application au contrôle des peintures antisalissures

INNOVATION
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8 - 2011
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Détection du dibutyl
et tributylétain par un bioessai
bactérien : application au contrôle
des peintures antisalissures
par Marie-José DURAND
Maître de conférences
Université de Nantes, UMR CNRS 6144 GEPEA, laboratoire CBAC (La Roche-sur-Yon)
Résumé :
Actuellement, les peintures employées comme agents antisalissures ne
doivent plus utiliser le tributylétain comme biocide. Cependant, les moyens disponibles
pour contrôler la réglementation sont réduits à une vérification du certificat adminis-
tratif des systèmes antisalissures présent à bord du navire. Nous avons développé un
bioessai utilisant une bactérie bioluminescente qui pourrait permettre de vérifier
rapidement et à faible coût le respect de la réglementation concernant les systèmes
antisalissures.
Abstract :
Since the 1960’s, Tributyl (TBT)-based antifouling paints are widely
applied to protect ship’s hulls from biofouling. Due to its high toxicity to aquatic eco-
system, most of the countries signed the AFS convention to control the use of harmful
antifouling systems on ships. Nevertheless, there is currently no simple method to
control the presence of organotin in paint. In this study we propose a bioassay based
on the use of a recombinant bioluminescent bacteria to detect directly in paint the pre-
sence of TBT.
Mots-clés :
Organoétain, détection, bioessai, luminescence, peinture antisalissure.
Keywords : Organotin, paint, bioluminescence, bacteria, detection.
Points clés
Domaine : Technique d’analyse
Degré de diffusion de la technologie : Émergence | Croissance | Maturité
Technologies impliquées : bioessai-bactérie bioluminescente
Domaines d’application : environnement
Principaux acteurs français :
Centres de compétence : UMR CNR 6144 GEPEA laboratoire CBAC, université de
Nantes – Institut de génétique et microbiologie UMR 8221 – Université de Paris
Sud 11 – UMR CNRS 7146-LIBE, université de Metz.
Autres acteurs dans le monde : Un grand nombre de laboratoires ou de
centres de recherche travaillent dans le domaine de la détection à l’aide de
bactéries bioluminescentes. Les principaux travaux sont référencés dans la biblio-
graphie.
Au niveau des acteurs industriels, on peut citer Aboatox (Finlande), Vigicell
(France) qui proposent des bactéries bioluminescentes pour la détection du
mercure et de l’arsenic.
De nombreuses sociétés distribuent des systèmes permettant d’évaluer la toxicité
globale à l’aide de bactéries bioluminescentes (Bionef, SDIX, Checklight Ltd.,
Hach-Lange)
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1. Contexte
En 2001, la Communauté européenne publie une liste de 33
substances prioritaires dans le cadre du contrôle de la sur-
veillance de l’eau (2000/60/CE, directive cadre sur l’eau).
Parmi ces substances, on trouve les composés du tributylétain.
Ces composés sont utilisés comme stabilisateurs thermiques
dans l’industrie plastique, comme catalyseur dans la fabrica-
tion des mousses polyuréthanes et pour leurs propriétés anti-
microbiennes. L’activité antimicrobienne du tributylétain (TBT)
a été exploitée dans la fabrication de peintures antisalissures
pour protéger les coques des bateaux et les installations
portuaires immergées. Le TBT et son produit de dégradation le
dibutylétain (DBT) ont donc été à l’origine d’une contamina-
tion généralisée des ports et des côtes, les effets toxiques sur
la faune marine ont conduit à interdire son application à partir
du 1
er
janvier 2003.
Depuis le 1
er
janvier 2008, la présence de TBT est interdite
sur tous les bateaux battant pavillon des 47 pays signataires
de la convention de l’Organisation maritime internationale
(Convention AFS de 2001, International Convention on Control
of harmful Antifouling System on ship ).
Les techniques analytiques de dosage du TBT nécessitent
une étape de préparation de l’échantillon complexe et sont
donc difficilement applicables dans les contrôles de routine.
Actuellement, il n’existe pas de moyen simple permettant de
vérifier l’absence de TBT dans les peintures antisalissures.
Nous avons développé un bioessai à l’aide d’une bactérie bio-
luminescente sensible au TBT et DBT, cet essai a été appliqué
avec succès au dépistage du TBT dans les peintures ; il pour-
rait constituer un moyen rapide de détection des fraudes, per-
mettant ainsi un contrôle efficace de la législation sur les
systèmes antisalissures.
2. Systèmes antisalissures à base
d’organoétain
Ce phénomène de fouling est largement étudié : des macro-
molécules (polysaccharides, protéines, protéoglycanes...) pré-
sentes dans l’eau de mer se déposent sur les surfaces,
favorisant l’installation des bactéries, microalgues et champi-
gnons. Ces unicellulaires forment à leur tour un substrat atti-
rant des protozoaires, puis des organismes fixés tels que
mollusques et macroalgues. La colonisation sera d’autant plus
rapide que l’eau sera chaude. Les parties immergées des
navires peuvent être rapidement (moins de 6 mois) recou-
vertes de salissure, conduisant à une surconsommation de
carburant (jusqu’à 40 %) due à l’augmentation de la charge et
aux forces de frottement ; ce fouling est également respon-
sable de corrosion du revêtement.
La colonisation des coques de navire peut également
conduire à l’introduction d’espèce invasive absente dans un
écosystème (par exemple Crepidula fornicata , espèce origi-
naire de la côte est de l’Amérique du Nord, introduite en
Europe au cours de la Seconde Guerre mondiale). Pour empê-
cher la fixation des organismes, un nettoyage de la coque
sous la ligne de flottaison et une protection par des molécules
antifouling sont indispensables. Dès le XVIII
e
siècle, des
feuilles de cuivre étaient fixées sur les coques pour lutter
contre le fouling ; peu à peu, ce système a été remplacé par
des peintures dites « peintures antifouling ». Ces peintures
sont composées de deux éléments principaux : une matrice et
un biocide ; pour les plus anciennes, des métaux constituaient
le biocide (cuivre, arsenic, zinc, mercure).
Les peintures à base de TBT sont apparues dans les années
1950 et se sont généralisées dans les années 1970 en raison
de leur grande efficacité pour un coût de production faible. On
distingue principalement deux types de système antifouling à
base de TBT : les peintures à matrice érodable et celles à
matrice autopolissante [1]. Les peintures à matrice éroda-
ble sont formulées en incorporant par exemple le TBT à une
résine vinylique, le TBT est relâché par lixiviation et forme un
film protecteur à la surface de la coque. Le défaut majeur de
ces peintures réside dans le fait que la concentration en TBT
diminue fortement au cours du temps, comme le montre la
figure 1 , cela étant dû au relarguage non contrôlé du TBT,
limitant la durée de vie de ces peintures à 36 mois. La
seconde génération de peintures est apparue dans les années
1970 ; celles-ci sont constituées de copolymères organométal-
liques (acrylate de tributylétain, figure 1 ) : le TBT est libéré
par hydrolyse de la liaison ester permettant une libération
constante du biocide au cours du temps. La durée de vie de
ces systèmes antisalissures est d’environ 5 ans [1] [2]. La
quantité de TBT relâchée par ce type de peinture est estimée
à 1,6 µ g Sn · cm
–2
, cette diffusion correspond, pour un bateau
commercial (de plus de 25 m) restant trois jours dans un port
à une libération d’environ 200 g de TBT dans l’eau [3].
3. Propriétés physico-chimiques,
effets toxiques du TBT
et conséquences réglementaires
3.1 Propriétés physico-chimiques
Le tributylétain et ses dérivés appartiennent à la famille des
organostanniques. Ils ont pour formule chimique générale
R
( n –1)
Sn X
n
(0 < n < 4), où R représente un groupement alkyl
ou phényl et X un groupe anionique (halogénure, oxyde,
hydroxyle). La liaison covalente Sn—C est stable à la tempéra-
ture, en présence d’eau et d’oxygène. La nature de X influence
les propriétés physico-chimiques, comme la solubilité dans
l’eau et dans les solvants non polaires. La solubilité diminue
avec l’augmentation du nombre de substituants organiques et
avec l’augmentation de la taille des chaînes carbonées [3].
En raison de sa faible solubilité dans l’eau (moins de
10 ng · L
–1
, à pH 7 et 20
o
C), de son log Kow (coefficient de
partage octanol/eau) de l’ordre de 4,4 à pH 8, le TBT disparaît
rapidement de la colonne d’eau pour se fixer aux particules en
suspension dans l’environnement aquatique et s’accumule
dans les sédiments [4] [5]. Le temps de demi-vie dans l’eau
de mer est de six jours à quelques mois, alors que dans les
sédiments il varie de un à cinq ans. L’adsorption et la
désorption du TBT sur les sédiments sont influencées par les
conditions physico-chimiques du milieu (pH, salinité). Cette
réversibilité peut expliquer la contamination de l’eau observée
lors du dragage des ports.
Dans l’environnement, le TBT peut subir des dégradations
par déalkylation pour donner du dibutylétain (DBT), monobu-
tylétain (MBT) et de l’étain, ce processus peut être biotique ou
abiotique. La biodégradation est un processus important de
transformation du TBT, plusieurs bactéries du genre Pseudo-
monas ont été isolées [6], mais aussi des microalgues. À
noter que ce processus est fortement dépendant des
conditions environnementales (température, pH, oxygène).
Les salissures , désignées communément par le terme
anglais « fouling » désigne un phénomène naturel de
colonisation des organismes marins sur les coques des
navires et sur les installations immergées des installations
portuaires.
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3.2 Effets toxiques pour les organismes
marins
La toxicité des organoétains est largement documentée [4] [5]
[7], le TBT est considéré comme l’une des molécules les plus
toxiques introduites délibérément dans l’environnement marin.
La toxicité du TBT diminue avec la déalkylation en DBT et MBT.
Les effets toxiques des peintures antifouling ont été mis en
évidence, dès les années 1970, sur les organismes non cibles
comme les huîtres. Les activités ostréicoles ont été fortement
perturbées, en particulier dans le bassin d’Arcachon (France)
dès 1976 où les huîtres présentaient des malformations de la
coquille, désignées sous le terme de « chambrage »
(figure 2 ). Rapidement, différentes études ont montré que les
composés organostanniques et en particulier le TBT étaient
responsables de ces anomalies [8] [9]. Le TBT présente des
effets toxiques sur les organismes marins à de très faibles
concentrations, de l’ordre du ng · L
–1
. Il est considéré comme
un puissant perturbateur endocrinien ; en effet, il provoque
l’apparition de caractère mâle chez les gastéropodes femelles,
nommé « imposex ».
De par ses propriétés physico-chimiques (log Kow), le TBT
peut s’accumuler dans les tissus adipeux des organismes
marins. Le TBT et ses dérivés sont également immuno-
toxiques, neurotoxiques et embryotoxiques.
3.3 Réglementation sur l’utilisation
des peintures antifouling à base de TBT
En raison de leur forte toxicité et des conséquences écono-
miques néfastes sur l’activité ostréicole, la France a été le pre-
mier pays à interdire l’usage des peintures antisalissures à
base d’organoétains par décret en date du 17 janvier 1981
pour les bateaux de moins de 25 mètres de long. Dans un
premier temps, seuls les départements riverains de la Manche
Figure 1 – Peintures antisalissures et leur efficacité dans le temps [2]
Concentration efficace de TBT
23
Efficacité
Efficacité
14 52314
Temps (année)Temps (année)
TBT
Carène
Matrice Copolymère
amatrice érodable bmatrice autopolissante
Figure 2 – Malformation de la coquille d’une huître : chambrage
(IFREMER)
IFREME
R
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et de l’Atlantique ont été concernés, puis rapidement cette
interdiction s’est étendue à toute la côte. Des mesures
comparables ont été reprises en Grande-Bretagne, puis dans
différents pays à partir de 1988 (États-Unis, Canada, Nou-
velle-Zélande...). L’Organisation maritime internationale (IMO,
International Maritime Organization ) propose l’interdiction du
TBT suite aux recommandations du MEPC (Marine
Environment Protection Commitee ) comme agent antisalis-
sure. La convention ASF est adoptée le 5 octobre 2001,
reprise par le règlement européen CE n
o
782/2003 du
14 avril 2003 [10]. À partir du 1
er
janvier 2003, les
peintures à base de TBT ont été interdites et la présence de
TBT sur les coques des bateaux est interdite depuis le
1
er
janvier 2008. Les anciennes peintures ont dû être enlevées
ou stabilisées pour prévenir tout risque de contamination du
milieu marin par les organostanniques.
L’application de cette réglementation s’applique à tous les
navires dont les pays ont signés la convention ASF. En France,
selon le décret n
o
2008-1125 du 3 novembre 2008 , un
navire peut être inspecté dans tout port, chantier naval ou
terminal au large. Le navire doit avoir à bord un certificat
international du système antisalissure , ou une décla-
ration en cours de validité (article 11, décret n
o
2008-1125
du 3 novembre 2008). En cas de doute, un échantillonnage du
système antisalissure du navire qui ne nuise ni à l’intégrité, ni
à la structure, ni au fonctionnement peut être effectué. Le
décret stipule que le délai requis pour traiter les résultats de
cet échantillonnage ne doit pas empêcher le mouvement et le
départ du navire (article 11).
3.4 Méthode de détection des organoétains
La méthode de quantification des organoétains la plus utili-
sée est la chromatographie en phase gazeuse couplée à
différents détecteurs comme la photométrie de flamme
(GC-FPD), la photométrie de flamme pulsée (GC-PFPD), la
spectrométrie d’émission atomique (GC-AED), la spectromé-
trie de masse (GC-MS) [11]. Cette technique fait l’objet de la
norme ISO NF 23161-2009 (méthode d’identification et de
quantification des organostanniques applicable aux sols,
sédiments, boues). La préparation des échantillons nécessite
d’extraire les composés organostanniques, puis d’effectuer
une dérivation pour rendre les composés volatils.
Les méthodes chimiques sont sensibles et permettent
d’identifier le TBT à des concentrations de l’ordre du ng · L
–1
dans l’eau, et de 20 µ g Sn · kg
–1
pour les sédiments (matière
sèche). Cependant, elles sont longues et nécessitent un per-
sonnel qualifié pour les réaliser. D’autre part, le coût de l’ana-
lyse du TBT, DBT et MBT pour un échantillon de peinture est
de 154,50 euros (donnée de 2010). Ces techniques sont donc
peu applicables au contrôle rapide lors de l’inspection des
navires.
Une méthode d’inspection basée sur la détection de l’étain
par un appareil portatif de spectrométrie à fluorescence
de rayons X (SFX) a été proposée par une équipe
japonaise : le prélèvement de l’échantillon se fait par un
papier abrasif [12], cela peut donc entraîner une altération de
la coque et être refusé par les armateurs.
Actuellement, il n’existe pas de méthode simple, non des-
tructive et rapide permettant de vérifier le respect de la
convention ASF sur les systèmes antifouling [13] [14].
Pour pallier ce manque, nous proposons d’utiliser une
bactérie bioluminescente capable d’émettre de la lumière en
présence de TBT.
4. Détection du TBT par la bactérie
bioluminescente Escherichia coli TBT3
4.1 Construction de la bactérie
L’utilisation des bactéries bioluminescentes comme Vibrio
fischeri (reclassé Aliivibrio fischeri ), pour révéler la toxicité de
composés chimiques ou d’échantillon de l’environnement
(effluent, lixiviat de sol...) est très utilisée et fait l’objet d’une
norme (NF EN ISO 11348). Au contact d’un échantillon
toxique, on observe une diminution de la luminescence
mesurée facilement à l’aide de luminomètres commerciaux.
Plusieurs applications commerciales sont disponibles telles que
le Microtox® (distribué par SDIX), le LUMIStox (Dr Lange),
TOXcontrol (distribué par Bionef).
Les études sur la bioluminescence bactérienne menées dès
1979 ont montré que les gènes permettant la synthèse des
enzymes responsables de cette réaction sont regroupés en
opéron appelé « opéron lux » (gènes lux A, lux B, lux C, lux D
et lux E , et leurs gènes régulateurs) [17]. Les gènes lux A et
B codent pour la luciférase, les gènes lux C , lux D et lux E
pour les enzymes responsables de la synthèse de l’aldéhyde
(figure 3 ). La connaissance de la génétique de la réaction de
bioluminescence a permis d’utiliser les gènes lux A et B ou les
cinq gènes comme gènes rapporteurs dans le suivi in vivo de
l’expression de gènes. Des fusions transcriptionnelles entre le
promoteur d’un gène (par exemple de dégradation d’un pol-
luant, un gène de réponse à un stress) et les gènes impliqués
dans la bioluminescence permettent d’obtenir des bactéries
émettant de la lumière en présence du polluant ou d’un
stress. Deux techniques de clonage sont utilisées : la méthode
par clonage direct et par clonage aléatoire.
■
La méthode de clonage direct est appliquée lorsque les
promoteurs inductibles sont connus. À titre d’exemple, elle a
été appliquée pour construire différentes bactéries du genre
Escherichia coli , capables de produire de la lumière en pré-
sence de métaux [18] [19].
■
La méthode aléatoire est appliquée lorsque, comme dans
le cas des organostanniques, aucun promoteur spécifique n’a
été décrit. Dans ce cas, les gènes de bioluminescence sont
insérés au hasard dans le chromosome de la bactérie
Escherichia coli [20]. Cette insertion est réalisée grâce à un
transposon modifié possédant les gènes de bioluminescence
(dépourvus de leur promoteur), des fusions transcriptionnelles
uniques sont donc réalisées à différents endroits du génome de
la bactérie. On obtient une banque de clones (plusieurs centai-
nes de clones bactériens) qui sont exposés au polluant recher-
ché, dans notre cas le TBT. Les clones sont ensuite
sélectionnés pour leur capacité à produire de la lumière en pré-
sence du polluant à détecter, dans notre cas le TBT (figure 4 ).
Le principe était de développer une bactérie dont la bio-
luminescence serait augmentée (induction) en présence
d’un polluant comme le TBT.
La bioluminescence est un phénomène naturel de pro-
duction de lumière par des organismes vivants. Parmi ces
organismes, on retrouve plusieurs espèces bactériennes
majoritairement des espèces marines. La réaction est cata-
lysée par une enzyme : la luciférase. Cette enzyme cata-
lyse l’oxydation en présence d’oxygène, d’un aldéhyde à
longue chaîne et de flavine mononucléotide réduite
(FMNH
2
) en acide gras et en FMN. Cette réaction
s’accompagne de l’émission de lumière à 490 nm et
590 nm comme le montre la figure 3 [15] [16].
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Figure 3 – Réaction biochimique de la luminescence d’une bactérie naturelle comme Vibrio fischeri ( Aliivibrio fischeri ) en présence
d’oxygène : la luciférase catalyse l’oxydation d’un aldéhyde et de flavine mononucléotide réduite (FMNH
2
) en acide gras et FMN
Figure 4 – Méthode par mutagenèse aléatoire pour obtenir la bactérie Escherichia coli TBT3
Chromosome
LUCIFÉRASE
Opéron lux
Issu
du métabolisme
FMNH2
O2
RCHO
O2
FMN
490 nm et 590 nm
Lux C Lux D Lux A Lux B
TransféraseRéductase Synthétase
Luciférase
bactérienne
Synthèse de l’aldéhyde
+
Lux E
RCOOH
Opéron lux : gènes impliqués dans la synthèse et la régulation
des protéines nécessaires à la réaction de bioluminescence.
Un transposon (pMiniTn5lux AB) possédant les gènes de bioluminescence lux AB dépourvu de leur
promoteur est intégré dans la bactérie. Les gènes lux AB vont s’intégrer dans le chromosome au hasard, on
obtient une banque de clone. Chaque clone est exposé au TBT ( ), seul le clone luminescent sera conservé.
luxA
luxB
tetA
tnpA
mob
ori R6K
luxA
luxB
tetA
tnpA
mob
ori R6K
luxA
luxB
tetA
tnpA
mob
ori R6K
luxA
luxB
tetA
tnpA
mob
ori R6K
luxA
luxB
tetA
tnpA
mob
ori R6K
Intégration du plasmide dans
Escherichia coli DH1
Intégration aléatoire du miniTn5lux AB
dans le chromosome
+ TBT
+ TBT
+ TBT
+ TBT
Sélection du clone luminescent
après exposition au TBT
pMiniTn5lux AB
(le plasmide ne
se réplique pas)
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