Cours de Microbiologie LV342
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Cours de Microbiologie LV342 Université Pierre & Marie Curie (Paris 6) UFR 927 Sciences de la Vie Présentation & Principales Caractéristiques des Microorganismes Définition et Objet de la Microbiologie Défini&on: C'est l’étude des organismes trop petits pour être vus à l’oeil nu, c'est-à-dire des microorganismes ou microbes, du grec mikros "petit" Cette étude implique des techniques spécifiques comme par exemple la microscopie et la mise en culture Occupe une place centrale en biologie : Biochimie Ecologie Génétique Microbiologie Immunologie Evolution et origines de la vie Repères Historiques et Découvertes Marquantes Hippocrate 460-370 av, J-C, est considéré comme le père de la médecine moderne, et ses disciples ont été les premiers à classer de nombreuses maladies aiguës, chroniques, endémiques et épidémiques Ibn Zakaria Al-Razi 865-925 médecin pluridisciplinaire perse Dans son célèbre traité de médecine « Kitab fi al-jadari wa-al-hasbah» a été le premier à décrie la variole et la rougeole, et préconise des règles d'asepsie en chirurgie Garcia de Orta 1500-1568 médecin et botaniste portugais a été le premier à décrire le choléra et d'autres maladies tropicales et leur traitement par des plantes Repères Historiques et Découvertes Marquantes Francesco Redi 1626-1697 est le premier à remettre en question la génération spontanée en montrant que les asticots proviennent de la ponte des mouches. Antonie van Leeuwenhoek 1632-1723, naturaliste hollandais, en fabricant ses propres microscopes grossissant 100 à 300 fois a pu observer pour la première fois: -des protozoaires, des levures, des spermatozoïdes, des hématies -des bactéries en1670 nouvellement découvertes ont été nommées "animalcules". Repères Historiques et Découvertes Marquantes Robert Hooke 1635-1703,astronome, mathématicien et naturaliste anglais - perfectionnement de la conception et l'utilisation du microscope - confirme en 1678 les observations de bactéries faites par Antoine van Leeuwenhoek Lazzaro Spallanzani 1729-1799, grâce à l'emploi de flacons chauffés et scellés, porte en 1785 un rude coup à la théorie de la génération spontanée. Edward Jenner 1749-1823, médecin et naturaliste anglais -tente son premier essai de "vaccination" contre la variole en 1796 Repères Historiques et Découvertes Marquantes Robert Bunsen 1811-1899, chimiste allemand, est crédité à tort d'avoir perfectionné le bec de gaz qui porte son nom,alors qu'il s'agit en fait de son assistant Peter Desdega en 1885 Rudolf Virchow 1821-1902, médecin allemand - fondateur de l'anatomie pathologique en observant de nombreuses cellules de malades au microscope - émet en 1858 l'hypothèse que toute cellule vivante ne peut provenir que d'une autre cellule préexistante (omnis cellula e cellula) Repères Historiques et Découvertes Marquantes Louis Pasteur 1822-1895 est un des fondateurs de la microbiologie moderne par l'exploration de domaines variés : 1861: confirmation de l’inexistence de la génération spontanée par l’emploi de flacons à "col de cygne" qui laissent passer l'air mais pas les microorganismes 1876 : invention d'un procédé de conservation : la pasteurisation et la stérilisation pour la mise en culture des microorganismes 1881 : vaccins contre le charbon et le "choléra" des poules 1885 : vaccins contre la rage 1888 : création de l’Institut Pasteur à Paris Repères Historiques et Découvertes Marquantes Robert Koch 1841-1910 est le rival allemand de Pasteur 1876 : 4 postulats essentiels : - L’agent infectieux doit être détecté chez chaque malade L’agent infectieux doit être isolable ex vivo La maladie doit être reproduite par inoculation de l’agent purifié L’agent infectieux doit être re-isolé à partir de l’hôte infecté expérimentalement 1877: : le charbon est dû à Bacillus anthracis 1880 : invention du milieu de culture solide par utilisation de la gélatine 1882 : découverte et culture du bacille de la tuberculose 1883 : confirmation de l'identification du bacille responsable du choléra, initialement traité par Garcia de Orta 1500-1568 puis décrit par le naturaliste italien Filippo Pacini en 1854 1905 : obtention du prix Nobel de médecine Repères Historiques et Découvertes Marquantes Alphonse Laveran 1845-1922, médecin militaire français découvre en 1880 le protozoaire parasite responsable du paludisme Prix Nobel de médecine en 1907 (pose des bases de la parasitologie) Hans Gram 1851-1928, microbiologiste danois, met au point en 1884 la célèbre coloration GRAM qui porte son nom Martinus Beijerinck 1851-1931, microbiologiste hollandais, découvre en 1898 le premier virus, celui de la mosaïque du tabac Albert Calmette 1863-1933 et Camille Guérin 1872-1961, microbiologistes français, développent en 1921 un vaccin contre la tuberculose (BCG = Bacille de Calmette et Guérin). Repères Historiques et Découvertes Marquantes Alexander Fleming 1881-1955, médecin écossais, découvre la pénicilline en 1929 prix Nobel de médecine en 1945 Jacques Monod 1910-1976, microbiologiste français 1940 découverte de la diauxie chez Escherichia coli (voir plus loin) 1961 découverte de l'opéron lactose et postulat l'existence de l'ARNm, avec François Jacob et André Lwoff 1965 proposition d'un modèle d'enzyme allostérique 1965 prix Nobel de médecine Chronologie des 1ers Génomes Séquencés 1977 Bactériophage : ΦX174 (5386 pb, 11 gènes) 1984 Virus eucaryote : Epstein-Barr (172 kb, 80 gènes) 1995 Bactérie : Haemophilus influenzae (1,83 Mpb, 1900 gènes) 1996 Eucaryote : Saccharomyces cerevisiae (17,4 Mpb, 6600 gènes) Pour comparaison 2006 Homosapiens sapiens (3,2 Gpb, 22000 gènes) Evolution, Vie Microbienne & Biosphère Origine de la terre et de la vie En étudiant les isotopes radioactifs (40K qui se décompose en 40Ar, demi-vie de 1,26 Mds d’années), les scientifiques ont estimé l’âge de l’univers à ~13,7 Mds d’années. Selon la théorie du « Big Bang », l’univers est en expansion, et notre système solaire et la terre se sont formés il y’a qqs 4.5 Mds d’années. L’étude des fossiles microbiens ou paléon-microbiologie a été fondée en 1950 par deux scientifiques américains Stanley Tyler et Elso Barghoorn. Mise en Evidence des Microorganismes Fossiles (1) Les plus anciens fossiles, découverts à ce jour en Australie et en Afrique du Sud, sont les stromatolites datant de 3.5 Mds d’années (Soit 1 Mds d’années après la formation de la terre) Fossiles Microbiens découverts dans des roches sédimentaires laminaires (stromatolites, Bolivie, Amérique du Sud) Les microorganismes déposent du carbonate de calcium et d’autres minéraux, pour former les feuillets successifs de la structure. L'analyse du soufre prélevé dans des roches du nord de l'Australie et datées de 3,47 Mds d'années indique une réduction biologique du sulfate, ce qui laisse supposer une respiration anaérobie (voir plus loin) Mise en Evidence des Microorganismes Fossiles (2) La présence de dérivés du 2-méthylhopane, stérols caractéristiques des cyanobactéries, a été mise en évidence dans des dépôts carbonés inclus dans des roches datant de 2,5 Mds d'années. Cela suppose que la photosynthèse oxygénique était donc déjà en place à ce moment-là, ce qui n'implique pas forcément la présence de quantités importantes d'oxygène atmosphérique (atmosphère anoxique sans oxygène libre sous forme gazeuse O2) La teneur en oxygène est estimée de: -1 à 5 % entre 1 Mds et 1.5 Mds d'années -10 % il y a 0,5 Mds d'années -~21% actuellement Tentative de Définition de la Vie Système complexe compartimenté et hautement organisé (à faible niveau d'entropie): -échange de la matière avec son environnement -assure sa maintenance par renouvellement de ses composants -utilise l’énergie de son environnement en état de déséquilibre thermodynamique -persiste par auto-réplication et transfert d'information L’astrobiologie est l’étude de la vie dans l’univers. En raison de leur rapide évolution et leur résistance, les microorganismes pourraient constituer des organismes vivants bien plus fréquents que les macro-organismes. Origine de la Vie sur Terre Beaucoup de questions restent suspendus primitive du début de la vie sur terre: concernant la -Comment la vie-elle apparue ? -Quelles sont les premières formes de vie ? -Quelles sont les conditions qui ont permis l’origine de la vie sur terre? Aucune observation directe ne permet de répondre à ces questions mais certains pré-requis d’apparition ( peut être insuffisantes) ont été avancés période Pré-requis d’Apparition de la Vie sur la Terre (1) La vie n’a pu exister sans une eau sous forme liquide Facteurs physiques dont la grandeur doit se situer dans une certaine plage : température, pression, rayonnement, gravité…etc Présence de composés organiques -il est inconcevable que les cellules puissent avoir émergé de novo en l’absence de ces composés (acides aminés, sucres…etc) -en 1953 Stanley et Miller ont pu synthétiser au laboratoire des composés organiques à partir de sources inorganiques -Certains composés organiques tels que les acides aminés et les hydrocarbures polycycliques aromatiques ont été découverts dans l’espace intergalactique. Cela soulève l’hypothèse L’origine de la vie pourrait être extra-terrestre (apportée par des comètes et des météorites) Pré-requis d’Apparition de la Vie sur la Terre (2) Beaucoup de Scientifiques pensent que la vie a évolué sur la terre dans des endroits à l’abri des impacts des astéroïdes et des facteurs physiques agressifs (haute température, UV….) -Environnements marins profonds tels les cheminés hydrothermales -Environnements souterrains Fumeur au Pacifique Comment Pouvant Nous Suivre l’Evolution Biologique ? Deux approches sont possibles: Observation des sédimentaires microorganismes fossiles dans les dépôts Construction d’un arbre de l’évolution en se basant sur les connaissances des organismes vivants contemporains -La seconde approche suppose l’analyse des séquences de macromolécules telles que les ARN ribosomiques (ARNr) 16S et 18S (unité Svedberg) en raison de leur: -Evolution très lente au cours du temps -Nature très conservée -Caractère ubiquitaire Arbre Phylogénétique Universel Trois grands domaines d’organismes (Carl Woese fin des années 1970) Procaryotes Domaines Bactéries Last Universal Common Ancestor qui est dit progénote c'est-à-dire ni procaryote ni eucaryote Archées Eucaryotes Eucaryotes LUCA origine de la vie Les types cellulaires des Eucarya sont structurellement différents de ceux des Bacteria et des Archaea Les Bactéries et les Achées se différencient principalement par les composés qu’elles utilisent comme nutriment et/ou comme source d’énergie Diversité Microbienne Domaine des bactéries: Comprend beaucoup des microorganismes (~30 phylums ou règnes) présents typiquement dans: -Les sols -Environnements aquatiques -Responsables de maladie Domaine des archées: Constitué d’une ensemble séparé de microorganismes dont certains se trouvent dans: -Environnements saturés en sels ou à température élevée Domaine des eucaryotes: Comprend -les microorganismes eucaryotes tels que les protistes (protozoaires et protophytes); les champignons, les algues les animaux et les végétaux Tableau Comparatif des Trois Domaines (1) Domaine Caractéristique Bacteria (eubactéries) Archaea (archées) Eucarya (eucaryotes) 0,2 à 15 µm 0,2 à 15 µm 10 à 100 µm Présence d'organites Non Non Oui Noyau entouré d'une membrane Non Non Oui Acide gras linéaire, ester Oui Alcool isoprénoïde ramifié, éther Non Acide gras linéaire, ester Oui Oui Peptidoglycane (muréine) Oui Très variable, sans peptidoglycane Oui Pectocellulose (plantes) ou chitine (champignons) Croissance à température > 90°C Non Oui Non Formation de spore Oui Non Oui Photosynthèse Oui Non Oui Chimio-lithotrophie Oui Oui Non Méthanogénie Non Oui Non Fixation de l'azote atmosphérique Oui Oui Non ATP synthétases/ATPases F1F0 A1 A0 F1F0, V1V0 Taille moyenne Lipides membranaires : - Chaîne carbonée liée au glycérol et type de liaison - Présence de stérol Paroi : - Présence - Composant principal Tableau Comparatif des Trois Domaines (2) Bacteria (eubactéries) Archaea (archées) Eucarya (eucaryotes) Pouvoir pathogène Oui Rare et indirect Oui Organismes pluricellulaires Non Non Oui Bactériophages Oui Oui Présence de plasmides Oui Oui Rare Présence de transposons Oui Oui Oui Présence d'opérons Oui Oui Non Chromosomes : - Ploïdie - Nombre - Forme - Télomères - Histones - Origine(s) de réplication Haploïde 1 (2) Circulaire Non Non Unique Haploïde 1 (2) Circulaire Non Oui Multiples Le plus souvent diploïde Plusieurs Linéaire Oui Oui Multiples ARN polymérase ADN dépendante : - Nombre d'enzymes - Sous-unités - Rifampicine 1 5 (!2""'#) Sensible 2 Jusqu'à 13 Résistante 3 Au moins 33 Résistante Non Oui Non Parfois Oui Oui Très souvent Non Oui N-formyl-Met Met Met 70 S Sensible Résistant 70 S Résistant Sensible 80 S Résistant Sensible Domaine Caractéristique Présence de virus (10 à 400 nm) ARNm : - Epissage - Polycistronique - Complexe exosome Initiation de la traduction Ribosome : - Taille - Chloramphénicol - Toxine diphtérique Cas Particulier des Virus (voir cours de virologie) Les virus (du latin "poison") sont les êtres vivants les plus simples qui existent et sont présents dans les 3 domaines Parasites intracellulaires obligatoires, incapables de se répliquer en dehors de leur hôte si bien que certains ne les considèrent pas comme des organismes "vivants" à part entière Constitués d’un seul type d’acide nucléique ADN ou ARN encapsidé par des protéines structurales / génome compacté 3-200 gènes Leur taille est variable 20 à 300 nm Ø, donc très inf. à la taille d’une cellule (exception des Mimivirus qui peuvent atteindre 400nm Ø) Une diversité insoupçonnée: 10.000 virus connus on estime qu’il existe plus de 1031 particules virales différentes (diversité supérieure à celle cumulée des trois domaines du vivant) Arbre Phylogénétique des Archées (ou Archaea) Basé sur les séquences de la région codant les ARNr 16 -­‐18S Elles se répartissent actuellement dans 4 (?) phylums (ou règnes ?) distincts, selon l'arbre phylogénique simplifié et provisoire Crenarchaeota Archaea Sulfolobales* Caldisphaerales* Eucarya Bacteria Desulfurococcales* Euryarchaeota Thermoplasmatales Archaeoglobales* Halobacteriales Thermoproteales* Methanosarcinales Thermococcales* Methanocellales Methanomicrobiales Methanococcales* Korarchaeota ? LACA* ? Methanobacteriales* Methanopyrales* Nanoarchaeota LUCA ? ∗ indique la présence des hyperthermophiles Classification des Archées (1) Phylum des Crenarchaeota: comprend 4 ordres La plupart des Archaea cultivables de ce phylum ont un métabolisme énergétique lié au soufre. Phylum des Euryarchaeota: comprend -Les -Les -Les -Les méthanogènes (voir plus loin) halophiles extrêmes réducteurs de sulfate thermophiles Crenarchaeota Archaea Sulfolobales* Caldisphaerales* Eucarya Bacteria Desulfurococcales* Euryarchaeota Thermoplasmatales Archaeoglobales* Halobacteriales Thermoproteales* Methanosarcinales Thermococcales* Methanocellales Methanomicrobiales Methanococcales* Korarchaeota ? LACA* ? Methanobacteriales* Methanopyrales* Nanoarchaeota LUCA ? +Méthanogènes Classification des Archées (2) Phylum des Korarchaeota: surtout connu par métagénomique (techniques ne faisant pas appel à la mise en culture), car ce n'est que tout récemment qu'un de ses membres a pu être enfin cultivé Phylum des Nanoarchaeota dernier découvert. On n'en connaît pour l'instant que très peu de représentants, qui pourraient être apparentés aux Euryarchaeota. Crenarchaeota Archaea Sulfolobales* Caldisphaerales* Eucarya Bacteria Desulfurococcales* Euryarchaeota Thermoplasmatales Archaeoglobales* Halobacteriales Thermoproteales* Methanosarcinales Thermococcales* Methanocellales Methanomicrobiales Methanococcales* Korarchaeota ? LACA* ? Methanobacteriales* Methanopyrales* Nanoarchaeota LUCA ? LACA (Last Archaeal Common Ancestor) Les nombreux échantillonnages effectués et étudiés par métagénomique indiquent que les Archées sont présentes partout sur la planète LACA (Last Archaeal Common Ancestor) est supposé hyperthermophile du fait de l'enracinement profond de toutes les Archaea hyperthermophiles, et l’émergence de mésophiles aurait alors été plus tardive. Crenarchaeota Archaea Sulfolobales* Caldisphaerales* Eucarya Bacteria Desulfurococcales* Euryarchaeota Thermoplasmatales Archaeoglobales* Halobacteriales Thermoproteales* Methanosarcinales Thermococcales* Methanocellales Methanomicrobiales Methanococcales* Korarchaeota ? LACA* ? Methanobacteriales* Methanopyrales* Nanoarchaeota LUCA ? Diversité des Microorganismes Eucaryotes Troisième domaine du monde du vivant, ce sont des organismes dont: -ADN est séparé du cytoplasme par une membrane nucléaire -Uni ou pluricellulaires -les eucaryotes autres que les champignons, les algues, les plantes ou les animaux sont appelés: Protistes regroupent les protozoaires et les protophytes proche des algues unicellulaires LUCA Les Protistes (règne) (1) La classification des protistes reflète d’une grande complexité et peut être +/- éclatée au sein des eucaryotes. Par conséquent, d'autres classifications ont été proposées Ce sont des eucaryotes unicellulaires, le plus souvent mobiles par pseudopodes, flagelles ou cils. Ils sont très répandus dans toutes les zones aqueuses ou humides. Ils constituent, avec plus de 65 000 espèces recensées, une part importante du plancton. On en les trouve aussi dans les matières organiques en décomposition, et certains sont des pathogènes parasites des plantes ou des animaux (voir cours de parasitologie). Les Protistes (2) En cas de conditions défavorables, de nombreux protistes se différencient sous forme de kyste, cellule dormante protégée par une paroi. Les parasites peuvent utiliser les kystes pour passer d'un hôte à l'autre. Certains possèdent 2 noyaux comme par exemple la paramécie (voir TP) La reproduction peut être asexuée (division binaire classique) ou sexuée (soit par conjugaison de types sexuels complémentaires, soit par formation de véritables gamètes). Les Protozoaires (sous règne) Cons&tués de 14 embranchements dont les principaux sont: Les Ac&nopodes avec un squelette silicé comme les radiolaires Les Rhizopodes Paramécie (voir TP) Amibes, foraminifères Les Ciliés ou infusoires Paramécie, Stantor et vorticelle Les Flagellés -trypanosome (parasite responsable de la maladie du sommeil ou de Chagas) -trichomonas (parasite responsable de la trichomonase,sexuellement transmissible) -leishmania (parasite responsable de la leishmaniose ou kala-azar) Les Microsporidies parasites intracellulaires comme le toxoplasme Les Sporozoaires parasites, comme le plasmodium (hémotozoaire agent du paludisme ou malaria) Les Protophytes (sous règne) Organismes proches des algues unicellulaires donc photo-autotrophes Ils sont chimio-organotrophes et hétérotrophes : -soit holozoïtes : ingestion de bactéries par phagocytose -soit saprozoïtes ou osmotrophes : les nutriments traversent la membrane plasmique par pinocytose (repli de la membrane qui englobe une gouttelette du liquide)>>> diffusion ou transport actif Ils possèdent souvent des vacuoles: -pulsatiles, phagocytaires, sécrétoires. Euglène (voir TP) Les Champignons (ou Mycètes) (1) Leurs principales caractéris&ques sont : Les champignons sont des végétaux mais constituent un règne distinct (100.000 espèces connues) de celui des plantes: -très répandus dans l'environnement et sont estimés à plus de 1.5 millions d’espèces (30 espèces comestibles en France) Non photosynthétiques, Chimio-organotrophes et hétérotrophes Saprophytisme: alimentation par absorption de composés organiques Présence d'une paroi à base de chitine, différente de la paroi pecto-cellulosique des plantes Présence d'un thalle : structure végétative des végétaux inférieurs où l'on ne peut distinguer ni racines, ni tiges, ni feuilles Les Champignons (ou Mycètes) (2) Présence d'hyphes, longs filaments ramifiés de cellules septées (cloisonnées) ou non, dont l'ensemble forme le mycélium. Reproduction sexuée (avec appareil fructifère, issu de l'union de filaments provenant de deux individus de types sexuels différents pour former un organe reproducteur zygospore Appareil fructifière avec fulcres de Phycomyces (voir TP) Reproduction asexuée de loin la plus importante et parfois le seul mode connu, elle est assurée par la production de spores ou conidies), ou les deux. Les Champignons (ou Mycètes) (3) Certains champignons sont pathogènes pour: -l'homme ou l'animal et provoquent des mycoses. Ex: Candida, Aspergillus, Histoplasma, Trichosporon, Cryptococcus, -D'autres sont pathogènes pour les plantes Ex: Fusarium Principaux groupes (classification complexe) : zygomycètes (ex: Phycomyces, voir TP), ascomycètes, basidiomycètes, deutéromycètes, Oomycètes Cas des levures : Une levure est un champignon unicellulaire se reproduisant par fission ou par bourgeonnement (Saccharomyces cerevisiae, voir TP) à certains stades de sa vie, et formant des cellules sexuelles sans appareil fructifère. -Les levures ne forment généralement pas de mycélium La classification des champignons, et donc des levures, est complexe et soumise à des remaniements fréquents. Les Algues L’étude des algues est l'algologie ou phycologie Les algues ne constituent pas un taxon mais plutôt un groupe polyphylétique, c'est-à-dire qu'elles recouvrent plusieurs catégories dans la classification : -ce sont soit des plantes soit des protophytes. Les algues sont dépourvues de racines, tiges et feuilles, et possèdent des chloroplastes pour effectuer la photosynthèse oxygénique (voir plus loin). Elles peuvent être unicellulaires, en colonies, filamenteuses, membraneuses ou tubulaires. Evolution des Eucaryotes (Théorie Endosymbiotique) Wolfram Zillig & Lynn Margulis suggèrent que l’apparition de la cellule préeucaryote pourrait être issue à partir d’un événement de fusion entre une prébactérie et une préarchée. Cette cellule préeucaryote aurait évolué en cellule eucaryote avec noyau puis en cellule eucaryote avec mitochondrie. La mitochondrie serait issue de la symbiose entre une protéobactérie et une cellule eucaryote primitive. Cette lignée conduisant à l’évolution des plantes et des animaux. Le chloroplaste apparaît suite à la fusion symbiotique entre une Cyanobactérie et une cellule eucaryote. La lignée conduisant à l’évolution des algues et des plantes Culture et Croissance des Procaryotes Besoins Nutritionnels et Métabolisme Primaire Aliments Essentiels ou Nutriments (1) Toute cellule vivante requiert les substrats indispensables lui permettant de synthétiser l'ensemble des molécules qui composent sa biomasse à partir de son métabolisme primaire (cours de biochimie) Ce sont les aliments essentiels ou nutriments, qui doivent obligatoirement être présents dans le milieu de culture Aliments Essentiels ou Nutriments (2) Elément chimique (% du poids sec) Exemples de substrats utilisés comme sources de l'élément Minéraux Organiques C ( 50) CO2 , (CO) Glucides, lipides, acides aminés, ... O ( 20) H2O, CO2, (O2) La plupart N ( 15) NH4+, NO3 –, NO2 –, N2, ... Acides aminés, bases azotées, amines, ... H ( 10) H2O, H+, (H2) La plupart P ( 3) Phosphates Nucléotides, composés phosphorylés, ... S ( 1) SO42–, SO32–, H2 S, ... Cys, Met, thiols, sulfonates, sulfides, ... Sels (≤1) Na+ , K+ , Mg2+, Ca2+, Cl–, ... — Métaux ou oligoéléments (<0,1) Fe2+, Zn2+ Mn2+, Cu2+, Co2+, Hème pour le fer, ... Ni2+, ... C, O, N, H et P sont des macro-nutriments, car ils constituent la plus grande partie de la biomasse. L'apport d'oxygène et d'hydrogène en tant qu’éléments de la biomasse ne nécessite pas de substrats spécifiques: -soit ils sont associés aux sources de C et de N, -soit ils proviennent d’échanges métaboliques d'eau (qui est aussi le solvant) ou de protons avec le milieu. Aliments Essentiels ou Nutriments (3) Elément chimique (% du poids sec) Exemples de substrats utilisés comme sources de l'élément Minéraux Organiques C ( 50) CO2 , (CO) Glucides, lipides, acides aminés, ... O ( 20) H2O, CO2, (O2) La plupart N ( 15) NH4+, NO3 –, NO2 –, N2, ... Acides aminés, bases azotées, amines, ... H ( 10) H2O, H+, (H2) La plupart P ( 3) Phosphates Nucléotides, composés phosphorylés, ... S ( 1) SO42–, SO32–, H2 S, ... Cys, Met, thiols, sulfonates, sulfides, ... Sels (≤1) Na+ , K+ , Mg2+, Ca2+, Cl–, ... — Métaux ou oligoéléments (<0,1) Fe2+, Zn2+ Mn2+, Cu2+, Co2+, Hème pour le fer, ... Ni2+, ... S et les principaux sels sont des micro-nutriments car ils sont nécessaires en moins grandes quantités (de 0,1 à 1%). La présence de sels est aussi nécessaire pour maintenir la pression osmotique du milieu. Les oligo-éléments ne sont nécessaires qu’à l’état de traces, et comme ils sont souvent présents en tant que contaminants d'autres composants, il n'est pas toujours utile d'en ajouter. Facteurs de Croissance Un facteur de croissance est un constituant indispensable de la biomasse que la cellule est incapable de synthétiser par elle-même -Elle doit alors se le procurer directement comme substrat : acide aminé, vitamine ou coenzyme, base azotée, lipide Un facteur de croissance, pour lequel la cellule est dite auxotrophe ne doit pas être confondu avec un aliment essentiel ! L’auxotrophie peut être: -soit naturelle et c'est alors une des caractéristiques du microorganisme éventuellement utilisée en taxonomie -soit provoquée par exemple par une mutation touchant la voie de biosynthèse du constituant pour lequel le microorganisme devient alors auxotrophe -soit conditionnelle dépendante des conditions de culture Types Trophiques ou Nutritionnels Pour synthétiser sa propre matière, une cellule vivante nécessite des aliments essentiels et d’éventuels facteurs de croissance, du pouvoir réducteur (donneur d’électrons), et de l’énergie. L'ensemble de ces besoins permet de définir des type trophiques généraux (du grec trophê "nourrir"): Besoin Source d'énergie primaire Substrat énergétique oxydé (donneur d'électrons) Source de carbone Facteur de croissance Croissance en présence de concentration en substrat Type trophique lumineuse chimique minéral organique minérale : CO2 organique indispensable inutile forte faible Phototrophe Chimiotrophe Lithotrophe Organotrophe Autotrophe Hétérotrophe Auxotrophe Prototrophe Copiotrophe Oligotrophe Il existe de plus des types trophiques correspondant à des besoins particuliers : hydrogénotrophe, méthanotrophe, diazotrophe (voir plus loin), méthylotrophe, ... Types de Milieux de Culture selon leur Composition Milieu complexe ou empirique: Milieu préparé à partir d'extraits de matières organiques et dont la composition exacte n'est pas connue Exemple : hydrolysat de protéines, extraits de levure, de viande, de soja, de lait,de sang… Ce type de milieu est parfois dit "riche" car il contient suffisamment de composés pour permettre la croissance de la plupart des microorganismes courants. Il a l'avantage d’être facile à préparer Milieu synthé&que ou chimiquement défini: Milieu dont la composition exacte est entièrement connue Ce milieu est dit "minimum" lorsqu'il ne contient que les éléments strictement indispensables à la cellule (les nutriments et les facteurs de croissance éventuels). Ce type de milieu est utile pour étudier précisément les besoins nutritionnels du microorganisme, son métabolisme et sa physiologie Milieu Solide ou liquide Peut être rendu solide par addition d'agar CH2OR2 O O HO O CH2 O OR1 O O Agar: composé appartenant à une famille de polysaccharides gélifiants extraits de certaines algues rouges (agarose, guar…) et aussi utilisé comme additifs alimentaires (E406) OH L'unité répétitive est un disaccharide O-substitué (R1 et R2, variables) formé de β-D-galactpyranosyl lié en 1-4 à du 3,6-anhydro-α-L-galactopyranosyl Les milieux solides sont très utiles pour effectuer des isolements, ce qui permet de trier un mélange de microorganismes différents (voir TP) Un milieu peut être rendu "sélectif" par addition d'un ou plusieurs inhibiteurs auxquels le microorganisme que l'on souhaite isoler est insensible ou résistant. Avant utilisation Après utilisation Conditions Optimales de Croissance Paramètres Physico-chimiques Les conditions optimales de croissance dépendent de 4 principaux facteurs physico-chimiques : Conditions optimales de croissance Température < 20°C entre 20 et 40°C entre 40 et 80°C > 80°C pH < 6 entre 6 et 8 > 8 Salinité > 2,8 M Dessiccation Pression > 400 atm Catégorie Psychrophile ou cryophile Mésophile Thermophile Hyperthermophile Acidophile Neutrophile ou neutralophile Alcalophile ou basophile Halophile Xérophile Barophile ou piézophile Rappels : l'isotonicité est à 0,15 M en sels soit 9 g/L de NaCl L'eau de mer est à une concentration moyenne en sels de 35 g/L soit 0,6M de nombreux organismes dits halotolérants et appartenant aux 3 domaines y vivent Conditions Extrêmes de Croissance (1) Parmi les hyperthermophiles capables de vivre au dessus de 90°C, on ne rencontre pour l'instant que des archées. Les records actuels sont détenus par des archées cultivées en laboratoire : -113 °C pour Pyrolobus fumarii -121 °C pour un coque pas encore identifié (Science 2003, 301 p934) La température la plus élevée pouvant être supportée par des microorganismes est estimée à 140-150 °C (Trends Microbiol. 2004, 12 p58) mais cela reste à vérifier ?? Une archée piézophile (et hyperthermophile) du genre Pyrococcus vivant dans une source hydrothermale du rift médio-Atlantique à 4100 m de profondeur et capable de supporter 1184 atm (1200 bars) a été récemment décrite (ISME J. 2009, 3 p873). Conditions Extrêmes de Croissance (2) Thiobacillus ferrooxidans: Bactérie autotrophe, chimiolithotrophe, mésophile, aérophile et acidophile avec des valeurs de pH optimales entre 1 et 4. Psychromonas ingrahamii: Bactérie psychrophile se développe à des températures inf. à -10°C Deinococcus radiodurans: Bactérie chimio-organotrophe, hétérotrophe, aérobie strict, possédant 2 chromosomes avec 2 à 4 copies sous forme d'anneaux condensés visibles au microscope optique. capable de résister sans perte de viabilité à des doses de radiations ionisantes de 5000 Gray (soit 20 fois plus que Escherichia coli) Croissance Microbienne (1) En microbiologie, le terme « croissance » traduit en général l’augmentation du nombre de cellules dans une population: c’est la croissance de population Lorsque la taille d’une cellule bactérienne ou archée augmente, on parle alors de croissance cellulaire Il est important de rappeler que la plupart des microorganismes présents dans la nature n’ont pas encore été cultivés en laboratoire Ces organismes sont viables mais notre incapacité à les cultiver est liée à notre méconnaissance de leurs exigences de croissance. Cellules Viables mais non Cultivables (VBNC) Sous certaines conditions environnementales, certains microorganismes peuvent entrer dans ce que l’on appelle un état "viable mais non cultivable" (VBNC en anglais). Cet état dans lequel les cellules perdent peu à peu leur capacité à se diviser mais conservent une faible activité métabolique est considérée comme une stratégie de survie Pour mesurer le nombre de cellules VBNC, on se base sur des essais prenant en compte certaines propriétés physiologiques comme: -capacité respiratoire -intégrité de la membrane -activité métabolique -marquages immunologiques Croissance Microbienne (2) Au cours de la croissance et de la division, une bactérie peut synthétiser: -plus de 1800 protéines différentes -plus de 400 molécules différentes d’ARN -une copie complète de son génome -une membre cytoplasmique et si nécessaire le matériel pariétal pour entourer la nouvelle cellule. Temps de Génération Tous ces processus sont régulés pour produire une cellule dans un court laps de temps appelé: temps de génération (temps nécessaire pour qu’une de cellule double en nombre) La division en 2 cellules filles est appelée: scission transversale ou division par scissiparité En général, la taille d’une cellule bactérienne augmente avant la division. Cette phase du cycle cellulaire correspond donc à la croissance cellulaire. Exemples de Temps de Génération Temps de génération approximatives de quelques microorganismes cultivés dans des conditions optimales Mesure de la Croissance Microbienne (1) Méthodes directes: Pour la numération directe, on utilise une cellule de comptage (hématimètre de Thomas ou de Malassez), constituée: -d'une lame sur laquelle est gravée un quadrillage de dimensions connues -surmontée d'une lamelle placée à une distance connue -l'ensemble délimitant donc un volume connu. -L’échantillon de la suspension de cellules à compter est introduit entre lame et lamelle et observé au microscope. Hématimètre de Malassez L’ensembles des 100 grands carreaux représente un volume de 1µl 1 petit carreau= 1/20° du grand carreau Cellule bactérienne La numération directe au microscope ne permet pas toujours de savoir si les cellules sont viables Mesure de la Croissance Microbienne (2) Méthodes directes ??: Comptage de colonies (CFU ou colony forming unit): -une série de dilutions de la suspension cellulaire de l’échantillon est préparée -un volume connu de chaque dilution est entièrement étalé sur milieu gélosé -Après incubation, les colonies sont comptées en comportant entre 10 et 200 pour la précision de la mesure -le résultat est multiplié par la dilution correspondante pour obtenir la concentration cellulaire de la suspension initiale. Mesure de la Croissance Microbienne (3) Méthodes indirectes: Le poids sec ou biomasse est déterminé: -après dessiccation au four pour éliminer l'eau extra et intracellulaire d'un culot cellulaire correspondant à un volume de culture connu -Cette mesure est proportionnelle à la totalité des cellules mais nécessite un étalonnage avec une méthode de numération pour corréler la biomasse au nombre de cellules. Dosage chimique d’un composé cellulaire: -l’élément le plus souvent dosé est l’azote. -les cellules contiennent environ 14% d’azote. Son dosage dans un échantillon donné fournira une estimation assez précise de la biomasse totale. -Les cellules sont traitées par l’acide sulfurique afin de libérer et transformer l’azote cellulaire en ammoniaque. -La quantité NH4+ libérés est déterminée par méthode colorimétrique Mesure de la Croissance Microbienne (4) Méthodes indirectes: Absorbance ou densité optique (DO): -c'est une mesure turbidimétrique où la diminution de l'intensité lumineuse est due la dispersion de la lumière par les cellules en suspension. -un spectrophotomètre permet de mesure une absorbance (A) définie par l’équation A=DO=-log (I/IO) -I et Io sont reliés par la loi de Beer-Lambert où: DO= -logI/Io <--> I=Io.10-εLC = ε.L.C Source lumineuse Filtre Monochromateur Chambre de mesure λ(I) λ(Io) Lumière incidente (400 à 620 nm) Ecran de lecture Cuve en quartz Largeur 1 cm (L) Lumière transmise Mesure de la Croissance Microbienne (5) Méthodes indirectes: Absorbance ou densité optique (DO): -La DO est proportionnelle à la concentration de cellules, à condition de respecter la loi de Beer-Lambert (DO = ε.L.C ) et de faire le zéro du spectrophotomètre avec le milieu de culture. -Pour évaluer précisément la biomasse, la DO peut être corrélée au poids sec ou nombre des cellules donnant cette absorbance. -Le succès de la turbidimétrie est dû à sa simplicité, rapidité, reproductibilité et n’affecte pas les cellules. -La méthode n’est pas applicable aux cellules qui se développent en amas, en suspensions non homogènes (ex actinomycètes) ou faibles concentrations (moins de 107 cellules/ml; limite inférieure de turbidité visible) Description des Phases de Croissance (1) 1-­‐ Phase de latence (faculta&ve): Temps d'adaptation des cellules à de nouvelles conditions (mise en place de la machinerie cellulaire de synthèse) -aucune croissance n'est observée (pas d’augmentation du nombre de cellules). -On peut arriver à supprimer cette phase en réensemençant plusieurs fois de suite la culture dans les mêmes conditions. 2-­‐ Phase d’accéléra&on: Certaines cellules commencent à se diviser. Cette phase peut être très courte et n'est pas toujours visible Description des Phases de Croissance (2) 3-­‐ Phase exponen&elle: Toutes les cellules se divisent régulièrement et leur nombre double à intervalles de temps constants c'est-à-dire augmente selon une exponentielle de base 2 (2>>>4>>>8>>>16>>>32…..ou 2n) Équation de la phase ex est: NT= No x 2n No :Nbre de bactéries au début de la phase ex NT: Nbre de bactéries après un temps T de la phase ex n: nbre générations T: intervalle de temps entre No et NT nombre de générations (n) log NT = log No + nlog2 temps de génération (t) t = n/T n= log NT - log No log2 taux de croissance népérien (µ) exprimé (h-1)=pente µ = log2/t taux de croissance binaire µ = 1/t Description des Phases de Croissance (3) 4-­‐ Phase de ralen&ssement: Certaines cellules cessent de se diviser car les conditions de culture deviennent défavorables. -Soit un des constituants du milieu indispensable aux cellules est épuisé (cas courant) -soit un produit du métabolisme cellulaire s'est accumulé en entraînant des effets négatifs (variation de pH ou production d’éthanol pour certaines levures). 5-­‐ Phase sta&onnaire: il n'y a plus aucune division, mais une partie du métabolisme est encore actif ce qui permet certaines synthèses. Les cellules s'adaptent à des conditions de stress (carence nutritionnelle…). Contrairement une fausse idée très répandue, cette phase n'est absolument pas un équilibre entre des cellules qui meurent et d'autres qui se divisent ! Description des Phases de Croissance (4) 6-­‐ Phase de décroissance ou de déclin (faculta&ve): Les cellules meurent et lysent Exemple de Courbe de Croissance Bactérienne ! " # $ % 10 9 En haut: la représentation du nombre de bactéries en échelle arithmétique ne donne pas que peu d’informations >>> distinction entre phases de croissance difficile N (108 cellules/mL) 8 7 6 5 4 3 2 1 Au milieu: la représentation en log décimaux permet de distinguer 5 phases: 0 9 log(N) 8,5 -P. -P. -P. -P. -P. 8 7,5 7 Taux de croissance µ = Ln2/G (h -1) 6,5 6 Latence : Accélération : Exponentielle : Ralentissement: Stationnaire : 0 à 25 min 25 à 75 min 75 à 325 min 325 à 375 min à partir de 375 min Temps de génération (g): 35 min -1 Taux de croissance binaire 1/g (h ): 1,72 1 0,5 0 0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 Temps (min) Diauxie On parle de diauxie (du grec auxein "augmenter") lorsqu'il y a deux croissances à la suite l'une de l'autre, traduisant le plus souvent les utilisations successives de deux substrats différents. -Ce phénomène a été découvert par Jacques Monod en 1940. On observe une première croissance pendant laquelle seul le glucose est consommé, qui s'arrête lorsqu'il est épuisé. Après une phase de latence correspondant à l'induction de l'opéron lactose qui était réprimé par le glucose, une seconde croissance lui succède pendant laquelle le lactose est à son tour consommé. E. coli Glucose+lactose Consommation successive Diauxie présence d’opéron lactose E. coli Glucose+fructose Consommation simultanée Pas de diauxie absence d’opéron fructose Rappel: Principales Régulations chez les Bactéries Outre l'ensemble des régulations métaboliques faisant appel principalement aux enzymes allostériques (voir cours de biochimie), On peut citer (voir cours de génétique LV236) : Opérons, répression catabolique, atténuation Facteurs de transcription sigma alternatifs. Petits ARN régulateurs non codants (sRNA ou ncRNA) : anti-sens, interférents, microARN, snoRNA, ... Systèmes capteur/effecteur (sensor/effector) avec phosphorylation intermédiaire. Quorum sensing et peptide phéromone Exemples des 2 Derniers Types de Régulations Souvent Associés Production et excrétion d'un peptide phéromone servant de signal, par l'ensemble des cellules de la culture Accumulation de ce peptide signal dans le milieu au fur et à mesure de la croissance Fixation de ce peptide signal sur le récepteur du domaine extracellulaire d'une protéine transmembranaire servant de "capteur" (sensor) Déclenchement du signal au delà d'un certain seuil de concentration du peptide, correspondant à une densité cellulaire particulière (quorum sensing) La protéine "capteur" est activée et son domaine intracellulaire possède une activité kinase qui phosphoryle une protéine cytoplasmique régulatrice (effector) La protéine régulatrice activée peut alors se fixer spécifiquement sur certains promoteurs cibles pour activer ou inhiber la transcription des gènes correspondants Pratique de la Culture de Microorganismes Stérilité et Sécurité (voir TP) Conservation des Microorganismes Les souches de microorganismes peuvent être préservées sur plusieurs années, pour constituer des "collections" : -Par congélation à -80°C ou mieux à -196°C en azote liquide (surtout pas à -20°C), en présence de composés cryoprotecteurs comme le glycérol. -Par lyophilisation ou déshydratation sous vide et à froid (efficace pour la plupart des procaryotes et limitée pour les eucaryotes) Institutions Internationales « Collections des Souches » Collections de microorganismes dans des institutions internationales à la disposition de la communauté scientifique -France CIP= Collection de l'Institut Pasteur à Paris. -Belgique BCCM= Belgian Co-ordinated Collections of Micro-organisms à Bruxelles -Allemagne DSMZ= Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen à Braunschweig. -Etats-Unis ATCC= American Type Culture Collection à Manassas en Virginie. -Japon JCRB= Japanese Collection of Research Bioresources à Osaka. Site Internet de la Microbiologie à l’UPMC Adresse Internet du site http://www.edu.upmc.fr/sdv/microbiol/ Les supports de cours sont en accès privés et nécessitent Loggin: Mot de passe: http://www.edu.upmc.fr/sdv/microbiol/VF/L3/docs-L3.htm
