le tube, puis
ajouter 10 gouttes de nitrate d'argent en solution d'ammoniaque de
2%. Ne pas mélanger. Laisser le tube à 3-5 minutes.
RÉSULTAT:
c) Réaction qualitative à pentoses (reaction de Molisch).
Le principe de la methode et la chimie de la reaction
L’interaction de l'acide sulfurique concentré et des pentoses
conduit à leur déshydratation avec la formation du furfural qui
donne avec le thymol des produits de condensation de couleur rouge.
3Н2О
CH3
H2COH-(CHOH)3-COH
+
―ОН
│
H3C-CH-CH3
thymol
COH
H2SO4
concentré
ribose
O
furfural
les produits de condensation rouges
Protocole:
À 10 gouttes de l'hydrolysat de levure ajouter 3 gouttes de
thymol en solution alcoolique d’un %, mélanger et ajoutée 20 à 30
gouttes d'acide sulfurique concentré sur la paroi du tube et secouer.
RÉSULTAT:
CONCLUSIONS:
50
III.2. Questions de contrôle.
Qu'est-ce c’est que les nucléoprotéines?
Quels tissus contiennent-ils beaucoup de nucléoprotéines?
Spécifiez les produits d'hydrolyse des nucléoprotéines.
Les nucleoprotéines de quelles protéines sont -elles composées ?.
Spécifiez leurs caractéristiques.
Quelles reactions qualitatives aux produits d'hydrolyse de nucléoprotéines savez-vous?
Matériaux pour l'auto-étude: I а)1. p.86-88, 96-113; II; III.
Cours 12.
SUJET: LA BIOSYNTHÈSE DES ACIDES NUCLÉIQUES
Le but éducatif: Étudier les étapes de la synthèse des acides nucléiques dans les organismes vivants.
Le niveau initial de la connaissance:
- la structure et la fonction des acides nucléiques;
- la réplication, la communication avec le cycle cellulaire;
- la notion de transcription.
Le contenu de la leçon.
I.2. Synthèse de l'ADN: les étapes, le mécanisme, la valeur.
Lésions et réparation de l'ADN.
Le mécanisme de la transcription.
Le concept de la structure mosaïque des gènes, du transcriptome primaire.
Achèvement post-transcriptionnelle de l'ARN.
I.3. Travail de contrôle.
DES QUESTIONS GENERALES POUR LE TRAVAIL DE
CONTROLE SUR LA SECTION "STRUCTURE ET FONCTIONS D'ACIDES NUCLEIQUES"
1. La structure (sous la forme de tautomères lactame-lactime)
des bases pyrimidiques et puriques.
51
La complémentarité des bases. Bases azotées mineures.
2. La structure de N-glucosides (nucléosides) de D-ribose et
de 2-désoxy-D-ribose avec des bases nucléiques et les réactions de
leur hydrolyse. Les pseudonucléosides.
3. La structure des nucleotides d’AND (les acides déoxyadénylique, déoxyguanylique, déoxycytidylique, thymidylique) et des
nucleotides d’ARN (les acides adénylique, uridylique, guanylique,
cytidylique). Les schémas d'hydrolyse incomplète et complète de ces
mononucléotides.
4. Structure des diphospho- et triphosphonucléotides, schemas
de leurs hydrolyses incomplète et complete.
5. Schémas d'hydrolyse incomplète et complete des acides nucleiques.
6. La structure primaire des acides nucléiques. La structure
des segments de l'ADN (structure triple, comme TGA, ACG,
CTA, ?etc.).
7. La structure secondaire et tertiaire des acides nucléiques. La
différence de la composition et de la structure de l'ADN et de
l'ARN.
8. Les chaîne polynucleotidiques complémentaires. Modèle de
la double hélice( duplex, double hélice, double volute, spirale
double)
9. Les fonctions de l'ADN et de l'ARN. Types de l’ARN.
10. La structure des segments d'ARN avec la séquence de bases:
UGA, AUG, CUG etc.
11. La structure des fragments d'ARNm obtenus par la transcription de l’acide desoxyribonucléique à partir de TCA, GTA, ACT
etc.
12. Les particularités de la structure et la spécificité de l'ARN
de transfert.
13. La structure des anticodons de l'ARNt correspondant aux
codons AUG, CUA, UAG, etc.
Matériaux pour l'auto-étude: I а)1. p. 86-88, 96-113, 478-498; II; III.
Cours 13.
SÉMINAIRE : "BIOSYNTHESE DES PROTEINES. REGULA52
TION DE LA SYNTHESE PROTEIQUE CHEZ PRO- ET EUCARYOTES"
Le but éducatif: 1. Consolider la connaissance des stades de la réplication et de la transcription, le rôle de l'ADN- et d'ARN polymérases.
2. Apprendre le mécanisme de la traduction et de la régulation de la
biosynthèse des protéines.
Le niveau initial de la connaissance:
- les types d'acides nucléiques;
- la structure et la fonction de l'ADN;
- la structure et la fonction des différents types d'ARN;
- la biosynthèse d'acides nucléiques.
Le contenu de la leçon.
I.2. Discussion à propos des communications orales des étudiants.
THÈMES DES RAPPORTS POUR LE SEMINAIRE
1. L'histoire de l'étude et le schema générale de la synthèse
protéique.
2. Le code génétique: les éléments de codage, les propriétés.
3. Le mouvement de l'information génétique. Synthèse de la
matrice d'ARN. ARN polymérase. Transcriptases reverses.
4. L'activation des acides aminés et leur transport vers le lieu
de la synthèse de la protéine. Le rôle d’ARNt comme adaptateur
entre les nucléotides et les acides aminés.
5.Les étapes de la synthèse protéique. La structure des ribosomes, le fonctionnement des polyribosomes.
6. Les mécanismes de traduction et de la synthèse de la
chaîne polypeptidique: l’nitiation et l'élongation de l'agencement ordonné d'acides aminés.
7. La terminaison de la synthèse des protéines, la formation
des structures secondaires, tertiaires et quaternaires.
8. La régulation de la synthèse des protéines chez les procaryotes. Théorie de Jakob et Monot.
9. La régulation de la synthèse des protéines chez les euca53
ryotes. Hypothèse de G. Géorgiev.
10. Les mutations moléculaires et les maladies héréditaires.
Matériaux pour l'auto-étude: I а) 1. p. 509-544; II; III.
COLLOQUE: " BIOSYNTHÈSE MATRICE
MÉCANISMES MOLÉCULAIRES DE LA VARIATION
Questions au Colloque
1. Les bases nucléiques. Tautomérie lactime-lactame.
2. Les bases mineures, leurs formes tautomères Les pseudonucléosides .
3. Les nucléosides et les nucléotides. Exemples.
4. La structure des nucléoside -monophosphates, les schemas
de l'hydrolyse incomplète et complete. AMP cyclique.
5. La structure des nucléoside-di-et nucléoside–triphosphates,
les schemas de l'hydrolyse incomplète et complete. Liaisons macroergiques.
6. La structure primaire de l'ADN. Règles de Chargaff.
7.La structure secondaire et tertiaire de l'AND.
8. Structure primaire et les types d'ARN, leur localisation dans
la cellule
9. Les caractéristiques structurales des différents types d'ARN.
Des idées de la structure secondaire et tertiaire de l'ARN à
l’exemple d’ARNt
10. La complémentarité des bases hétérocycliques (nucléotides). Le rôle des liaisons hydrogènes dans la formation de la structure secondaire des acides nucléiques.
11. La réplication de l'ADN et les phases du cycle cellulaire.
ADN polymérases. Lésions de l'ADN et leur réparation.
12. Biosynthèse de l'ARN (transcription). ARN polymérases.
13. La nature du code génétique. Postulats de F.Krik ?
14. Les composants principaux du système de synthèse des
protéines et les stades de la synthèse des protéines. La direction du
54
mouvement de l'information génétique.
15. L'activation des acides aminés (synthèse de l'aminoacylARNt) et le transport vers le site de la synthèse des protéines. ARNt
comme l'adaptateur.La spécificité du substrat de l’ aminoacyl-ARNt
synthétase.
16.La structure et la fonction des ribosomes et des polyribosomes
17. Les étapes de la synthèse des protéines:l’ initiation de la
traduction
18. Les étapes de la synthèse des protéines:l’ élongation de la
traduction
19. Les étapes de la synthèse de la protéine: la terminaison de
la traduction et la formation de la structure secondaire, tertiaire et
quaternaire de la protéine.
20. Les inhibiteurs des synthèses de la matrice: les médicaments, les toxines bactériennes et virales.
21. La régulation de l'action des gènes. Le concept des opérons. La répression et l'induction de la synthèse des protéines chez
les procaryotes (théorie et F.Jakob et J.Mono).
22 L'induction et la répression de la synthèse des protéines
dans l’organisme humain (chez les eucaryotes). Le rôle des hormones dans la régulation de l'action des gènes.
23. La différenciation cellulaire et l'ontogenèse comme résultat de l'activité différentielle des gènes. Modification de la composition protéique des cellules au cours de la différenciation.
24. Les bases biochimiques de la génétique médicale. Mécanismes moléculaires de la variabilité génétique: mutations, recombinaisons.
25. La hétérogénéité génotypique des populations et le polymorphisme des protéines à l'exemple de l'hémoglobine et de certaines enzymes.
26. Les mutations moléculaires et les maladies héréditaires.
Les méthodes biochimiques dans le diagnostic des maladies congénitales.
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SOMMAIRE
Réglementation sécurité pour les étudiants au travail aux laboratoires ….... 3
Matériaux pour l'auto-étude ………………………………………………. 5
Critères d'évaluation des étudiants ……………………………………….. 6
SECTION PREMIÈRE
Partie 1. STRUCTURE, FONCTION ET PROPRIETES DES PROTEINES
C. 1. Le rôle biologique et les propriétés physico-chimiques des protéines.
Les méthodes de l'extraction et du fractionnement des protéines ……….. 7
C. 2. L'organisation de structure des molecules de protéines. Les méthodes
de la purification des protéines ………………………………………… 11
C. 3. La classification des protéines. La chimie des protéines simples et
complexes. Les méthodes de la précipitation des protéines …………… 14
Des questions générales pour le travail de contrôle sur la section «Structure
et propriétés des protéines» ……………………………………………. 20
Partie 2. ENZYMES
C. 4. Structure et propriétés des enzymes ……………………………… 22
C. 5. Le mécanisme de l'action des enzymes. La cinétique des réactions enzymatiques ………………………………………………….……….. 27
C. 6. La régulation de l'activité des enzymes. La classification, la nomenclature et l'utilisation pratique des enzymes ……………………. 31
Questions au Colloque "ENZYMES" ………………………………….. 33
Partie 3. INTRODUCTION AU METABOLISME ET DE L'ENERGIE.
BIOCHIMIE DE LA NUTRITION
C. 7. La classification, la structure et le rôle biologique des vitamines. Les
méthodes de la définition des vitamines …………………………….... 35
Questions au travail de controle "LES VITAMINES" ………………... 35
Partie 4. LA BIOÉNERGÉTIQUE
C. 8. La chaine mitochondriale de transport des électrons et des protons.
L'identification des macroergs ….…………………………………….. 39
C. 9. La phosphorylation oxydative. Régulation de la chaine (contrôle respiratoire) …………………………………………………………… 42
C. 10. L'oxydation microsomale. Les composants de la protection antioxydante. La détermination de l'activité des enzymes respiratoires … 45
Questions au Colloque "LA BIOÉNERGÉTIQUE. LA CHAINE MITOCHONDRIALE DE TRANSPORT DES ÉLECTRONS ET DES PROTONS. LA VOIE GENERALE DU CATABOLISME" ………..... 47
Partie 5. BIOSYNTHÈSE DES ACIDES NUCLÉIQUES ET DES PROTÉINES. MÉCANISMES MOLÉCULAIRES DE LA VARIATION
C. 11. Structure des acides nucléiques ………………………………… 49
C. 12. La biosynthèse d'acides nucléiques ……………………………. 51
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Questions au travail de contrôle "STRUCTURE ET FONCTIONS
D'ACIDES NUCLÉIQUES" ………………………………...………... 52
C. 13. Séminaire : «Biosynthèse des protéines. Régulation de la synthèse des
protéines chez pro- et eucaryotes» ………………......………………… 53
Questions au Colloque " BIOSYNTHÈSE DES ACIDES NUCLÉIQUES
ET DES PROTÉINES. MÉCANISMES MOLÉCULAIRES DE LA VARIABILITÉ " ……………………………………………………….. 54
Sommaire ………………………………………………………………. 57
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D.M. Nikulina, A.V. Kokhanov, R.A. Bisalieva
PRATIQUES BIOCHIMIQUES
Partie 1.
(Учебно-методическое пособие для студентов,
обучающихся на французском языке)
Компьютерное форматирование, верстка и корректура авторские
Технический редактор – В.Б. Нигдыров
ISBN 978-5-4424-0101-1
Подписано к печати – 20.05.2015
Гарнитура Times New Roman
Усл. печ. лист – 2,4. Усл. изд. лист – 0,8
Формат 60х80 1/16
№ заказа Тираж – 300 экз.
Издательство ГБОУ ВПО Астраханского государственного
медицинского университета
414000, г. Астрахань, ул. Бакинская, 121
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