VitriFreeze ES - JCD Laboratoires

VitriFreeze ES™ – VitriThaw ES™
MILIEUX UNIVERSEL POUR LA VITRIFICATION ET
LA DECONGELATION DES EMBRYONS DU STADE PRECOCE
(2PN) JUSQU'AU STADE BLASTOCYSTE
KIT VITRIFREEZE – REF. VFKIT1-ES
KIT VITRITHAW – REF. VTKIT1-ES
La vitrification est une méthode de cryoconservation au cours de laquelle une solution liquide est
transformée en un solide amorphe sans aucune structure cristalline (Rall and Fahy 1985).
La vitrification ultra rapide de zygotes et d’embryons en utilisant des dispositifs « ouverts » tels que « Hemistraw ou Vitriplug », qui permettent un contact direct avec l’azote liquide a conduit à la naissance de
nombreux bébés (Vanderzwalmen, 2003).
Pour respecter les exigences Européennes de sécurité médicale, des dispositifs fermés hermétiquement
(aseptiques)ont été développés pour éviter le contact direct entre l’embryon et l’azote liquide durant le
refroidissement et le stockage à long terme.
le VitriSafe (MTG) a été conçu Pour s’adpter à cette technique (Vanderzwalmen, 2009).
Ce dispositif consiste en une paillette interne présentant une gouttière dans laquelle un petit volume de
solution cryoprotectrice est déposé avec 1 ou 2 embryons. Ce dispositif interne est inséré dans une paillette
extérieure protectrice scellée avant immersion dans l’azote liquide.
Cependant, du fait de l’isolation thermique, la vitesse de refroidissement dans ces dispositifs est réduite par
rapport aux dispositifs ouverts. Par conséquent plus de cryoprotecteur doit pénétrer dans les cellules pour
garantir l’état intra cellulaire.
Le kit Vitrifreeze ES est conçu pour permettre à suffisamment de cryoprotecteurs de rentrer dans l’embryon
aux différents stades de développement.
Durant le réchauffement, le kit VitriThaw permet d’ôter graduellement les cryoprotecteurs.
COMPOSITION KITS VITRIFREEZE ES – VITRITHAW ES
4 bis Quai J.J. Rousseau 69350 La Mulatière – tel. 04.72.98.04.84 / Fax : 04.72.98.31.48 - e-mail : [email protected]
Milieu de pré-incubation /
Milieu de décongélation (Thaw 5)
Composant
Approx %
Eau
NaCl
KCl
KH2PO4
Na2HPO4
HSA
Milieu de vitrification 1
>90%
<1%
<1%
<1%
<1%
2%
Composant
Approx.%
Tampon PBS
Sulfoxyde de diméthyle (DMSO)
Ethylène Glycol
5%
90%
5%
Milieu de vitrification 2
Milieu de décongélation 1,2,3,4
Composant
approx %
T a m p o n
>75%
Sucrose
<25%
Composant
Approx.%
Tampon PBS
Sulfoxyde de diméthyle (DMSO)
Ethylène Glycol
10%
Milieux de vitrification 3
Composant
Approx.%
P B S Tampon PBS
Sulfoxyde de diméthyle (DMSO)
Ethylène Glycol
Sucrose
<15%
Ficoll
<2%
80%
10%
>40%
20%
20%
Présentation du Kit VitriFreeze ES™ :
- 1 flacon de 5 ml de milieu de pré-incubation VitriFreeze ES
- 1 flacon de 1ml de milieu de vitrification 1 VitriFreeze ES (5% DMSO-5% EG)
- 1 flacon de 1 ml de milieu de vitrification 2 VitriFreeze ES (10% DMSO-10% EG)
- 1 flacon de 1 ml de milieu de vitrification 3 VitriFreeze ES (20% DMSO-20% EG)
Présentation du Kit VitriThaw ES™:
- 1 flacon de 5 ml de milieu de décongélation 1 VitriThaw ES
- 1 flacon de 1 ml de milieu de décongélation 2 VitriThaw ES
- 1 flacon de 1 ml de milieu de décongélation 3 VitriThaw ES
- 1 flacon de 1 ml de milieu de décongélation 4 VitriThaw ES
- 1 bouteille de 1 ml de milieu de décongélation 5 VitriThaw ES
Conservation : 6 mois entre + 2 °C et + 8
MODE D’UTILISATION
Veiller à ce que tous les milieux soient bien mélangés avant utilisation. Nous vous recommandons de bien
respecter toutes les étapes de la procédure de vitrification/décongélation.
Etapes préliminaires
4 bis Quai J.J. Rousseau 69350 La Mulatière – tel. 04.72.98.04.84 / Fax : 04.72.98.31.48 - e-mail : [email protected]
Dans une boîte 4 puits, remplir le premier puit avec 300µl de milieu de pré-incubation, le second avec 50µl
de milieu de vitrification 1, le troisième avec 50µl de milieu de vitrification 2 et le quatrième avec 50µl de
milieu de vitrification 3. Ensuite, préparer autant de dispositifs de vitrification nécessaires (sachant qu’un
dispositif peut contenir 1 ou 2 embryons).
Protocole de refroidissement en utilisant un dispositif fermé aseptique
Ramener tous les milieux du kit à température ambiante avant utilisation.
Temps d’exposition des embryons aux solutions de vitrification
Stade de
développement
Zygote-2 cellules
4-8 cellules
Morula
Blastocyste
Blastocyste expansé
Pré-incubation
2 min
2 min
2 min
2 min
2 min
VitriFreeze
1 ES
5 min
5 – 7 min
5 – 7 min
5 – 7 min
5-10 min
VitriFreeze
2 ES
5,30 min
4 min
4 min
4 min
4 min
Vitrifreeze
3 ES
40-60 sec
40-60 sec
40-60 sec
40-60 sec
40-60 sec
Vitrification
1. Déposer 2 embryons au maximum dans un petit volume de VitriFreeze ES 3, dans la gouttière du
dispositif de vitrification (Vitrisafe).
2. Insérer le dispositif dans une paillette de congélation .
3. Sceller la paillette de congélation et plonger immédiatement dans l’azote liquide.
Remarque : la procédure complète de vitrification pour placer l’embryon dans le vitrifreeze 3, monter
l’embryon sur le dispositif, l’insérer dans la paillette externe et la sceller ne doit pas excéder 60 secondes
avant de la plonger dans l’azote liquide.
Protocole de refroidissement en utilisant un dispositif ouvert
Ramener tous les milieux du kit à température ambiante avant utilisation.
Temps d’exposition des embryons aux solutions de vitrification
Stade de
développement
Zygote-2 cellules
4-8 cellules
Morula
Blastocyste
Blastocyste expansé
Pré-incubation
2 min
2 min
2 min
2 min
VitriFreeze 1
ES
2 min
2 min
2 min
2 min
VitriFreeze 2
ES
3 min
3 min
3 min
3 min
Vitrifreeze 3
ES
30-40 sec
30-40 sec
30-40 sec
30-40 sec
2 min
2 min
4 min
30-40 sec
Décongélation
Remarque : Le milieu de décongélation VitriThaw ES 1 ou VitriThaw ES 2 (en cas de dispositif ouvert) doit
être chauffé à 37°C, les autres milieux du kit de décongélation doivent être ramenés à température
ambiante (22°C) avant utilisation.
1. Enlever le dispositif de vitrification scellé du container et le placer rapidement dans un récipient
isotherme rempli avec de l’azote liquide (une période prolongée à l’air ambiant peut réchauffer et
détruire les embryons)
2. Placer le récipient à proximité du microscope et de la boite contenant le milieu de décongélation 1
VitriThaw ES.
3. Assurez-vous que le bout de la gouttière est sous le niveau d’azote liquide, couper la partie
supérieure de la paillette.
4. Sortir le dispositif de vitrification de la paillette et
5. Immédiatement plonger le bout du dispositif de vitrification dans le milieu de décongélation VitriThaw
1 préchauffé à 37°C
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Protocole de réchauffement en utilisant un dispositif fermé aseptique
Stade de
développement
Thaw
1
Thaw *
Thaw 2
Thaw 3
Thaw 4
Thaw 5
Zygote-2 cellules
4-8 cellules
1 min
1 min
1 min
1 min
1-2 min
1-2 min
2-4 min
2-4 min
2-4 min
2-4 min
Morula
1 min
1 min
1-2 min
2-4 min
2-4 min
Blastocyste
Blastocyste expansé
1 min
1 min
1 min
1 min
1-2 min
1-2 min
2-4 min
2-4 min
2-4 min
2-4 min
laver 1’-2’
Avant le
transfert
Dans le
milieu de
culture
* Mélange de VitriThaw ES 1 et VitriThaw ES 2
Protocole de réchauffement en utilisant un dispositif ouvert
Stade de développement
Thaw 2
Thaw 3
Thaw 4
Thaw 5
Zygote-2 cellules
4-8 cellules
2 min
2 min
2-4 min
2-4 min
2-4 min
2-4 min
Morula
2 min
2-4 min
2-4 min
Blastocyste
Blastocyste expansé
2 min
2 min
2-4 min
2-4 min
2-4 min
2-4 min
laver 1’-2’
Avant le
transfert
Dans le
milieu de
culture
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