Stratégies de co-synthèse de protéines recombinantes

Université de Bourgogne
Dijon
M 1 Biochimie
Année 2005 – 2006
TER
STRATEGIE DE COEXPRESSION
DE PROTEINES
RECOMBINANTES
Tuteur : Pr. Mustapha CHERKAOUI-MALKI
Yannis DUFFOURD
Anne-Claire GIRARD

STRATEGIE DE COEXPRESSION DE PROTEINES
RECOMBINANTES
SOMMAIRE :
INTRODUCTION………………………………………………………………………...3
I. INGENIERIE DES PROTEINES RECOMBINANTES……………………………..4
II. LA COEXPRESSION COMME STRATEGIE POUR AMELIORER LA
PRODUCTION DE PROTEINES RECOMBINANTES CHEZ E. COLI………….7
III. AUTRES EXEMPLES DE COEXPRESSION……………………………………...10
CONCLUSION…………………………………………………………………………..10
BIBLIOGRAPHIE………………………………………………………………………12

STRATEGIE DE COEXPRESSION DE PROTEINES
RECOMBINANTES
INTRODUCTION :
Les vingt dernières années ont vu de nombreux progrès dans la génomique et la
protéomique. L’analyse des génomes et des protéomes, ainsi que de leurs interactions
nécessite la production de matériels d’étude tels que des protéines.
Les protéines sont de nos jours d’une importance fondamentale pour la recherche ainsi
que pour le milieu industriel. C’est pourquoi notre intérêt s’est porté sur la production de
protéines recombinantes.
Une protéine recombinante est qualifiée ainsi dans la mesure où elle est produite de
manière exogène dans une cellule dont l’ADN a été modifié par recombinaison génétique. Ce
processus biotechnologique s’appuie sur :
- l’emploi d’un vecteur transportant le gène d’intérêt codant pour la protéine
recherchée.
- L’utilisation d’une cellule hôte qui sera chargée de synthétiser la protéine via le gène
inséré.
- Des phases de production, de séparation et d’extraction de la protéine de la cellule
hôte dans laquelle elle a été produite.
Ce procédé biotechnologique permet de produire des molécules trop complexes à
synthétiser chimiquement. Ainsi, l’enjeu économique de cette stratégie est énorme,
notamment pour l’industrie pharmaceutique. Mais l’intérêt de cette synthèse est aussi valable
pour le domaine de la recherche, où la production de protéines est un besoin fondamental pour
leur étude, ainsi que pour la génétique.
En premier lieu, nous décrirons d’une manière générale la production de ces protéines,
ainsi que les problèmes rencontrés lors de leurs synthèses, en particulier ce qui concerne les
problèmes d’agrégation ainsi que de dénaturation des molécules produites.
Puis nous traiterons les solutions qui peuvent être apportées à ces soucis de production,
avec une attention particulière sur la stratégie de coexpression de protéines telles que des
chaperonnes. Nous terminerons cette étude par d’autres exemples de coexpression des
protéines recombinantes, dans différents modèles d’hôte.

IV. INGENIERIE DES PROTEINES RECOMBINANTES :
La synthèse de protéines recombinantes requiert de nombreuses étapes. Il est tout
d’abord nécessaire de choisir un hôte, chargé de produire les protéines désirées. Le choix est
relativement vaste, cependant il semble plus facile de montrer la stratégie de production chez
un hôte bien connu tel que Escherichia coli. Nous expliquerons donc le choix des hôtes ainsi
que des conséquences qui en découlent.
Prenons donc la stratégie de synthèse de protéine recombinante chez E. coli. Le choix
d’un vecteur d’expression constitue l’étape suivante. Le gène d’intérêt va donc être cloné dans
un vecteur plasmidique d’expression après avoir été amplifié par PCR. Le plasmide utilisé
peut varier d’un modèle à l’autre, par exemple Jeong & Lee (1999) ont utilisé dans leurs
travaux sur la production de leptine chez E. coli, le plasmide pET21c (figure 1). Celui-ci
comporte donc des sites de clonage : ici BamHI et NdeI ; le gène est placé sous le contrôle
d’un promoteur inductible, et le plasmide comprend aussi un gène de résistance permettant la
future sélection des bactéries.
Après insertion du gène, le plasmide sera utilisé pour transformer la souche bactérienne
E. coli. Les souches transformées seront sélectionnées grâce à la résistance introduite via le
plasmide et pourront alors produire la protéine issue de la transcription puis de la traduction
du gène d’intérêt (gène obese ici).
Dans l’exemple cité ci-dessus, la protéine est produite dans une cellule procaryote : la
bactérie E. coli. Le choix d’un hôte procaryote est déterminé par plusieurs critères,
notamment la complexité de la protéine à produire. Souvent, l’absence de système de
modification post-traductionnelle eucaryote (notamment la glycosylation) pose un sérieux
problème quant à la production de protéines plus élaborées. Les procaryotes sont capables de
Figure 1 : Plasmide utilisé pour la
production de leptine par Jeong & Lee
(1999).

synthétiser de ce fait des quantités très importantes de protéines, ce qui d’un point de vue
industriel est très intéressant, d’autant que la culture de ces organismes est très peu coûteuse.
Un autre inconvénient des procaryotes consiste en la récupération des protéines. En effet les
protéines ont tendance à s’agréger lorsque celles-ci sont produites en grandes quantités, la
formation de corps d’inclusion est alors souvent observée.
Les cellules de levure sont également bon marché. Il existe chez cet hôte un système de
glycosylation, mais incomplet par rapport aux eucaryotes. Les cellules d’insecte sont très
utilisées, via le baculovirus comme vecteur d’expression, et permettent une maturation
correcte des protéines recombinantes ainsi qu’un haut rendement, mais les conditions de
culture sont bien différentes, nécessitant l’apport de sérum et coûtant très chères.
Il est possible aussi d’utiliser une cellule d’eucaryote supérieure en prenant garde à la
protéolyse, comme décrit par Hoffman et al. (1992) dans les réticulocytes de lapin. Ce
système permet une production de protéines très élaborées, mais constitue une lenteur de
production assez importante.
La solution la plus simple consiste en fait à utiliser les cellules procaryotes, notamment
E. coli. Il faut cependant prendre en compte tous les paramètres décrits précédemment
concernant les problèmes de solubilisation et d’agrégation des protéines produites.
La formation des corps d’inclusion reste un obstacle très important à la production de
protéines recombinantes. Les corps d’inclusion, comme expliqué par Baneyx & Murajic
(2004), sont formés lorsque la protéine ne parvient pas à atteindre sa conformation native, ou
bien si elle n’est pas prise en charge par des chaperonnes, celle-ci a tendance à former ces
corps d’inclusion, ou bien à être dégradée. Un second facteur contribuant à la formation
d’agrégats ou de ces corps d’inclusion est le fait que la cellule procaryote est incapable
d’effectuer les modifications post-traductionnelles que la protéine requiert pour atteindre sa
conformation native. Par exemple, le potentiel réducteur du cytoplasme chez E. coli ne facilite
pas la formation de ponts disulfure dont dépend en partie la structure tertiaire des protéines.
Le cytoplasme ne contient pas de système propice à leur formation comme les protéines DsbA
et DsbB. Dans le cas de protéines sécrétoires, les résidus cystéines impliqués dans la
formation de ces ponts disulfure sont maintenus sous forme réduite durant leur transport par
les thioredoxines cytoplasmiques vers le périplasme. Là, les polypeptides se replient dans leur
forme native avec l’aide de foldases périplasmiques, les protéines Dsb (figure 2). DsbA
catalyse la formation de ponts disulfure ; DsbC catalyse l’isomérisation en cas d’anomalie